הכרומטין Assay immunoprecipitation עבור גנים ספציפיים רקמות באמצעות שלבים מוקדמים של עוברי עכברים

המטרה הכוללת של הליך זה היא לבודד עוברי עכבר E 8.5 לשימוש בבדיקות כרומטין, משקעים חיסוניים או שבבים. זה מושג על ידי בידוד תחילה של עוברי העכבר והכנת תרחיפי תאים בודדים. השלב השני של ההליך הוא הצלבה כימית של חלבונים הקשורים ל-DNA ל-DNA הגנומי, ולאחר מכן סוניקציה לפיצול ה-DNA.

השלב השלישי של ההליך הוא לזרז חיסון קומפלקסים של כרומטין חלבון ולבודד DNA מטוהר. השלב האחרון של ההליך הוא ניתוח ה-DNA המטוהר על ידי PCR קונבנציונאלי או על ידי PCR כמותי בזמן אמת. בסופו של דבר, ניתן להשיג תוצאות המראות אינטראקציות חלבון עם רצפים רגולטוריים של גנים ספציפיים להתמיינות במהלך התחלת תוכנית ההתמיינות ברקמות ואיברים מתפתחים.

סמסטר זה יכול לעזור לענות על שאלה טובה לגבי התחלת תוכנית התמיינות במהלך האמבריוגנזה באמצעות זיהוי גורמים רגולטוריים המקיימים אינטראקציה עם הרצפים הרגולטוריים של גן ספציפי להתמיינות כאשר הם הופכים לכשירים מבחינת שעתוק. כדי להתחיל בהליך זה, קרני הרחם מוסרות מעכבר שהוקרב ביום העוברי 8.5. על פי פרוטוקול מאושר, הטישו מונח בצלחת פטרי המכילה מדיה חתך טרי באמצעות מספריים.

חותכים כל אתר השתלה בנפרד ומניחים אותם בצלחת פטרי המכילה אמצעי דיסקציה טריים כדי למנוע עודף דם. בעזרת שמונת המלקחיים, הסר את שכבת הרחם מכל אתר השתלה כדי לחשוף את העוברים הבודדים באמצעות מלקחיים. בשלב זה של ההתפתחות, העוברים מוקפים בשק החלמון הקודקודי המגע עם רקמת הדאום, שק החלמון הקרביים ומי השפיר.

מי השפיר הם קרום שקוף הנמצא במגע ישיר עם העובר. שק החלמון הקרביים ממוקם בין מי השפיר לשק החלמון הקודקודי ומובחן בקלות ב-8.5 לאכול 9.5 עוברים על ידי נוכחות כלי דם בולטים המזינים את העובר. הסר כל עובר מהממברנות הסובבות אותו והעביר בנפרד לצלחת חדשה המכילה אמצעי דיסקציה כדי להסיר עודפי דם.

לאחר מכן העבירו כל עובר לצינור איינור של 1.5 מיליליטר המכיל 200 מיקרוליטר של חומר דיסקציה. הומוגניזציה של העובר המבודד מתחילה בתוספת של 200 מיקרוליטר קולגנאז. הקלד תמיסה שתיים לכל צינור עינור המכיל את העוברים.

יש לנער בעדינות דגימות בשייקר של 37 מעלות צלזיוס ב-100 סל"ד למשך 20 דקות. לאחר מכן השעו מחדש את הדגימות על ידי ליטוף כדי לשבש גושי תאים. החל את מתלה התאים על החלק העליון של מסננת תאים סטרילית בגודל 40 מיקרון המונחת על צינור RPH של 1.5 מיליליטר.

יש למרוח מיד 600 מיקרוליטר של טמפרטורת החדר X-D-P-B-S אחד על החלק העליון של מסננת התאים כדי להשלים את ההפרדה. לאחר שהמתלים סוננו, השליכו את צנטריפוגת מסננת התאים את הדגימות ב-4,000 גרם למשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס. לאחר הצנטריפוגה, השליכו את הסופרנטנטים ראוס.

תלו כל כדור במיליליטר אחד של טמפרטורת החדר X-D-P-B-S אחד. לאחר מכן צנטריפוגה את הדגימות ב -4, 000 גרם למשך דקה אחת בטמפרטורת החדר. לאחר השלכת החך בפעם השנייה, השעו מחדש כל חיך ב-200 מיקרוליטר של אמצעי חיתוך בטמפרטורת החדר קשרו את הכרומטין על ידי הוספת 5.6 מיקרוליטר של 37% פורמלדהיד לדגימות 200 מיקרוליטר לריכוז סופי של 1% פורמלדהיד.

דגירה של דגימות במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר לאחר הדגירה, צנטריפוגה של הדגימות ב-4,000 גרם למשך שלוש דקות בארבע מעלות צלזיוס והשליכו את הסופרנטנט. השעו מחדש את התאים בקור אחד X-D-P-B-S המכיל 80 מיקרוליטר למיליליטר, קוקטייל מעכב פרוטאז או PIC. לאחר מכן צנטריפוגה את הדגימות ב -4, 000 גרם למשך שלוש דקות בארבע מעלות צלזיוס.

לאחר השלכת הסופרנטנט, ניתן להקפיא את הדגימות במינוס 80 מעלות צלזיוס והן יציבות במשך מספר חודשים לפני הסוניקציה להפשיר את כדור התא הקפוא על קרח או להניח את הגלולה מהשלב הקודם על קרח. השעו מחדש את לוח התאים ב-100 מיקרוליטר של מאגר ליזה SDS בטמפרטורת החדר לאחר השעיית החייאה. מוסיפים 100 מיקרוליטר נוספים של מאגר ליזה SDS בטמפרטורת החדר והדגימה מושעה מחדש על ידי פיפטינג והיפוך.

דגרו את תרחיף התאים על קרח למשך 10 דקות. לאחר הדגירה, הגדר את הטור לגזירת ה- DNA הצולב בין 200 ל -500 זוגות בסיסים. בהדגמה זו נעשה שימוש בקרע ביולוגי DIO geno UCD 200.

סוניקטיבי את הדגימה המוקפת בתרחיץ קרח. אל תאפשר לו להתחמם מעל ארבע מעלות צלזיוס או להקפיא צנטריפוגה. דגימת הסוניקט ב-14,000 גרם למשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס.

העבירו את הסופרנטנט לתוך צינור DPH טרי שמצננים מראש על קרח. חלקו את הדגימה הסוניקטיבית למקסימום חמש מכסות. אחסן אליקוט אחד במינוס 20 מעלות צלזיוס כדי לשמור את הקלט שלו להיפוך הקישורים.

שלב לדלל את האליקוטים האחרים פי עשרה במאגר דילול שבב המכיל PIC טרי שנוסף במיקרוליטר אחד לכל 800 מיקרוליטר של מאגר. ראשית, קבע אילו מהירויות אוויריות ישמשו לניקוי מוקדם על סמך הנוגדן שישמש לחלבון בדיקת השבב. משתמשים כאן בחרוזים מכיוון שהנוגדן המשמש לשבב הוא כלבת.

נקה מראש את הסופרין המדולל על ידי הוספת 75 מיקרוליטר של 50% זרע סלמון, DNA וחלבון. מהירות אווירית דגרה ארבע מעלות צלזיוס עם סיבוב במשך שעה לאחר צנטריפוגת הדגירה של הדגימות ב-2,500 גרם למשך דקה אחת בארבע מעלות צלזיוס. העבירו את השכבות לצינור DPH חדש לפני קירור.

הוסף ארבעה מיקרוגרם של נוגדן לדגימה ל-Eloqua שנוקה מראש ודגירה למשך הלילה בארבע מעלות צלזיוס עם סיבוב. התחל בהוספת 60 מיקרוליטר של זרע הסלמון, חלבון DNA, תרחיף חרוזי אירוס לכל דגימה ודגיר בארבע מעלות צלזיוס עם סיבוב למשך שעה. צנטריפוגה את הדגימות ב-1000 גרם למשך דקה אחת בארבע מעלות צלזיוס.

בעקבות צנטריפוגה. הסר בזהירות את השכבות והשליך תוך שמירה על קומפלקס חרוזי חלבון ה- DNA על קרח. החייאה: השהה ושטוף את המשטחים כמתואר בפרוטוקול הכתוב עם מאגרים אחד עד ארבע.

כל שטיפה מורכבת מתקופת דגירה של חמש דקות עם סיבוב ואחריה צנטריפוגה ב-1000 גרם למשך דקה אחת והסרת הסופרנטנט לאחר הכביסה. הסר את קומפלקס נוגדני הכרומטין על ידי Resus השהיית קומפלקס חרוזי חלבון הכרומטין השטוף ב-250 מיקרוליטר של מאגר פליטה טרי שהוכן במרץ מערבולת כל דגימה למשך חמש שניות ולאחר מכן דגירה של הדגימות בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות עם סיבוב לאחר צנטריפוגה ב-2, 500 גרם למשך דקה אחת. בטמפרטורת החדר, העבירו כל פליטה לצינור eph חדש.

חזור על תהליך האלוציאן ושלב את האלואט עבור כל דגימה באותו צינור eph. כדי להפוך את הקישורים הצולבים, הוסף 20 מיקרוליטר של חמישה מור נתרן כלורי לכל 500 מיקרוליטר פליטה. עבור בקרת הקלט השמורה בעבר הוסף 40 מיקרוליטר של חמישה מור נתרן כלורי למיליליטר.

מחממים את ה-EIT באמבט מים של 65 מעלות צלזיוס למשך ארבע שעות. להריץ בן לילה 10 מיקרוליטר מכל דגימה בבקרת הקלט על ג'ל אירוס של 2% ליד סמן גודל המשתרע על פני זוג קילו-בסיס אחד כדי לבדוק את גודל מקטע ה-DNA. ה-DNA יופיע כמריחה ולא כרצועה חדה.

שחזר את ה-DNA מכל דגימה של 500 מיקרוליטר באמצעות ערכת מיצוי ג'ל מהירה של קאיה. התחל בהוספת 600 מיקרוליטר של מאגר qg כדי לייעל את ספיגת ה-DNA עם קרום הסיליקה בעמודת סיבוב מהיר של קאיה ולאחר מכן הוסף 200 מיקרוליטר של איזופרופנול לפני טעינת העמודה. בדוק את התערובת כדי לקבוע אם יש משקעים SDS.

אם התרחשו משקעי SDS, יש לחמם את הדגימות באמבט מים של 42 מעלות צלזיוס עד שהמשקעים נעלמים. לאחר מכן החל את הדגימות על העמודות והוציא את ה-DNA לפי הוראות היצרן. SDS יכול להפריע לפעילות של PCRT פולימראז ולכן יש להסירו לחלוטין לפני ביצוע PCR.

דגרו כל דגימת DNA על קרח כדי לזרז כל שאריות SDS וצנטריפוגה ב-14,000 גרם למשך דקה אחת בארבע מעלות צלזיוס. העבירו את ה-SANE לצינורות עינור חדשים. ניתן לזהות את ה-EITs של ה-DNA על ידי PCR קונבנציונאלי או על ידי PCR או QPCR כמותי בזמן אמת עם פריימר ספציפי עבור כל רצף לניתוח, השתמש בחמישה עד 10 מיקרוליטר מסך ה-DNA IIT עבור תגובת PCR או QPCR אחת, תנאי PCR ו-QPCR ישתנו.

עם זאת, הכמות המוגבלת של חומר המוצא דורשת מחזורי PCR נוספים לזיהוי PCR קונבנציונלי, התחל ב-40 מחזורים והתאם לפי הצורך. באמצעות פרוטוקול זה, בוצעו שבבים מעוברים E 8.5 ו-E 9.5. DNA מטוהר שבב נותח על ידי PCR קונבנציונלי ועל ידי PCR כמותי בזמן אמת.

התוצאות מדגימות כי הגורם המיוגני והוויסות קיים על המיוגני והמקדם בעוברים E 8.5 ו-E 9.5. לעומת זאת, לא נמצאה אינדיקציה למיוגני ולהיקשר למיוגני ולמקדם בשק האלון שבו המיוגני אינו בא לידי ביטוי. מקדם הגמא של אינטרפרון, המכיל רצפים התואמים את אתר הקישור המיוגני, שימש כבקרת רצף שלילית כצפוי מיוגני לא היה קשור למקדם גמא אינטרפרון באף אחת מדגימות הרקמה שנבדקו.

התוצאות מצביעות על כך שמיוגני נקשר במקדם המיוגני בסומיטים של עוברי E 8.5 ו-E 9.5 שכן מיו גנין מתבטא באופן ספציפי בסומיטים בשלבים אלה, לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לבודד ולהכין עוברי עכבר EA 0.5 להערכת משקעי כרומטין שתזהה גורמים רגולטוריים שנמצאו לגנים ספציפיים לרקמות ברקמות מתפתחות.