Purifiant l'ADN plasmidique des colonies bactériennes en utilisant le kit Qiagen Miniprep Kit

Je travaille du laboratoire de Mike Halen, Département de physiologie et de biophysique, Université de Californie, irv. Aujourd’hui, je vais vous montrer comment utiliser le collagène mini pour purifier l’ADN des bactéries. Je fais cela comme une étape d’une expérience de mutagénèse dirigée.

Après avoir obtenu le plasmide, je vais séquencer l’insert pour vérifier que les clones sélectionnés contiennent les mutations souhaitées. Avant de faire la mini-préparation, présentez brièvement ce que nous avons fait hier. Pour faire pousser des bactéries, j’ai d’abord besoin d’inoculer cinq millilitres A LB, dans des tubes individuels.

Et comme vous pouvez le voir, avant de mettre des bactéries dans le tube, la médiane est claire. Ensuite, j’utilise le PERS pour inoculer une seule colonie à partir d’une plaque airb et je change d’embout à chaque fois pour qu’il n’y ait pas de contamination. Ensuite, j’ai mis des tubes dans un shaker et j’ai utilisé 300 tr/min pour faire pousser pendant au moins huit heures et normalement nous pouvons le faire pendant la nuit.

Il y a trois tampons importants dans le kit de préparation du collagène mini. Il s’agit de P un, P deux et N trois. Normalement, on met P un à quatre degrés parce qu’il contient des ARN P deux, on le laisse à température ambiante et pour N trois et on le préva, juste avant l’expérience au bout de huit heures.

Comme vous pouvez le voir, le terre-plein central est maintenant trouble parce que des bactéries, des bactéries se développent à l’intérieur et je verrai cinq microlitres de média sur une autre plaque. Donc, une fois que j’ai vérifié les clones, je peux revenir et directement aux bactéries et je n’ai pas besoin de faire une autre transformation. Après avoir fait tourner le terre-plein, vous pouvez voir un joli copain bactérien au fond du tube et nous retirerons le supat dans de l’eau de Javel afin qu’il n’y ait aucune contamination de l’environnement et que le palais soit toujours là.

Maintenant, j’ai le tampon P un et aux palais des bactéries tampon. Le premier est un tampon de remise en suspension pour resp les bactéries. Et maintenant, je vais acheminer la solution de haut en bas jusqu’à l’endroit où mélanger les bactéries avec le tampon.

À ce stade, vous ne voulez pas voir de palette de bactéries dans la solution. Maintenant, je vais transférer la bactérie resus bender dans un nouveau tube d’appol. J’étiquette toujours mes tubes pour pouvoir les tromper et savoir quelle solution provient de quel clone.

Maintenant, j’ai mangé le tampon P deux dans chaque tube et le tampon P deux est un tampon de lyse pour lyser les bactéries. Après avoir pris le tampon P deux, vous pouvez voir que la solution n’est toujours pas claire. Maintenant, je suis en train d’inverser tous les tubes plusieurs fois pour que la solution se mélange bien.

Et maintenant, vous pouvez voir que la solution devient claire. Maintenant, I a le tampon N trois et à chaque tampon de tube M trois est le tampon de neutralisation. Une fois que j’ai le tampon N trois, je vois immédiatement la précipitation des protéines, mais je vais quand même les inverser plusieurs fois pour bien mélanger la solution.

Après avoir bien mélangé la solution. Voici à quoi cela devrait ressembler après avoir aidé dans le tampon et trois. Maintenant, je vais utiliser le sge pour faire tourner la précipitation des protéines pendant la centrifugation pendant 10 minutes, j’ai assemblé un Cal VAC six s.

J’assemble toutes les pièces dans l’ordre, puis je les connecte à un système de vide. Maintenant, j’aide l’aide à la préparation du cal, la sangle au collecteur. Aujourd’hui, nous n’en ferons qu’un seul donc je bloque ou d’autres emplacements.

Nous avons donc un bon vide. Comme vous pouvez le voir, j’ai étiqueté la sangle en fonction de mes tubes et une fois que j’allume l’aspirateur, j’ai un bon vide. D’accord, après avoir fait tourner le tube, vous pouvez voir le copain protéique au fond et l’ADN devrait toujours se dissoudre dans le supnatant.

Maintenant, notre transfert, le sup supnatant, qui contient de l’ADN vers les bandelettes de préparation des vaches que je devrais mentionner, nous devons toujours passer aux pointes et éviter la contamination croisée. Maintenant, j’allume l’aspirateur. Maintenant, j’éteins l’aspirateur et j’aide le tampon PB à laver la bande, qui contient actuellement de l’ADN dans le filtre.

Maintenant, j’aide la solution PB sur la bande pour la laver et les bandes contiennent toujours de l’ADN dans le filtre. Cette fois, je n’ai pas besoin de changer les pointes si je ne touche pas la bande. Maintenant, j’ai le tampon p sur la bande de la même manière que je l’ai fait pour le tampon pb.

Et je le ferai deux fois après avoir allumé l’aspirateur. Comme vous pouvez le voir, la solution P passe actuellement à travers la bande et nous laisserons le vide allumé pendant encore cinq minutes pour nous assurer que le filtre sera très sec Après cinq minutes de vide, sortez la sangle de la boîte, puis enveloppez-la avec Kim wep. Frappez-le contre la table pour retirer le résidu de tampon P.

Et maintenant, vous pouvez voir qu’il n’y a pas beaucoup de couvercle de goutte de tampon P et que l’ADN devrait toujours être dans le filtre. Voici les micro tubes collecteurs. Je l’ai étiqueté en fonction de la bande.

Maintenant, j’ouvre l’aspirateur de voiture et je le réassemble avec les microtubes de collection et je m’assure que la sangle correspond aux micro-tubes. Voici à quoi devrait ressembler le collecteur à l’heure actuelle. Voici un aperçu du collecteur d’aspirateur, qui est préparé pour éluer l’ADN de la bandelette vers le microtube.

La bande est sur le dessus et le tube est juste en dessous, étiqueté de la même manière. Maintenant, soit de l’eau stérile dans la bandelette sans vide et laissez-la reposer pendant une minute. Cette fois-ci, lorsque le vide est long, comme vous pouvez le voir, l’eau passe à travers la bande et pénètre dans les microtubes collecteurs.

L’eau contient l’ADN. Je laisse également l’aspirateur allumé pendant un moment pour m’assurer que toute l’eau sera recueillie. Voici les microtubes de collecte avec la solution d’ADN après l’étape.

Bonjour, je viens de vous montrer comment utiliser le mini kit de préparation au calcium pour purifier l’NA des bactéries. Maintenant, je suis séquencé l’insert pour vérifier les bons clones et je devrais mentionner l’utilisation de cette méthode. L’année de l’ADN se situe généralement autour du microgramme.

Et bonne chance dans vos expériences. Merci d’avoir regardé.