Name: Todo el montaje utilizando In situ La hibridación de Enlace de Organismos y Biología Molecular (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-03-31T11:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 50 s
Description: Aprende la hibridación in situ en montaje completo para estudiar patrones de expresión génica en embriones de Danio rerio. Este método integra biología molecular y organismal en el aula universitaria.

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Los autores desean agradecer al Departamento de Biología de la Universidad de Syracuse y la Dra. Marilyn Kerr por su papel en la administración del curso de Vertebrados Biología comparativa. El laboratorio de Albertson es financiado por el subsidio R21DE019223 de los Institutos Nacionales de Salud / Instituto Nacional de Investigación Dental y Craneofacial, así como otorgar R01AG031922 de los Institutos Nacionales de Salud / Instituto Nacional del Envejecimiento.

1. Transformación del plásmido de cDNA de destino Parte I: Transformación del plásmido (Tiempo requerido: 3 horas más de incubación durante la noche) <ol><li> Caliente el caldo SOC de nutrientes en un baño de agua 42 ° C (500 l por reacción) </li><li> Descongelar las células competentes en hielo </li><li> Añadir 1 l de plásmido a 25 células competentes l </li><li> Coloque sobre hielo durante 20 minutos </li><li> Las células de choque térmico de 42 ° C baño de agua durante 45 segundos </li><li> Coloque inmediatamente las células en hielo durante 2 minutos </li><li> Añadir 500 l de 42 ° C de caldo de nutrientes a cada vial de células </li><li> Agite a 37 ° C durante 2 horas a 255 revoluciones por minuto (rpm) </li><li> Placa 75 l de mezcla de transformación en placas de agar Luria Bertani (LB) </li><li> Incubar las placas invertidas a 37 ° C durante la noche </li></ol> Parte II: E. coli Cultura (Tiempo requerido: 15 minutos más una noche de incubación) <ol><li> Para cada reacción, alícuota de 3 ml de caldo LB y 3 l de 50 mg / ml de ampicilina en un tubo de cultivo </li><li> Raspar una colonia de bacterias de la placa de agar y añadir a cada tubo de cultivo </li><li> Agitar los tubos de cultivo a 37 ° C a 255 rpm durante la noche </li></ol> Parte III: Preparación plásmido (Tiempo requerido: 1,5 horas) <ol><li> Aislar el plásmido de cultivos de una noche con el primer Mini Kit de 5 FastPlasmid (Catálogo # 2300000) </li><li> Para comprobar la presencia de plásmidos preparados, ejecute el ADN eluido del kit en un gel de 1% Tris-acetato-EDTA (TAE) teñido con bromuro de etidio </li></ol> 2. In Situ marcada con DIG síntesis de ARN sonda Parte I: Linealización del plásmido (Tiempo requerido: 2.5 horas) <ol><li> En un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml, se combinan: <table border="1"><tbody><tr><td> Preparado plásmido </td><td> 20 ml </td></tr><tr><td> * Restricción de enzimas </td><td> 2 mL </td></tr><tr><td> Buffer ** </td><td> 10 ml </td></tr><tr><td> 10 veces más albúmina de suero bovino (BSA) </td><td> 10 ml </td></tr><tr><td> Dietil pirocarbonato (DEPC) de agua </td><td> 58 ml </td></tr><tr><td></td><td> 100 ml </td></tr></tbody></table></li><li> Se incuba a 37 ° C durante 2 horas * Varía con el plásmido ** Varía con la enzima de restricción </li></ol> Parte II: Transcripción (Tiempo requerido: 3 horas) <ol><li> En un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml, se combinan: <table border="1"><tbody><tr><td> Lineal plásmido </td><td> 4 ml </td></tr><tr><td> Buffer 10X ** Transcripción </td><td> 4 ml </td></tr><tr><td> Digoxigenina Mix Etiqueta </td><td> 4 ml </td></tr><tr><td> Polimerasa </td><td> 2 mL </td></tr><tr><td> Inhibidor de la RNasa </td><td> 2 mL </td></tr><tr><td> DEPC agua </td><td> 24 ml </td></tr><tr><td></td><td> 40 ml </td></tr></tbody></table></li><li> Se incuba a 37 ° C durante 1 hora </li><li> Añadir 2 l * de la polimerasa </li><li> Se incuba a 37 ° C durante 1 hora </li><li> Añadir 2 l de DNasa </li><li> Se incuba a 37 ° C durante 20 minutos * Varía con el plásmido ** Varía con la polimerasa </li></ol> Parte III: Precipitación (Tiempo requerido: 5 minutos más 2 horas de incubación durante la noche, una hora para centrifugar y resuspender) <ol><li> Agregar 4 l de 0,2 M EDTA </li><li> Añadir 5 l de cloruro de litio 4M </li><li> Añadir 150 ml de hielo frío etanol al 100% </li><li> Se incuba a 80 ° C durante 2 horas a la noche a la mañana </li><li> Centrifugar a 14.000 rpm durante 30 minutos a 4 ° C, se decanta el sobrenadante de distancia </li><li> Seco en pelets durante 7 minutos </li><li> Vuelva a suspender en 20 l de agua DEPC </li><li> Se incuba a 37 ° C durante 5 minutos </li></ol> Parte IV: Fraccionamiento - Realizar sólo si el tamaño de la sonda es mayor de 0,6 kb (Tiempo requerido: Varía según el tamaño de la sonda, por lo general no más de 20 minutos) <ol><li> En un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml, se combinan: <table border="1"><tbody><tr><td> Sonda de ARN </td><td> 20 ml </td></tr><tr><td> DEPC agua </td><td> 12 ml </td></tr><tr><td> Bicarbonato de Sodio </td><td> 4 ml </td></tr><tr><td> Carbonato de Sodio </td><td> 4 ml </td></tr><tr><td></td><td> 40 ml </td></tr></tbody></table></li><li> Incubar en un baño de agua a 60 º C. La base del tiempo de incubación en la ecuación: Tiempo (min) = (a partir kb - deseado kb) / (0.11 x kb x partida deseado kb) Tamaño medio deseado = 0,6 kb </li></ol> Parte V: La precipitación final (Tiempo requerido: 5 minnutos más de 2 horas de incubación durante la noche, una hora para centrifugar y resuspender, 1 hora por electroforesis en gel) <ol><li> Añadir 40 l de agua DEPC </li><li> Añadir 8 Acetato de Sodio l </li><li> Añadir 1,04 l de ácido acético glacial </li><li> Añadir 240 l de hielo frío etanol al 100% </li><li> Se incuba a 80 ° C durante 2 horas a la noche a la mañana </li><li> Centrifugar a 14.000 rpm durante 30 minutos a 4 ° C, se decanta el sobrenadante de distancia </li><li> Seco en pelets durante 7 minutos </li><li> Vuelva a suspender en 20 l de agua DEPC </li><li> Vortex para mezclar </li><li> Para comprobar la presencia de riboprobe, ejecutar la solución re-suspendido en un gel teñido 1% TAE con bromuro de etidio </li></ol> 3. Todo el montaje hibridación in situ Parte I: La fijación de embriones y la digestión de proteinasa K (Tiempo requerido: Fijar horas de la noche, más 4 al día siguiente para el almacenamiento, 2,5 horas de almacenamiento a la Parte II) <ol><li> Recoger etapas embriones de pez cebra y fijar en 4% paraformaldehido (PFA) durante la noche a 4 ° C </li><li> Lavado de embriones fija en tampón fosfato salino que contiene 0,1% de Tween-20 (PBST) tres veces durante 10 minutos cada uno </li><li> Para garantizar que la exposición de los embriones a los reactivos experimentales, los embriones de forma manual dechorionate (si es necesario) con unas pinzas de punta fina </li><li> Deshidratar embriones por lavado en una serie gradual de 25% y 50% de metanol en PBST durante una hora cada lavado, a continuación, almacenar en el 100% de metanol a -20 ° C </li><li> Cuando esté listo para usar, rehidratar embriones en PBST por el lavado en un 50% (2 veces) y el 25% (1 vez) de metanol en PBST durante 10 minutos cada uno. Finalmente lavar dos veces durante 10 minutos cada uno en el 100% PBST. Fecha exacta no es importante para los lavados con PBST / metanol </li><li> Embriones cloro en una solución de peróxido de hidrógeno al 10% en PBST, si es necesario, para eliminar los pigmentos oscuros. Embriones se incuban en una solución de peróxido de hidrógeno durante 10-20 minutos, dependiendo de la edad del embrión, y la tapa del tubo de microcentrífuga deben permanecer abiertas para evitar la acumulación de presión de aire </li><li> Embriones digerir con 50 mg / ml de proteinasa K diluido 1:5000 en PBST durante 3-15 minutos, dependiendo de la edad del embrión </li><li> Fijar de nuevo los embriones en el 4% PFA durante 30 minutos y luego lavar 3 veces en PBST durante 5 minutos cada uno </li></ol> Parte II: La hibridación de ribosondas (Tiempo requerido: 3 horas y durante la noche para la hibridación, 1,5 horas del día siguiente a la Parte III) <ol start="9"><li> Prehybridize embriones con solución de prehibridación (PHS) en un horno precalentado a 70 ° C baño de agua durante 2-3 horas </li><li> Quitar PHS, se añaden 0,5 ml solución de hibridación y 1,5 l previamente sintetizadas riboprobes digoxigenina etiquetados, se incuba a 70 ° C durante la noche. La temperatura puede variar dentro de unos pocos grados en función del objetivo riboprobe </li><li> Al día siguiente, lave los embriones a 70 ° C en soluciones graduales de 75%, 50% y el 25% de PHS de citrato de sodio 2 veces con solución salina (SSC) de 10 minutos cada uno, luego se lava en 0,2 X SSC durante 30 minutos a 68 ° C </li><li> Lave en tampón de ácido maleico (MAB) 2 veces durante 10 minutos cada una a temperatura ambiente </li></ol> Parte III: anti-digoxigenina (α-DIG) incubación del anticuerpo (Tiempo requerido: 3 horas y durante la noche para bloquear, 2,5 horas del día siguiente a la Parte IV) <ol start="13"><li> La transferencia de embriones en una placa de 12 pocillos </li><li> Bloque de pre-embriones en una solución de 2.1 ml de bloqueo por lo menos 3 horas a temperatura ambiente </li><li> Al mismo tiempo, antes de bloquear los anticuerpos mediante la preparación de un segundo volumen de la solución de bloqueo y la dilución 1:2000 del anticuerpo anti-digoxigenina en esta solución </li><li> Eliminar pre-y agrega 1-2 ml pre-bloqueado α-DIG solución, incubar durante la noche a 4 ° C </li><li> Al día siguiente, lave los embriones en el MAB. Permitir que los embriones se incuban en el MAB durante 5 minutos, luego realizar los cambios de tampón y se incuba durante dos de 10 minutos, un minuto 30 y un intervalo de 60 minutos. Fecha exacta no es necesario </li><li> Lavado de embriones 3 veces durante 5 minutos en cada una de fosfatasa alcalina (AP) tampón </li></ol> Parte IV: La tinción y el procesamiento final (Tiempo requerido: 1 hora o toda la noche para la tinción, dependiendo de la riboprobe utilizados, 4 horas a partir de lavados de glicerol, 06.10 horas por lavado de glicerol, puede ser almacenado en glicerol) <ol start="19"><li> Agregar 1.2 ml de solución colorante a los embriones, envolver en papel de la placa y comprobar manchas a intervalos regulares (cada 20 minutos) hasta que la tinción es suficiente </li><li> Lavado de embriones con PBST dos veces durante 5 minutos cada uno para detener la reacción de tinción </li><li> Deshidratar embriones con 10 minutos se lava en el 25% (1 vez) y el 50% (2 veces) de metanol en PBST, luego en el 100% de metanol, para eliminar manchas de fondo </li><li> Permita que los embriones se incuban en metanol al 100% por lo menos 2 horas a temperatura ambiente </li><li> Rehidratar en PBST con 10 minutos se lava en el 50% (2 veces) y el 25% (1 vez) de metanol en PBST, luego lave en el 100% PBST 2 veces </li><li> Transferencia e manchadombryos a una solución de glicerol al 80% en PBST, utilizando una serie gradual de lava, y se almacenan a 4 ° C. </li></ol> Recetas: <ul><li> Placas de agar LB-10 g de agar LB + 250 ml de agua destilada, autoclave, cuando están frías al tacto añadir 250 l de ampicilina, vierta solución caliente 15-20 ml en cada placa de Petri, permiten agar para solidificar </li><li> Caldo de LB-12.5 g de caldo de LB + 200 ml de agua destilada, autoclave, deje que se enfríe antes de su uso </li><li> 1% TAE gel de agarosa 0,4 g, 40 ml de 1X TAE, 2 l de bromuro de etidio; carga de 7 l plásmido (plásmido de transformación de la meta de ADNc) o 3 y 4 riboprobe l l de agua DEPC (In situ Síntesis marcada con DIG sonda de ARN) + un colorante de carga l, 5 l escalera del ADN </li><li> Prehibridación solución-formamida al 50%, 5X SSC, 9,2 mm ácido cítrico, el 1% de Tween-20 </li><li> Hibridación solución de prehibridación solución más 500 mg / ml tRNA y 50 ug / ml de heparina </li><li> MAB-100mm ácido maleico, 150 mM NaCl, 0,2 M NaOH, 0,1% Tween-20, el pH a 7.5 </li><li> Solución de bloqueo-3 partes del MAB, una parte del 10% reactivo Boehringer bloqueo en el MAB, un calor parte desactivado cordero suero </li><li> AP-buffer 60 mM Tris-HCl pH 9,5, 60 mM NaCl, 30 mM MgCl 2, 0,1% Tween-20 </li><li> Solución-5-Bromo-4-cloro-3-indolil tinción fosfato (BCIP) y nitro azul tetrazolio (NBT) en tampón AP </li></ul> 4. Los resultados representativos Cuando se realiza correctamente, la reacción entre el NBT, BCIP y fosfatasa alcalina se forma un precipitado violeta que deben aparecer en el embrión del pez cebra como una mancha púrpura. Riboprobes debe ser previamente sintetizada a partir de cDNA correspondiente al gen de interés. Por lo tanto, se puede concluir cualquier mancha visualizada representa las áreas del pez cebra en el que ha sido el gen de interés transcribir en esta etapa de desarrollo en particular. A los efectos de este curso, riboprobes se sintetizaron a partir aldh1a2 (antes RALDH2; Begemann et al, 2001;. Figura 1); fgf8a (Reifers et al, 1998;. Figura 2); deltaC (Oates y otros, 2005.) MyoD1 (Weinberg et al, 1996.) shha (. Krauss et al, 1993), pax2a (Brand et al, 1996;. Figura 3) y myl7 (antes cmlc2;. Yelon et al, 1999) cDNA. La tinción se espera en la línea media y en las estructuras anatómicas como las somitas, tailbud, miotoma, el cerebro y el corazón. Mutantes Ace/fgf8a se espera que tengan defectos de muchas de estas estructuras. La tinción se visualiza fácilmente usando un microscopio de disección estándar. Fuentes adicionales contienen más información y resolución de problemas en el deseo de técnicas similares a las descritas aquí (Clark, 2003;. D'Costa et al, 2009; Schmoldt et al, 2009;. Schoenwolf, 2009). <img src="/files/ftp_upload/2533/2533fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Un embrión de pez cebra 24 horas después de la fecundación, que se ha hibridado con riboprobes específicas para aldh1a2. Tinción específica se puede ver en los ojos, la parte posterior del cerebro, aleta pectoral brote primordios, y somitas. Anterior es la parte superior, posterior está en el fondo. <img src="/files/ftp_upload/2533/2533fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Un embrión de pez cebra en la etapa 13 somite de desarrollo que se ha hibridado con una sonda específica para fgf8a. Tinción específica se ve en el telencéfalo, diencéfalo dorsal, la cobertura del cerebro medio-hindbrain, somitas, y tailbud. Ventral está a la izquierda, dorsal está a la derecha. <img src="/files/ftp_upload/2533/2533fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. A 22 horas después de la fecundación de embriones de pez cebra que se ha hibridado con una específica para riboprobe pax2a, un marcador robusto útil para visualizar el sistema nervioso. Tinción específica se puede ver en la cisura coroidea, la cobertura del cerebro medio-hindbrain, vesícula ótica, y las neuronas de médula espinal. Vista dorsal con el anterior a la izquierda.

<ol><li>Albertson, R. C., Yelick, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Roles+for+fgf8+signaling+in+left-right+patterning+of+the+visceral+organs+and+craniofacial+skeleton%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Roles for fgf8 signaling in left-right patterning of the visceral organs and craniofacial skeleton.</a> Dev. Biol. 283, 310-321 (2005).</li>
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<li>Brand, M., Heisenberg, C. P., Jiang, Y. J., Beuchle, D., Lun, K., Furutani-Seiki, M., Granato, M., Haffter, P., Hammerschmidt, M., Kane, D. A., Kelsh, R. N., Mullins, M. C., Odenthal, J., van Eeden, F. J., Kane, D. A., Nüsslein-Volhard, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+in+zebrafish+genes+affecting+the+formation+of+the+boundary+between+midbrain+and+hindbrain%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Mutations in zebrafish genes affecting the formation of the boundary between midbrain and hindbrain.</a> Development. 123, 179-190 (1996).</li>
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</ol>

Deseo fue utilizado en un curso de laboratorio de Biología de Vertebrados comparativa para ayudar a los estudiantes a entender el papel de la genética en el desarrollo anatómico a través de la visualización de patrones de expresión génica conocida. Para la primera parte del curso, los estudiantes realizaron disecciones en los organismos que representan a varios taxones cordados diferentes, lo que les permite suficiente tiempo para estudiar, comprender, comparar, y la anatomía de vertebrados contraste. Como introducción a la segunda parte del curso, los estudiantes se les dio una conferencia formal que describe el desarrollo del pez cebra y la anatomía. Los métodos y los resultados previstos del experimento DESEA también fueron discutidos. Los estudiantes se les dio el pez cebra vive en somitogenesis y prim-6 etapas de desarrollo, ya las 2 y 5 días después de la fertilización (dpf) para examinarla bajo el microscopio de disección. Esto fue a dar a los estudiantes una mejor comprensión de lo que parece embriones de pez cebra y los tipos de cambios morfológicos que ocurren durante la ontogenia. En la sesión de laboratorio siguiente, los estudiantes recibieron embriones de pez cebra en el que deseo se había realizado previamente. Se les pidió que estudiar y describir los patrones de expresión genética para cada gen de interés (riboprobe utilizado). Embriones utilizados para WISH se derivan de las uniones entre miembros de una línea de ace/fgf8a heterocigotos. Sobre la base de la herencia mendeliana, el 25% de los embriones de los apareamientos ace/fgf8a se espera que sea homocigotos mutantes y exhibir los defectos de muchas de las estructuras anatómicas se centró en este curso. Basándose en los informes publicados y observaciones no publicadas en el laboratorio de Albertson, defectos en el cerebro y el corazón de bucle incorrecto se esperaba, así como defectos en las somitas (Brand et al, 1996;. Albertson y Yelick, 2005; observaciones personales). Los estudiantes se les pidió que examinar todas las muestras, de tipo salvaje (animales heterocigotos se distinguen de sus hermanos de tipo salvaje en las primeras etapas de desarrollo) y homocigotos mutantes, para cada patrón de expresión génica presentados. Luego se les pidió a escribir informes de laboratorio que describe sus resultados, y en base a sus conocimientos de anatomía y genética, ¿cómo la expresión del gen defectuoso puede haber precipitado malformaciones anatómicas. Los estudiantes parecían recibir este ejercicio de laboratorio con el entusiasmo y la curiosidad. La mayoría nunca habían utilizado deseo antes y estaban muy interesados ​​en esta parte del curso. Estudiantes que se encuentren los diferentes patrones de expresión genética en los embriones de pez cebra intrigante, algunos incluso se describen los patrones de tinción visualizarse mediante la asociación con conocidos diseños y símbolos, como una cara sonriente. Los informes de laboratorio resultantes mostraron que los estudiantes tenían un conocimiento general del protocolo de deseo y la expresión de genes en estructuras anatómicas específicas. Los estudiantes también fueron requeridos para entender las funciones específicas de los genes estudiados utilizando desee durante el tiempo de laboratorio (Stickney y otros, 2000;. Huelsken et al, 2002;. Gita-Loganathan et al, 2008a;.. Gita-Loganathan et al, 2008b ). Era evidente sin embargo, que algunos estudiantes tenían un conocimiento limitado de fondo de las vías de señalización y los genes de interés. Más información acerca de estos conceptos en el deseo de charla introductoria puede ser una adición bienvenida a la utilización de deseo en el futuro cursos de Biología Comparada de Vertebrados. Dado que el protocolo generalmente toma cuatro días consecutivos, dependiendo del horario del curso, los alumnos sólo pueden ser capaces de completar una parte del experimento en la clase y el profesor debe ser responsable por el resto. En nuestra clase de Biología de Vertebrados comparativo, los alumnos de las reacciones de tinción en el laboratorio, mientras que el Asistente de Enseñanza realizado todos los pasos anteriores. Si se prefiere que los estudiantes realizan WISH en clase, el protocolo puede ser dividida en sub-unidades que se pueden realizar en varias sesiones de laboratorio, en función del tiempo de la clase. Si no es factible para los estudiantes para llevar a cabo todo el protocolo, ya que fue aquí, debido a la reunión de laboratorio una vez por semana, los estudiantes pueden agregar la solución de tinción en el comienzo de la clase y, en función de la riboprobe utilizados, tienen la coloración completa dentro de una hora. El tiempo necesario para que la mancha de desarrollar varía mucho con cada riboprobe y una variedad de condiciones experimentales, y debe ser determinado antes de la clase. Cabe destacar que, si los alumnos sólo será el desarrollo de la mancha en el laboratorio, los instructores serán responsables de todos los pasos anteriores, lo que requerirá mucho tiempo y esfuerzo fuera de las aulas. Si lo desea, una alternativa más corta que deseen podrían ser inmunohistoquímica, con las etiquetas de anticuerpos para visualizar la localización de proteínas, sin embargo en este momento, el pez cebra anticuerpos específicos para los genes de desarrollo no están disponibles. Otra opción sería realizar deseo en diferentes especies de vertebrados unº que los estudiantes comparar los patrones de expresión de los mismos genes en diferentes organismos (Pizard et al, 2004;. Aramaki et al, 2007;. emergentes organismos modelo, de 2008; emergentes organismos modelo, 2010). El objetivo general del uso de deseo en un curso de Biología de Vertebrados comparativo era demostrar a los estudiantes como técnicas de biología molecular se utilizan para estudiar el desarrollo anatómico. Es también una oportunidad para que los estudiantes especular acerca de cómo modificar la expresión de genes puede conducir no sólo a malformaciones en el desarrollo, sino también para el cambio evolutivo. Formalizada como la biología evolutiva del desarrollo (a menudo denominado como &quot;evo-devo&quot;), este campo de rápido crecimiento de estudio tiene como objetivo vincular el genotipo y el fenotipo a través del desarrollo, y para dilucidar las bases potenciales mecánica del cambio evolutivo. Con el auge de este campo, más ecólogos, biólogos de organismos, y los fisiólogos están empleando técnicas moleculares en sus investigaciones. Nosotros sostenemos que el uso del deseo en un curso de Vertebrados Biología comparativa le ayudará a mantener el plan de estudios al día con los avances tecnológicos actuales y conceptuales en la investigación, y para facilitar un mejor alineamiento horizontal de los cursos de nivel superior mediante la combinación de la biología subcampos biológica. Por otra parte, este enfoque integrador proporcionará a los estudiantes la oportunidad de aprender una variedad de técnicas de investigación biológica en un curso, lo que lleva a una educación más diversificada y la promoción de la futura investigación científica interdisciplinaria.

<ul><li> Autoclave </li><li> Microcentrífuga </li><li> 37 ° C incubadora (con agitador) </li><li> 4 ° C de microcentrífuga </li><li> Baño de agua </li><li> Vórtice </li><li> Aparato de electroforesis en gel </li><li> Congelador a -20 ° C </li><li> -80 ° C congelador </li><li> Rocker / agitador </li><li> 4 ° C refrigerador </li><li> Microscopio de disección (de preferencia con una pantalla de la enseñanza o la cámara) </li></ul>

todo el montaje utilizando in situ la hibridación de enlace de organismos y biología molecular

Using Whole Mount in situ Hybridization to Link Molecular and Organismal Biology

Todo el montaje hibridación in situ (WISH) es una técnica común en los laboratorios de biología molecular para estudiar la expresión génica mediante la localización de las transcripciones de ARNm específicos dentro de toda muestra de montaje. Esta técnica (adaptado de Albertson y Yelick, 2005) fue utilizado en un nivel superior de pregrado en el aula de laboratorio de Biología de Vertebrados comparativa en la Universidad de Syracuse. Los dos primeros tercios del curso de laboratorio de Biología de Vertebrados comparativo dio a los estudiantes la oportunidad de estudiar la embriología y anatomía de los organismos que representan a varios taxones diferentes cordados principalmente a través de disecciones tradicionales y el uso de modelos. La parte final del curso participan un enfoque innovador para la enseñanza de la anatomía a través de la observación del desarrollo de los vertebrados que emplean técnicas moleculares en la que desean se llevó a cabo en embriones de pez cebra. Un crecimiento de fibroblastos heterocigotos factor 8 un (fgf8a) mutante línea, as, se utilizó. Debido a la herencia mendeliana, as intercrosses tipo producido salvajes, heterocigotos y homocigotos mutantes ace/fgf8a en una proporción de 1:2:1. Sondas de ARN con patrones de expresión se conoce en la línea media y en el desarrollo de las estructuras anatómicas, como el corazón, somitas, tailbud, miotoma, y ​​el cerebro se utilizaron. WISH se realizó con el pez cebra en el 13 y somite etapas prim-6, con los estudiantes de realizar la reacción de tinción en la clase. El estudio de los embriones de pez cebra en diferentes etapas de desarrollo dio a los estudiantes la capacidad de observar cómo estas estructuras anatómicas cambiado en la ontogenia. Además, algunos mutantes ace/fgf8a muestra bucle corazón inadecuado, y defectos en los somitas y el desarrollo del cerebro. Los estudiantes en esta práctica observada el normal desarrollo de diversos sistemas de órganos con la anatomía externa, así como patrones de expresión génica. También se identifican y describen los embriones mostrando un desarrollo inadecuado anatómica y la expresión de genes (es decir, mutantes putativos). Para los instructores de las instituciones que aún no poseen el equipo necesario o cuando los fondos para el laboratorio y la innovación curricular son limitados, el costo financiero de los reactivos y los aparatos puede ser un factor a considerar, así como el tiempo y el esfuerzo necesario por parte de la instructor independientemente de la configuración. Sin embargo, sostenemos que el uso de deseo en este tipo de salón de clases de laboratorio puede proporcionar un vínculo importante entre la genética del desarrollo y la anatomía. A medida que avanza la tecnología y la capacidad para estudiar el desarrollo de organismos en el nivel molecular se hace más fácil, más barato y cada vez más popular, muchos biólogos evolucionistas, los ecologistas, y los fisiólogos están recurriendo a estrategias de investigación en el campo de la biología molecular. WISH utilizando en una clase de laboratorio de Biología de Vertebrados comparativo es un ejemplo de cómo las moléculas y la anatomía pueden converger en un solo curso. Esto le da a los estudiantes universitarios de nivel superior la oportunidad de practicar las técnicas modernas de investigación biológica, lo que lleva a una educación más diversificada y la promoción de la futura investigación científica interdisciplinaria.

Todo el montaje<em&gt; In situ</emHibridación&gt; (WISH) fue utilizado en un nivel superior de grado comparativo curso de Biología de Vertebrados, además de vertebrados disecciones. Esto dio a los estudiantes la oportunidad de estudiar los patrones de expresión génica, así como anatomía, que une el estudio de la biología molecular y organismal dentro de un curso.

Todo el montaje utilizando In situ La hibridación de Enlace de Organismos y Biología Molecular

La hibridación in situ en montajes completos (WISH, por sus siglas en inglés) es una técnica común en los laboratorios de biología molecular que se utiliza para estudiar la expresión génica mediante la localización de...

El objetivo general de este procedimiento es observar los patrones de expresión génica en embriones de pez cebra durante etapas específicas del desarrollo. Esto se logra primero hibridando una sonda de riboprobes antisentido marcada con digoxigenina al ARNm de interés. El segundo paso consiste en detectar la sonda de riboprobes.Se utiliza un anticuerpo contra doxiciclina que está conjugado con una enzima fosfatasa alcalina. El tercer paso del procedimiento es la tinción mediante la adición de NBT y BCIP, que reaccionan con la enzima fosfatasa alcalina para producir un precipitado insoluble de color púrpura. El paso final del procedimiento consiste en incubar embriones suficientemente teñidos en metanol para reducir la tinción no específica.En última instancia, se pueden obtener resultados que muestren patrones de expresión génica en embriones completos de pez cebra en etapas específicas del desarrollo utilizando la hibridación in situ en montaje completo. La principal ventaja de esta técnica frente a métodos existentes, como las demostraciones tradicionales en clase de histología o disecciones, es que brinda a los estudiantes la oportunidad de construir puentes conceptuales entre la biología molecular y las tendencias en el desarrollo y la evolución de los organismos, proporcionando así una experiencia verdaderamente integradora. Aunque estos métodos se han utilizado tradicionalmente para estudiar el desarrollo de unos pocos organismos modelo, pueden aplicarse fácilmente a otros organismos no modelo para comprender la conservación de las vías del desarrollo a través de los taxones vertebrados, así como los puntos en los que estas vías divergen, dando lugar a novedades evolutivas.Este método puede ser poco familiar para los estudiantes de pregrado, por lo que algunos podrían tener dificultades al principio, pero aprenderlo les será muy útil en sus experiencias de investigación de pregrado y en cursos avanzados. Para comenzar este procedimiento, utilice una pipeta de transferencia para trasladar aproximadamente 50 embriones de pez cebra a un tubo microfugado. Retire el líquido en exceso y luego agregue mediante pipeta 1,5 mililitros de paraformaldehído al 4 % al tubo.Coloque el tubo de embriones en un agitador a temperatura ambiente durante la noche. A la mañana siguiente, retire el fijador y deséchelo. Añada 1,5 mililitros de solución de suero salino tamponado con fosfatos que contenga 0,1% de tween 20 a los embriones para lavarlos.Utilice pinzas de punta fina para recubrir manualmente los embriones si es necesario; use una pipeta de transferencia para colocar los embriones recubiertos en un tubo microfusión limpio. Luego, pipetee 1,5 mililitros de metanol al 25% y PBST en el tubo. Después de incubar durante una hora, aspire la mayor cantidad posible de esta solución sin perturbar los embriones.Luego, reemplace con 1,5 mililitros de metanol al 50% en PBST e incube durante un mínimo de una hora. Finalmente, reemplace con 1,5 mililitros de metanol al 100% y coloque a menos 20 grados Celsius. Los embriones pueden almacenarse en metanol a menos 20 grados Celsius.Cuando esté listo para usar, aspire el metanol del tubo y deseche la pipeta. Añada metanol al 50% en PBST al tubo e incube durante 10 minutos. Repita este paso, lave una segunda vez, luego aspire la solución y repita la incubación con metanol al 25% en PBST.Finalmente, lave dos veces durante 10 minutos cada vez con PBST al 100 %; prepare una solución de peróxido de hidrógeno al 10 % en PBST. Sumerja los embriones de pez cebra en esta solución a temperatura ambiente con la tapa del tubo microfuge abierta durante 10 a 20 minutos, dependiendo de la edad del embrión. Para eliminar cualquier pigmentación oscura, utilice una pipeta de transferencia para retirar y desechar la solución de peróxido de hidrógeno.Lave los embriones varias veces con 1,5 mililitros de PBST para detener la reacción. Diluya una solución stock de proteinasa K de 50 miligramos por mililitro en una proporción de uno a 5.000 en PBST. Normalmente, un microlitro de proteinasa K en 4,999 mililitros de PBST.Retire el PBST de los embriones. Con una pipeta de transferencia, deseche y agregue 1,5 mililitros de solución de proteinasa K en el tubo. Sumerja los embriones en la solución de proteinasa K a temperatura ambiente durante tres a 15 minutos, dependiendo de la edad de los embriones.Lave con PBST varias veces para detener la reacción. Luego elimine el PBST e inmerja los embriones en formaldehído al 4 % durante 30 minutos a temperatura ambiente para volver a fijarlos, retire el paraformaldehído usando una pipeta de transferencia y deseche. Añada 1,5 mililitros de PBST a los embriones y lave durante cinco minutos.Pipetee cuidadosamente el PBST del vial y deséchelo. Repita el lavado con otros dos volúmenes de PBST. A continuación, continúe con la hibridación de la sonda rip, caliente previamente el baño de agua a 70 grados Celsius y prepare la solución de prehibridación.Luego, utilice una pipeta de transferencia para eliminar y desechar el PBST. Sumerja los embriones en 0,5 mililitros de solución de prehibridación e incube en baño de agua a 70 grados Celsius durante dos a tres horas. Tenga cuidado de no perturbar los embriones.Aspire con pipeta la solución de prehibridación desde el tubo de microresiduos y deseche. Añada suavemente 0,5 mililitros de solución de hibridación al tubo. Luego agregue rápidamente doxigenina previamente sintetizada en ribo etiquetado.Se utilizan concentraciones de sonda ribosómica en el tubo del orden de un microgramo por mililitro. Incubar a 70 grados Celsius durante la noche. Al día siguiente, preparar soluciones de 75 %, 50 % y 25 % de PHS en dos veces salina citrato sódico, así como soluciones de dos veces SSC y 0,2 veces SSC.Caliente más soluciones en el baño de agua a 70 grados Celsius. Cuando las soluciones hayan alcanzado 70 grados Celsius, sáquelas del baño de agua. Luego aspire la solución de hibridación del tubo y deséchela.Añada 0,5 mililitros de cada solución tibia de P-H-S-S-S-C, incubando los embriones en cada solución durante 10 minutos a 70 grados Celsius. Finalmente, incube los embriones en la solución de 0,2 veces SSC a 68 grados Celsius durante 30 minutos. Aspire la solución de 0,2 veces SSC del tubo y deseche.Incube los embriones en 1,5 mililitros de tampón de ácido málico pH 7,5 a temperatura ambiente durante 10 minutos. Repita esto, lave una segunda vez. Prepare la solución de bloqueo según el protocolo escrito.Transfiera los embriones en MAB a cada pocillo de una placa de 12 pocillos. Retire el exceso de MAB y pipetee uno a dos mililitros de solución bloqueadora en cada uno.Incubar bien a temperatura ambiente con agitación durante al menos tres horas. Diluir el antígeno en el anticuerpo uno a 2000 en la solución de bloqueo restante. Incubar a temperatura ambiente durante al menos tres horas con agitación suave.Teniendo cuidado de no perturbar los embriones. Aspire con pipeta la solución de bloqueo de los pocillos de la placa y deséchela. Añada suavemente con pipeta la doxiciclina anti previamente preparada en solución de anticuerpo y de bloqueo a los pocillos e incube a cuatro grados Celsius durante la noche.Al día siguiente, lave los embriones con cinco cambios de 1,5 mililitros de tampón de ácido málico. Deje que los embriones se incuben en tampón de ácido málico durante cinco minutos. Primero, realice cambios de tampón e incube durante dos periodos de 10 minutos.Un intervalo de 30 minutos y uno de 60 minutos. Aspire el último lavado del tampón de ácido meicónico de los pocillos y deseche la pipeta. Añada de 1,5 a dos mililitros de tampón de fosfatasa alcalina en los pocillos e incube durante cinco minutos.Repita este proceso dos veces. Retire el tampón de fosfatasa alcalina y agregue de 1,5 a dos mililitros de solución de tinción a los pocillos. Envuelva toda la placa con papel de aluminio para protegerla de la luz y agite suavemente a intervalos de 20 minutos.Detenga la agitación y observe los embriones bajo el microscopio estereoscópico para verificar si se ha logrado una tinción suficiente. Una vez que sea visible una tinción adecuada, aspire con pipeta la solución de tinción de los pocillos y deséchela. Reemplácela con PBST para detener la reacción de tinción.Repita el proceso de lavado con otro volumen de PBST, aspire el PBST de los pocillos y deseche para deshidratar los embriones. Añada mediante pipeta de 1,5 a 2 mililitros de metanol al 25 % en PBST en los pocillos e incube durante 10 minutos. Repita el proceso dos veces con metanol al 50 % en PBST durante 10 minutos cada lavado. A continuación, transfiera los embriones a metanol al 100 % e incube durante al menos dos horas para reducir la tinción no específica.Tras la incubación, aspire el metanol de los pocillos y deseche para rehidratar los embriones. Lave dos veces con metanol al 50% en PBST, seguido de metanol al 25% en PBST durante 10 minutos cada vez. A continuación, lave dos veces con PBST al 100% durante 10 minutos cada vez.Finalmente, transfiera los embriones teñidos a una solución de glicerol al 80 % en PBST mediante una serie gradual de lavados y almacénelos a cuatro grados Celsius hasta la observación, cuando se realiza correctamente. La expresión del gen de interés se indica por la aparición de una tinción púrpura en el embrión de pez cebra. Esta imagen muestra un embrión de pez cebra 24 horas después de la individualización, que ha sido hibridado con sondas RIBA específicas para AAL DH uno A dos; se puede observar tinción específica en los ojos, cerebro posterior, yema de aleta pectoral, ria y somitas.Esta imagen muestra un embrión de pez cebra en la etapa de 13 somitas de desarrollo que ha sido hibridado con una sonda específica para FGF eight A. En este caso, se observa tinción específica en la línea media, diéncefalo dorsal, mesencéfalo, límite entre el cerebro posterior y el cerebro anterior, somitas y yema de la cola. Esta imagen muestra un embrión de pez cebra a las 22 horas post-fecundación que ha sido hibridado con la sonda específica para PAX two A. Un marcador robusto útil para visualizar el sistema nervioso.Se puede observar una tinción específica en la hendidura coroidea, el mesencéfalo, el límite entre encéfalo medio y posterior, la vesícula ótica y las neuronas de la médula espinal una vez dominada la técnica. Esta técnica puede modificarse para realizarse en varias sesiones de laboratorio según el horario del curso. Es posible que el instructor deba invertir tiempo y esfuerzo fuera del aula.Después de ver este video, esperamos que se sienta más cómodo con la idea de incorporar la hibridación de montaje completo y C dos en un laboratorio de pregrado. A medida que los estudiantes desarrollen estas habilidades, el conocimiento sobre esta técnica puede facilitar su transición a experiencias de investigación en divisiones superiores o a nivel de posgrado.

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Investigación

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Biology

Biología

Este video muestra a 2 colores montar toda la hibridación in situ, un método por el cual el patrón de expresión espacial y temporal de dos genes diferentes se pueden visualizar en embriones de pollo joven. Este método fue introducido originalmente por David Wilkinson, Henrique Domingos, Ingham Phil y David Ish-Horowicz.

Monte doble entero hibridación in situ de embriones de pollo temprano

Todo el montaje hibridación in situ es una de las técnicas más utilizadas en la biología del desarrollo. Aquí se presenta una alta resolución de doble fluorescente en el protocolo de hibridación in situ para analizar el patrón de expresión precisa de un solo gen y para determinar la superposición de los dominios de expresión de dos genes. Se incluye un yoduro de propidio nuclear tinción de contraste para destacar la organización del tejido.

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Una combinación de diferentes técnicas para maximizar la recogida de datos a partir de tejido de ratón se presenta.

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Se describe un montaje de todo el hibridación in situ procedimiento multi-objetivo cromogénico (MC-DESEO) en embriones de Drosophila intactos permitiendo la detección simultánea y específica de tres patrones de distribución de ARNm diferentes contrastando precipitados de color.

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Este artículo de vídeo detalla una sencilla metodología vivo que se puede utilizar para caracterizar de manera sistemática y eficiente los componentes de las vías de señalización complejos y las redes de regulación en muchos embriones de invertebrados en.

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