Ein Calcium Biolumineszenzassay für die funktionelle Analyse von Mosquito ( Aedes aegypti) Und Tick ( Rhipicephalus microplus) G-Protein gekoppelten Rezeptoren

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments ist es, die Struktur-Wirkungs-Beziehungen von synthetisierten Arthropoden-Neuropeptiden auf ihren verwandten gpcr zu analysieren. Dies wird durch Transfektion des Eierstocks des chinesischen Hamsters erreicht, K eine leere Zellen mit dem Wunsch G PCR R Expressionsvektor, um stabil transformierte Zelllinien zu erhalten, die von einer einzelnen Zelle abgeleitet sind. In einem zweiten Schritt wird die stabile Zelllinie mit dem Quarian-Plasmid transfiziert, das den Reporter Gina Quaran zur Messung der intrazellulären Biolumineszenz im Calcium-Biolumineszenz-Platten-Assay trägt. Als nächstes wird der Calcium-Biolumineszenz-Platten-Assay durchgeführt, um die zytoplasmatischen Calciumspiegel nach Anwendung des Peptidliganden auf diese rekombinanten Zellen zu bestimmen.

Es werden Ergebnisse erhalten, die Unterschiede in den Biolumineszenzeinheiten zeigen, wenn strukturell unterschiedliche Peptide oder unterschiedliche Peptidkonzentrationen auf die rekombinanten Zellen aufgetragen werden, basierend auf der induzierten intrazellulären Kalziumfreisetzung, wie sie vom Reporter a Corrin im Plattenassay nachgewiesen wurde. Der Hauptvorteil der Verwendung stabil transformierter klonaler Zelllinien, die rekombinante GPCRs exprimieren, gegenüber Trends und Expressionsprotokollen besteht darin, dass die Rezeptorexpressionsniveaus einheitlicher sind, was Konsistenz und Ergebnisse ermöglicht. Darüber hinaus ermöglicht die Ausrichtung des Aquarienproteins auf die Mitochondrien empfindliche Kalziummessungen durch Biolumineszenz, was das Experiment demonstriert. Heute werden zwei Doktoranden und Simon Kersch sowie ein Postdoc aus meinem Labor anwesend sein.

Um stabile Zelllinien zu etablieren, beginnen Sie mit der Züchtung von Eierstöcken des chinesischen Hamsters, K one leere Zellen bei 37 Grad Celsius in einem mit 5 % Kohlendioxid befeuchteten Inkubator. Halten Sie die leeren Zellen mit einem x Antibiotikum, Antimykotikum, in Wachstumsmedium, nachdem die Zellen gesund gewachsen sind. Sehen Sie, wie der chinesische Hamster Eierstöcke K one Zellen in T 25 Gewebekulturflaschen züchten die Zellen über Nacht in Wachstumsmedium ohne Antibiotika, bis sie etwa 30% konfluent sind.

Vor der Transfektion. Bereiten Sie einen DNA-Expressionsvektor vor, der den interessierenden GPCR enthält, wie im schriftlichen Protokoll beschrieben. Kombinieren Sie die DNA mit 100 Mikrolitern Optum reduziertem Serummedium.

Mischen Sie sechs Mikroliter Lipofektionsreagenz in 100 Mikroliter F 12 K, serumfreies Medium und inkubieren Sie es 30 bis 45 Minuten lang bei Raumtemperatur. Mischen Sie nach der Inkubation die DNA- und die Lippenerwartungslösung vorsichtig tropfenweise. Lassen Sie die Mischung 10 bis 15 Minuten bei Raumtemperatur in einer 15-Milliliter-Tube stehen.

Mischen Sie die Transfektionsmischung vorsichtig und tropfenweise in 1,8 Milliliter frisches F 12 K medium. Waschen Sie dann die Zellen mit PBS und geben Sie diese neue Transfektionslösung in die Zellen. Nach einer 18-stündigen Inkubation.

Wechseln Sie das Medium auf F 12 K, Medium plus 10%FBS ohne Antibiotika und inkubieren Sie es am nächsten Tag über Nacht. Die Zellen werden in zwei T 25-Kolben mit F 12 K, Medium plus 10 % FBS ohne Antibiotika aufgeteilt, wie im schriftlichen Verfahren beschrieben. Weitere 18 Stunden inkubieren.

Ersetzen Sie das Medium durch selektives Medium. Kultivieren Sie dann die Zellen mit dem selektiven Medium für drei bis vier Wochen im Laufe der Zeit. Dabei werden Zellen selektiert, die das Plasmid stabil in ihre genomische DNA eingebaut haben.

Setzen Sie die Pflege der Zellen mit Erhaltungsmedium fort und frieren Sie die Zelllinien regelmäßig ein, um einen Verlust im Falle einer unerwarteten Kontamination zu vermeiden. Zur Selektion für klonale Zelllinien werden zuerst Trypsin-Augen verwendet und die Zellen mit Erhaltungsmedium zentrifugiert, wie im schriftlichen Protokoll beschrieben. Dann Resus, suspendieren Sie die Zellen in fünf Millilitern Erhaltungsmedium.

Entfernen Sie 0,5 Milliliter der Zellsuspension und fügen Sie 4,5 Milliliter frisches Erhaltungsmedium hinzu, um eine 10-fache Verdünnung durchzuführen, und übertragen Sie 100 Mikroliter der 10-fachen Verdünnung in 12 Vertiefungen einer 96-Well-Platte, um für einzelne Zellen auszuwählen. Führen Sie weiterhin eine 10-fache serielle Verdünnung dieser Zellen etwa 19 Mal durch, um eine theoretische endgültige Suspension von einer Zelle pro 100 Mikroliter zu erhalten, und übertragen Sie 100 Mikroliter jeder seriellen Verdünnung in 12 Vertiefungen einer 96-Well-Platte. Beobachten Sie nach 18 Stunden Inkubation 96-Well-Platten unter einem Inverslicht- oder Fluoreszenzmikroskop und markieren Sie Wells, die nur eine einzelne Zelle oder zwei Zellen zu enthalten scheinen, die sich offensichtlich von einer einzigen Zelle getrennt haben.

Beobachten Sie die Platten jeden Tag, wechseln Sie alle drei Tage das Medium. Lassen Sie die Zellen eine Woche lang wachsen, bis sie zu etwa 80 % zusammenfließen. Spülen Sie dann die markierten Vertiefungen mit 200 Mikrolitern PBS und Trypsin.

Beäugen Sie sie mit 100 Mikrolitern PBS-Trips in EDTA-Lösung. Entfernen Sie die PBS TRIPSIN EDTA-Lösung. Fügen Sie 100 Mikroliter Erhaltungsmedium hinzu und überführen Sie die Zellen aus jeder markierten Vertiefung in eine Vertiefung einer Sechs-Well-Platte mit einem Milliliter Erhaltungsmedium.

Nachdem die Zellen drei Tage lang in der Sechs-Well-Platte gezüchtet wurden, werden die Zellen in einzelne T 25-Kolben überführt. Frieren Sie die Zelllinie regelmäßig ein, damit sie entnommen werden kann, wenn die Zellen nicht mehr konstant funktionieren. Um die Zelllinie mit der höchsten Reaktion zu bestimmen, testen Sie die übertragenen Zellen mit dem Calcium-Biolumineszenz-Assay mit einem aktiven Liganden wie dem Rezeptor, Peptid, Liganden oder einem anderen Positivkontrollagonisten.

Der Calcium-Biolumineszenz-Assay wird später in diesem Video im Detail demonstriert. Führen Sie die Einzelzellauswahl ein zweites Mal durch, bevor Sie mit dem Experiment fortfahren. Wenn klonale Zelllinien für Assays ausgewählt und in Kultur aufbewahrt werden, ist es wichtig, die Passagenzahlen im Auge zu behalten, da Zellen mit hoher Passagezahl in einem T 25-Kolben möglicherweise nicht mehr funktionieren.

Bruttozelllinien, die den gewünschten Rezeptor im Erhaltungsmedium exprimieren, konfluieren zu etwa 90%. Nach dem Ausprobieren und Zentrifugieren der Zellen wird sie in das Erhaltungsmedium suspendiert, die Zellen etwa 10-fach mit Erhaltungsmedium verdünnt und die Zellzahl mit einem Hämozytometer gezählt. Passen Sie dann die Zellzahl auf ungefähr zwei mal 10 bis die fünften Zellen pro Milliliter an, säen Sie zwei Milliliter der Zellen in jede Vertiefung einer Sechs-Well-Platte und inkubieren Sie die Platte für 24 Stunden, wonach die Zelle vor dem Beginn des Kalzium-Biolumineszenz-Plattenassays etwa 60 % konfluent sein sollte.

Bereiten Sie das Reportergen von Interesse für das Expressionsvektorkonstrukt vor. Hier wird ein Mitochondrien-Ausdruck eines Quorum-Berichts verwendet. Dann transfizieren Sie die Zellen mit einem Mikrogramm dieses Reporterplasmids, wie im schriftlichen Protokoll beschrieben.

Nach 24-stündiger Inkubation der Zellen in einer Sechs-Well-Platte, Trypsin, Zentrifugation und Resuspendierung zählen die Zellen die Zellzahl auf 400.000 Zellen pro Milliliter und überführen 100 Mikroliter in jede Vertiefung einer weißen, dünnen unteren Mikrotiterplatte, inkubieren weitere 24 Stunden, bis eine Konfluenz von etwa 80 % erreicht ist. Dies ist die optimale Konzentration von Zellen für den Biolumineszenz-Assay. Die folgenden Schritte sollten im Dunkeln durchgeführt werden, werden hier aber im Licht gezeigt.

Zu Demonstrationszwecken ist genügend calciumfreies DME-Medium mit fünf mikromolaren CHO-Terezin für 90 Mikroliter pro Schweißnaht herzustellen. Entfernen Sie das alte Medium von der Platte und geben Sie jeweils 90 Mikroliter hinein. Inkubieren Sie die Platten drei Stunden lang im Dunkeln bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid, danach sind die Zellen bereit für den Test.

Diese Demonstration wird mit einem Nova-Sternplatten-Reader im Biolumineszenzmodus durchgeführt. Um mit der Spülung zu beginnen, pumpt die Maschine die Platte sollte im Dunkeln in den Plattenhalter gelegt werden. Solubilisieren Sie die Peptide in einem 1,5-Milliliter-EOR-Röhrchen.

Es wird genügend calciumfreies DME und Medien für 10 Mikroliter 10 x Peptid pro Vertiefung verwendet. Stellen Sie vor der Verwendung die Aspirattiefe und die Positionsbestimmung der Peptidlösung ein. Fordern Sie die Zellen mit 10 Mikrolitern des Peptids heraus und beginnen Sie sofort mit der Aufzeichnung der Lichtemission.

In dieser Demonstration ist das Instrument so eingestellt, dass es die Lichtemission bei 465 Nanometern für jede Vertiefung alle zwei Sekunden für eine Gesamtzeit von 50 Sekunden aufzeichnet. Waschen Sie nach Beendigung des Laufs die Pumpen der Maschine. Wiederholen Sie den Vorgang für jede Peptidprobe, speichern Sie die Daten und waschen Sie die Maschinenpumpen nach dem Assay erneut.

Die Daten der Lichtemission aus jeder Vertiefung werden von der Software automatisch in ein Microsoft Excel-Datenblatt übertragen. Fügen Sie die Daten aus Excel in Prism Software 4.0 ein. Erstellen Sie ein Diagramm mit den verschiedenen Peptidkonzentrationen in den Einheiten x-Achse und Biolumineszenz.

Wählen Sie auf der Y-Achse eine nichtlineare Regressionskurven-Anpassungsanalyse aus, um Konzentrations-Wirkungskurven für jedes Peptid in den entsprechenden EC 50-Werten zu erhalten. Jedes Experiment sollte für die Datenanalyse dreimal wiederholt werden. Bei der Expression in den Eierstöcken des chinesischen Hamsters verhielt sich der K-on-Rezeptor aus den Aegypti der Mücke ad wie ein Multiligandenrezeptor und reagierte funktionell auf so niedrig wie ein Animo are.

Für die drei endogenen Achtziger-Jahre-Kinins wurden einzeln mit dem Calcium-Biolumineszenz-Platten-Assay getestet. Statistisch unterschiedliche EC-50-Werte von etwa 16 Nanomolar für die Achtziger, Aegypti-Kinine 3, 26 Nanomolaren für die Achtziger, Aegypti-Kinine zwei und 49 Nanomolaren für die Achtziger, Aegypti-Kinin eins wurden ermittelt, woraus sich eine Rangfolge der Potenz ergibt: Achtziger-Kinin drei als die potenteste und Achtziger-Kinin eins als die am wenigsten gezeigte. Hier ist der Aktivitätsvergleich von sechs Alpha-Amino-ISO-Buttersäure-Kinin-Analoga auf dem Zecken-Kinin-Rezeptor, der den Eierstock K des chinesischen Hamsters exprimiert, einer Zelllinie, durch einen Kalzium-Biolumineszenz-Platten-Assay.

Die Y-Achse stellt die prozentualen maximalen Biolumineszenzeinheiten für jedes Analogon dar, ausgedrückt als Prozentsatz der Biolumineszenz, die bei einer Konzentration beobachtet wurde, im Vergleich zur maximalen Reaktion, die bei allen getesteten Konzentrationen für jedes analoge Analogon beobachtet wurde. KININE HEXA Peptid F-F-F-S-W-G Amid ist die positive Kontrolle für die Rezeptoraktivität. Das Einzelersatz-Kinine-Analogon Doppel-F-Amino-ISO-Buttersäure WG-Amid war aktiver als das Positivkontroll-HEXA-Peptid KININ-Analogon, das KINEIN-Analogon mit zwei Aminobuttersäure-Substitutionen, Aminobuttersäure FF-Aminobuttersäure WG-Amid war das wirksamste der getesteten Doppelersatzanaloga. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man A-G-P-C-R exprimiert und klonale Zelllinien erhält, um strukturierte Aktivitätsbeziehungen von Liganden auf Rezeptoren mit einem Kalzium-Biolumineszenz-Assay zu analysieren.