Name: Genetik ve epigenetik Analizleri Parafin Gömülü Malzeme DNA Ekstraksiyon (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-03-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 32 s
Description: Öğrenin, parafin gömülü doku örneklerinden DNA izolasyonu için ksilen ile deparafinizasyon, etanol serisi ile rehidrasyon ve proteinaz K ile sindirim yöntemlerini. Bu protokol yüksek kaliteli DNA elde edilmesini sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Biz, bu video ve makale değerlendirme ve eleştiriler için Lam laboratuar üyelerine teşekkür etmek istiyorum. Bu çalışma, Kanada Sağlık Araştırma Enstitüleri fon tarafından desteklenmiştir.

<p class="jove_title"&gt; 1. Usul notlar</p&gt;<ul&gt;<li&gt; Ksilen ve fenol toksik kimyasallar ve bir fumehood ele alınmalıdır. Kullanmadan önce madde güvenlik bilgileri formuna (MSDS) bakın.</li&gt;<li&gt; Ksilen bazı plastik erir, bu bileşiklerin tolere polipropilen tüpler kullanılmalıdır.</li&gt;<li&gt; Özel ipuçları, dahili bir kömür stoper içerdiğini satın alınabilir. Bu pipet herhangi bir kauçuk parçaları çözme ksilen önler. Alternatif olarak, filtre ipuçları kullanılabilir.</li&gt;</ul&gt;<p class="jove_title"&gt; 2. Parafin kaldırma</p&gt;<ol&gt;<li&gt; Fumehood 800 ul ksilen (VWR, CABDH6216-4), parafin çözmek için 5 ila 15 dakika hafif sallayarak bir rocker örnek ve yer içeren etiketli tüpe ekleyin.</li&gt;<li&gt; Pelet, 3 dakika boyunca bir mikrosantrifüj maksimum hız (14.000 rpm veya 16 000 xg) iplik örnek. Dikkatlice ksilen süpernatantı çekilme ve ksilen atık atmak için bir polipropilen tüp atmayın. Pelet rahatsız etmemek için dikkatli olun.</li&gt;<li&gt; Ksilen yıkama adımları tekrarlayın ve 1 2until parafin tamamen çözülür. Bu doku örneği boyutuna bağlı olarak genellikle 2-3 yıkama gerektirir. Tamamen çözülmüş örnek yumuşak görünecek ve yapısal bütünlüğünü bazen kaybedersiniz. Örnek bütünlüğünü hafifçe bir pipet ucu ile tespit edilebilir.</li&gt;</ol&gt;<p class="jove_title"&gt; 3. Etanol rehidrasyon</p&gt;<ol&gt;<li&gt;% 100 etanol (v / v) moleküler biyoloji notu etanol, vorteks 800 ul ekleyin, daha sonra mikrosantrifüj 14.000 rpm az 3 dakika boyunca dönerler. Pelet rahatsız etmemek için dikkatli olmak, etanol süpernatantı.</li&gt;<li&gt; 800 ul% 70 etanol (% 100 (v / v) distile su ile seyreltilmiş etanol (dH<sub&gt; 2</sub&gt; O)), girdap ve 14.000 rpm&#39;de 3 dakika spin. Dikkatlice etanol süpernatant kaldırmak.</li&gt;<li&gt; 800 ul% 50 etanol (% 100 (v / v) distile su ile seyreltilmiş etanol (dH<sub&gt; 2</sub&gt; O)), girdap ve 14.000 rpm&#39;de 5 dakika spin. Pipetleme tarafından dikkatli bir şekilde, mümkün olduğu kadar etanol gibi çıkarın. Pelet rahatsız tam Rehidrate bir doku değil pelet yanı sıra kurutulmuş doku olarak bu noktada son derece dikkatli olun.</li&gt;<li&gt;, 5 dakika etanol süpernatant, hava-kuru pelet kaldırarak sonra dikkatli üstü kuru değil.</li&gt;</ol&gt;<p class="jove_title"&gt; 4. Doku sindirim</p&gt;<ol&gt;<li&gt; Lizis Tampon 200-500 ul (aşağıdaki formül) ekleyin. Pelet bir pipet veya vorteks kullanarak yeniden askıya aldı. Bu noktada Ekstra çaba doku tamamen yeniden askıya örnek daha eksiksiz bir sindirim ve DNA&#39;nın daha iyi bir verim neden olacak.</li&gt;<li&gt; 56 örnekleri inkübe ° C su banyosu veya ısıtma bloğu.</li&gt;<li&gt; Doku çekirdeği, başak proteinaz K (20 mg / ml stok solüsyonu, Invitrogen, AM2548) sabah ve akşam 20 ul.</li&gt;<li&gt; Doku tamamen eriyene kadar 2 ila 5 gün boyunca sindirim yukarıdaki adımları tekrarlayın.</li&gt;</ol&gt;<p class="jove_step"&gt; Lizis Tampon</p<ul&gt;<li&gt; 10 mM Tris-HCl pH: 8.0</li&gt;<li&gt; 100 mM EDTA pH 8.0</li&gt;<li&gt; 50 mM NaCl</li&gt;<li&gt;% 0.5 SDS</li&gt;<li&gt; 200 mg / ml proteinaz K (kullanmadan hemen önce ekleyin)</li&gt;</ul&gt;<p class="jove_title"&gt; 5. DNA kadar temiz</p&gt;<ol&gt;<li&gt; Fenol doymuş (Fisher, BP1750I-400) ve tersine çevirerek karıştırın eşit miktarda bir tampon ekleyin. Mikrosantrifüj içinde 14.000 devirde en az 5 dakika Spin.</li&gt;<li&gt; Yeni bir tüp sulu katman aktarın. Interfaz Not: beyaz malzeme çok şey var?</li&gt;<liInterfaz (genellikle 3 veya daha fazla kez) netleşene kadar sulu fraksiyonu 1. ve 2. adımları tekrarlayın. Ekstraksiyon geri gerçekleştirin * interfaz nihai verimi artırmak için bulanık.</li&gt;<liÖrnek çıkartılan sulu kesir izoamil alkol (25:24:1) (Fisher, BP1752I-400): kloroform: interfaz&gt; sonra, eşit miktarda fenol ekleyin. 5 dakika karıştırın ve sonra 14.000 rpm&#39;de 5 dakika döndürün. Artık daha fazla fenol ve sulu tabakanın çıkarılması kolaylaştırılması, interfaz keskinleştirir Thisreduces</li&gt;<li&gt; 37 1 saat süreyle 100 mg / ml sulu katman yeni bir tüp çıkarın ve treatwith RNaz A ° C</li&gt;<li&gt; Kalan RNaz A kaldırmak ve sulu fraksiyonu toplamak için 1. ve 4. adımları tekrarlayın. Daha ilk lizat kaldırmak için çok daha az protein olması gerektiği gibi sadece 1 veya 2 tampon doymuş fenol adımları gerekir gerekir.</li&gt;</ol&gt;<p class="jove_content"&gt; * Ekstraksiyon dH 50-100 ul eklemek gerçekleştirmek için<sub&gt; 2</sub&gt; 0 interfaz ve organik kısmını içeren numune tüpü. Karıştırın ve 5 dakika mikrosantrifüj 14.000 rpm&#39;de örnek spin Tüpü ters çevirin. Sulu faz toplayın ve daha önceden edinilmiş sulu çıkarma ekleyin. Interfaz netleşene kadar ekstraksiyon tekrar devam edin.</p&gt;<p class="jove_title"&gt; 6. DNA yağış</p&gt;<ol&gt;<li&gt; Toplanan sulu tabakanın hacmini tahmin edin.</li&gt;<li&gt; 1 / 10 hacim 3 M sodyum asetat, pH 5.2 ve% 100 izopropanol (v / v) moleküler biyoloji notu (veya% 100 etanol 2.5 cilt) 1 hacim ekleyin.</li&gt;<li&gt; İyice karıştırın ve 30 dakika veya gece için buz üzerinde veya -20 ° C derin dondurucuya koymak.</li&gt;<li4&gt; Spin maksimum hızda (14.000 rpm) ° C 10 dakika için mikrosantrifüj</li&gt;<li&gt; Süpernatantı atın.</li&gt;<li&gt;% 70 buz soğuk etanol istenmeyen tuzları kaldırmak için pelet yıkayın.</li&gt;<li&gt; Tercih tampon yeniden askıya pelet (genellikle dH<sub&gt; 2</sub&gt; O).</li&gt;</ol&gt;<p class="jove_title"&gt; 7. DNA sayısallaması</p&gt;<ol&gt;<li&gt; DNA konsantrasyonu ölçmek. A260 A280 oranı ~ 1,8 olmalıdır. Küçük miktarda DNA, NanoDrop spektrofotometre kullanarak ölçüm tercih edilmektedir.</li&gt;<li&gt; Takiben nicelik, jel elektroforezi örnek DNA kalitesini test ve kirlenmesine neden olan RNA tamamen bozulmuş olup olmadığını belirlemek için yapılmalıdır.</li&gt;<li&gt; Yüksek kalite edilen DNA downstream uygulamalar için uygundur, ya da daha sonra kullanılmak üzere -20 ° C&#39;de saklanabilir. RNA hala örnek varsa, DNA kadar temiz ve yağış adımları yineleyin ve yeniden miktarını ve kalitesini örneklerinin hak.</li&gt;</ol&gt;

<ol><li>Santos, M. C., Saito, C. P., Line, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extraction+of+genomic+DNA+from+paraffin-embedded+tissue+sections+of+human+fetuses+fixed+and+stored+in+formalin+for+long+periods%5BTitle%5D)+AND+%22Pathol+Res+Pract%22%5BJournal%5D)">Extraction of genomic DNA from paraffin-embedded tissue sections of human fetuses fixed and stored in formalin for long periods.</a> Pathol Res Pract. 204, 633-636 (2008).</li>
<li>Hilz, H., Wiegers, U., Adamietz, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stimulation+of+proteinase+K+action+by+denaturing+agents%3A+application+to+the+isolation+of+nucleic+acids+and+the+degradation+of+%27masked%27+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Biochem%22%5BJournal%5D)">Stimulation of proteinase K action by denaturing agents: application to the isolation of nucleic acids and the degradation of 'masked' proteins.</a> Eur J Biochem. 56, 103-108 (1975).</li>
<li>Sambrook, J. oseph, R, D. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSambrook%2C+Joseph+%22Molecular+Cloning%3A+A+Laboratory+Manual%22">Molecular Cloning: A Laboratory Manual</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, New York. (2001).</li>
<li>Kennett, J. Y., Watson, S. K., Saprunoff, H., Heryet, C., Lam, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Technical+demonstration+of+whole+genome+array+comparative+genomic+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Technical demonstration of whole genome array comparative genomic hybridization.</a> J Vis Exp. , (2008).</li>
<li>Thu, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methylated+DNA+immunoprecipitation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Methylated DNA immunoprecipitation.</a> J Vis Exp. , (2009).</li>
<li>Tang, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+extraction+from+formalin-fixed%2C+paraffin-embedded+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">DNA extraction from formalin-fixed, paraffin-embedded tissue.</a> Cold Spring Harb Protoc. , (2009).</li>
<li>Hongxin Fan, M. L. G., G, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+Extraction+from+Paraffin-Embedded+Tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Pathology+Protocols%22%5BJournal%5D)">DNA Extraction from Paraffin-Embedded Tissues.</a> Molecular Pathology Protocols. 49, 1-4 (2001).</li>
</ol>

Histopatolojik analizi ve tanı için biyopsi veya cerrahi olarak eksize dokuların uzun süreli saklanması için genellikle formalin sabit ve parafin (FFPE). Bu örneklerin DNA ayıklamak için, hastalığın genetik temeli anlamak giderek artan bir ilgi ile genomik analiz ve translasyonel çalışmaları için kullanılabilir tanı malzeme paha biçilmez bir kaynak temsil eder. Nükleik asitlerin ağır 6 bağlayan protein, nükleik asit ve protein-protein çapraz tarafından değiştirilmiş olabilir Tarihsel FFPE örnekleri moleküler analiz için uygun bir kaynak sayılmaz . Ancak, proteaz sindirim, PCR, dizi CGH, sıralama ve metilasyon profili de dahil olmak üzere alt analizler için uygun olan nükleik asitlerin parçalanmış bültenleri keşfi genetik analiz 6 için bu değerli örneklerinin kullanımı sağlar. Parafine gömülü dokulardan DNA ekstraksiyonu DNA arındırmak için diferansiyel çözünürlüğü dayanmaktadır sağlam bir işlemdir. Çıkarılan DNA nitelik ve nicelik ve sonraki DNA amplifikasyon başarı çıkarma sırasında ve sonrasında, önce bir dizi parametre bağlıdır. Bunlar, ancak bunlarla sınırlı değildir: doku tipi ve miktarı, doku korunması için kullanılan fiksatif türü, fiksasyon süresi, yaş parafin blok ve saklama koşulları gibi istenen DNA segmentinin uzunluğu 1,7 amplifiye. Çözünmemiş parafin kötü örnek kalite ve PCR inhibisyonu dokusundan parafin kaldırılması başarılı çıkarılması için en kritik adımdır.

<table border="1"><tbody><tr><th> Isim </th><th> Şirket </th><th> Katalog Numarası </th><th> Yorumlar </th></tr><tr><td> Ksilen </td><td> VWR </td><td> CABDH6216-4 </td><td> - </td></tr><tr><td> 1.7 ml SafeSeal Mikrosantrifüj Tüpler </td><td> BioScience Sorenson </td><td> 11510 </td><td> - </td></tr><tr><td> Spectrafuge 16M Mikrosantrifüj </td><td> Labnet </td><td> C0160-B </td><td> - </td></tr><tr><td> Lizis Tampon </td><td> - </td><td> - </td><td> 10 mM Tris-HCl pH8 100 mM EDTA pH 8, 50 mM NaCl, % 0.5 &#39;SDS 200 mg / ml proteinaz K </td></tr><tr><td> Proteinaz K Menkul Kıymetler Çözümü </td><td> Invitrogen </td><td> AM2548 </td><td> 20 mg / ml </td></tr><tr><td> Proteinaz K Menkul Kıymetler Çözümü </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Tampon Fenol pH 6.6/7.9 Doymuş </td><td> Balıkçı </td><td> BP1750I-400 </td><td> - </td></tr><tr><td> Fenol: Kloroform: izoamilalkol (25:24:1, pH 6.7/8.0) </td><td> Balıkçı </td><td> BP1752I-400 </td><td> - </td></tr><tr><td> RNaz A </td><td> Roche </td><td> 10109169001 </td><td> 100mg </td></tr><tr><td> 3M sodyum asetat pH 5.2 </td><td> - </td><td> - </td><td> 80ml içinde 40.81g NaOAc Buzul asetik asit ile pH 5.2 &#39;ye ayarlayın. DH 2 O 100ml ekle Otoklav </td></tr><tr><td> ND 3300 Spektrofotometre </td><td> NanoDrop </td><td> - </td><td> - </td></tr></tbody></table>

genetik ve epigenetik analizleri parafin gömülü malzeme dna ekstraksiyon

 DNA Extraction from Paraffin Embedded Material for Genetic and Epigenetic Analyses

Hastalık gelişimi ve ilerlemesi kromozom düzenlenmeleri, kopya sayısı kazançlar ve kayıplar ve DNA metilasyon dahil olmak üzere sık sık genetik ve epigenetik sapmaları ile karakterizedir. Gelişmeler, bu tür mikroarray&#39;ler yüksek verimli, genom profil teknolojileri, bu belirli değişikliklerin belirlenmesi ve tespit etmek için yeteneğimizi önemli ölçüde iyileştirilmiştir. Ancak olarak teknoloji geliştirmeye devam etmektedir, sınırlayıcı bir faktör örnek kalite ve yer durumu kalır. Ayrıca, takip klinik bilgi ve hastalık sonucu genellikle ilk örnek toplama yıl sonra tahsil edilir. Numuneler, onlarca yıllık, genellikle formalin ile fikse ve parafin (FFPE) yıl boyunca hastane arşivinde saklanır. Uygun ekstraksiyon yöntemi uygulandığında ise DNA, verimli ve etkili parafine gömülü dokulardan kurtarıldı olabilir. Yüksek kaliteli, düzgün bir şekilde korunmuş ve depolanan örneklerin çıkarılan DNA genetik ve epigenetik imzaları 1 normal ve hastalıklı dokuları ve üretim karşılaştırmalar için kantitatif testleri destek olabilir . , Parafine gömülü örnekleri, doku çekirdek veya microdissected doku DNA ayıklamak için, doku parafin erir ksilen tedavisi, tabi, ve ardından bir dizi etanol yıkar kullanarak rehidrate. Proteinler ve sonradan proteinaz K. lizis tamponu, sodyum dodesil sülfat (SDS) olarak denatüre edici ajanlar içerir, sindirimi 2. kolaylaştıran, ek, nükleazlar gibi zararlı enzimlerin sindirilir . Nükleik asitler, bifazik bir çözüm üretir tampon doymuş fenol ve yüksek hızda santrifüj kullanarak doku lizatı arınmış. DNA ve RNA, proteinler, lipidler ve polisakkaritler arası ve organik faz ise sekestre ise, üst sulu faza kalır. Sulu faz ve tekrarlanan fenol ekstraksiyon Tutma temiz bir örnek oluşturur. Fenol ekstraksiyon, RNaz A kirlenmesine neden olan RNA ortadan kaldırmak için eklenir. Ek fenol ekstraksiyon RNaz ile inkübasyon aşağıdaki A kalan herhangi bir enzim kaldırmak için kullanılır. Ayrıca sodyum asetat ve izopropanol çökeltileri DNA ve yüksek hızda santrifüj pelet DNA ve izopropanol çıkarma işlemini kolaylaştırabilir. Yağış taşınan Fazla tuzları sonraki enzimatik deneyleri ile müdahale, ancak% 70 etanol ile yıkanarak yeniden pelet DNA 3 santrifüj takip DNA çıkarılabilir. DNA, distile su veya seçim tampon yeniden askıya sayısal ve -20 ° C&#39;de saklanan Arıtılmış DNA sonradan dahil downstream uygulamalarında kullanılan, ancak bunlarla sınırlı değildir, PCR, dizi karşılaştırmalı genomik hibridizasyon 4 (dizi CGH), denatüre DNA Immunoprecipitation (MeDIP) ve bütünleştirici bir doku / tümör örneklerinin analizi için izin sıralama.

Bu video formalin ile fikse parafine gömülü malzeme DNA ekstraksiyonu için protokol göstermektedir. Bu doku kesitlerinde ksilen ile deparafinize olduğu bir çok günlük bir prosedür, etanol ile sulandırılır ve sonraki gen-spesifik veya genom analizi için DNA arındırmak ve izole etmek için proteinaz K ile tedavi edilir.

Genetik ve epigenetik Analizleri Parafin Gömülü Malzeme DNA Ekstraksiyon

Hastalığın gelişimi ve ilerlemesi; kromozomal yeniden düzenlenmeler, kopya sayısı ... dahil olmak üzere sık görülen genetik ve epigenetik aberasyonlarla karakterize edilir.

Bu video, parafin gömülü doku örneklerinden DNA'nın nasıl izole edileceğini gösterecektir. Bu gösterimde kullanılan örnek, üç milimetre çapında ve altı milimetre uzunluğunda bir doku örneğidir. Bu gösterimde tek bir örnek kullanılmış olsa da, çapı beş milimetreden ve uzunluğu 10 milimetreden büyük olan daha büyük örnekler veya burada kullanılan boyutta iki ila üç örnek tek bir reaksiyonda işlenebilir.Bununla birlikte, parafinin tamamen uzaklaştırılmasını ve doku sindirimini sağlamak için protokolde ayarlamalar yapılması gerekebileceğini belirtmek önemlidir. Dokuya herhangi bir işlem uygulanmadan önce, dokuyu koruyan mumsu parafin çözülmelidir. Ksilen ve fenol toksik olduğu için bu işlem ksilen kullanılarak gerçekleştirilir. Bu kimyasallarla yapılan tüm çalışmalar bir çeker ocak altında yürütülmelidir; numunenizi içeren tüpe 800 µL ksilen ekleyin.Ardından numuneyi, hafifçe sallayarak 10 dakika boyunca bir rocker üzerine yerleştirin. Numuneyi çöktürmek için 14.000 RPM'de üç dakika boyunca santrifüjleyin ve ardından tüpteki ksileni uzaklaştırıp parafini çözün. Parafin tamamen çözünene kadar bu adımları iki veya üç kez tekrarlayın.Doku ıslak ve yumuşak görünmelidir. DNA'nın nihai verimini artırmak için tüm parafinin uzaklaştırılması önemlidir. Bu nedenle, daha büyük doku örnekleri için daha fazla yıkama işlemi gereklidir.Parafin örnekten uzaklaştırıldıktan sonra, doku sindiriminin gerçekleşebilmesi için dokunun yeniden hidrate edilmesi gerekir. Bu işlem, bir etanol rehidrasyon serisi kullanılarak gerçekleştirilir. İlk olarak, örneğe 800 µL %100 etanol ekleyin, vortekslenmesini sağlayın ve örneği 14.000 RPM'de üç dakika boyunca santrifüjleyin.Süpernatantı uzaklaştırın. Bu adımları önce 800 µL %70 etanol, ardından %50 etanol kullanarak tekrarlayın. Dokunun daha az katı olması ve çöktürme için daha fazla kuvvet gerektirmesi nedeniyle son santrifüj işlemi beş dakika sürmelidir.Şimdi, DNA'yı hücrelerden serbest bırakmak için dokunun sindirilmesi gerekir. Bu işlem; SDS gibi protein denatüre edici maddeler ve doku yıkımından sorumlu olan enzim proteinaz K'den oluşan bir çözelti olan lizis tamponu kullanılarak gerçekleştirilir.Numuneye 200 ila 500 µL lizis tamponu ekleyin. Boyuta bağlı olarak, 400 µL kullanmak için uygun bir hacimdir. Lizis tamponunun bileşenleri ve 56 °C'lik inkübasyon sıcaklığı, protein aktivitesini maksimize etmeye hizmet eder.ACE K bir protein olduğu için, ACE K dokuyu yalnızca belirli bir süreye kadar yıkabilir; reaksiyonun devam etmesi için periyodik olarak daha fazla enzim eklenmelidir. Dokular tamamen çözünene kadar sabah ve akşam numuneye 10 mg/mL konsantrasyonda 20 µL ACE K proteini eklenir.Artık hiç katı doku görülmediğinde, DNA'nın hücresel kalıntı tamponundan ekstrakte edilmesi gerekir. Örneği sulu ve organik fazlara ayırmak için doygun fenol kullanılır. Sulu faz DNA'yı içerir.Tamponla doyurulmuş fenol kullanmak önemlidir; çünkü normal fenolün asitliği yalnızca DNA'nızı bozmakla kalmaz, aynı zamanda sulu ve organik fazların katmanlaşmasını da tersine çevirir. Tamponla doyurulmuş fenolün iki faz şeklinde saklandığını, fenolün alt katmanda olduğunu unutmayın.Numuneye eşit hacimde tamponla doyurulmuş fenol ekleyin ve tüpü birkaç kez altüst edin. Ardından, faz ayrışmasını sağlamak için numuneyi santrifüje yerleştirin ve 14,000 RPM hızında beş dakika boyunca döndürün.DNA ve RNA üstteki sulu fazda bulunurken; proteinler, lipitler ve polisakkaritler ara fazda ve alttaki organik fazda bulunur. Ara fazı bozmadan sulu tabakayı dikkatlice alın ve yeni bir tüpe aktarın. Genellikle ilk santrifüjden sonra ara faz gevşektir ve geri çekilir.Küçük hacimlerde su kullanılarak ekstraksiyonlar yapılması gerekir. Geri ekstraksiyon protokolü, bu videoya eşlik eden metinde bulunabilir. Arayüz netleşene kadar bu adımları tekrarlayın; bu genellikle üç ila beş tekrardan sonra, DNA örneğine eşit hacimde fenol kloroform, izoamil alkol eklenerek gerçekleştirilir.Bu işlem, tek başına fenol ile aynı amaca hizmet eder ancak DNA verimini maksimize etmek için fazlar arası sınırı netleştirir. Fazlar arası sınır berrak ve net olana kadar bu prosedürü bir veya iki kez tekrarlayın. Örneğiniz proteinlerden arındırıldığına göre, artık kontamine olan RNA'nın uzaklaştırılması gerekir.Bu işlem RNA'lar aracılığıyla gerçekleştirilir. Örneğe 100 µg/mL final konsantrasyonunda bir RNA degradasyon RNA A eklenir ve örnek 37 °C'de bir saat boyunca inkübe edilir. RNA degrade edildikten sonra, RNAA enzimi uzaklaştırılmalıdır.DNA temizleme prosedürü daha önce yapıldığı gibi tekrarlanır. Önce doygun tamponlu fenol kullanıp ardından fenol kloroform izoamil alkole geçildiğinde, mevcut tek kontaminasyon RNA A enzimi ve degrade olmuş RNA olduğu için daha az temizleme adımı gerekecektir. Örnek artık sadece DNA içerdiğine göre, DNA çözeltiden çöktürülmelidir; hacmin onda biri kadar sodyum asetat ve bir hacim izopropanol ekleyin.Alternatif olarak, iki buçuk hacim etanol eklenebilir ancak bu durumda daha büyük bir tüp gerekecektir. Numuneyi -20 °C'de 30 dakika ile bir saat arasında veya gece geç saatlere kadar çalışıyorsanız gece boyunca inkübe edin. Artık DNA ile çalıştığınız için, örneğin degrade olmaması amacıyla buz üzerinde kaldığından emin olun.Çöktürülmüş DNA'yı peletlemek için örneği 4 °C'de 10 dakika boyunca 14,000 RPM'de santrifüjleyin. Sekanslama gibi sonraki deneyleri etkileyebilecek fazla tuzları uzaklaştırmak için, peleti yerinden oynatmamaya dikkat ederek süpernatantı alın. Örneğin, 1 mL soğutulmuş %70 etanol ekleyin ve örneği nazikçe resüspande ederek süspansiyon haline getirin.Numuneyi bir kez daha 4 °C'de, 14.000 RPM'de 10 dakika boyunca santrifüjleyin. Süpernatanı dikkatlice uzaklaştırın ve kalan etanolün beş dakikaya kadar havada kurumasını bekleyin. Numunenin aşırı kurutulmaması önemlidir.Son olarak, DNA saflaştırılır ve seçtiğiniz tampon çözeltide yeniden süspande edilmeye hazır hale gelir. Burada otoklavlanmış distile su kullanıyoruz. Evet.DNA örneklerini daha sonra kullanmak üzere -20 °C'de saklayın. Ekstraksiyon tamamlandıktan sonra, DNA'nızın kalitesini ve miktarını değerlendirmelisiniz. Bu işlem, NanoDrop 3000 kullanılarak spektrometri ile gerçekleştirilir; ölçüm tipini nükleik asit olarak ayarlayın, hesaplama için DNA 50'yi seçin ve cihazı 1.5 µL su ile kalibre edin.Kaideyi temizleyin ve 1,5 µL dilüent (bu durumda distile su) kullanarak boş ölçüm yapın. Kaideyi temizleyin, 1,5 µL örnek yükleyin ve ölçüm düğmesine basın. Evet. Harika.Bu noktada 260/280 oranının 1.8 olması idealdir. DNA'nız; dizi (array), karşılaştırmalı genomik hibridizasyon, metillenmiş DNA immünopresipitasyonu ve sekanslama dahil ancak bunlarla sınırlı olmamak üzere, sonraki uygulamalarda kullanılmaya hazırdır.Hemen ihtiyaç duyulmaması durumunda, bu protokollerin bağlantıları burada gösterilmiştir. Numunelerinizi daha sonra kullanmak üzere -20 °C'de saklayın.

dna-extraction-from-paraffin-embedded-material-for-genetic-epigenetic

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Bu video metillenmiş DNA immunoprecipitation (MeDIP) için protokol göstermektedir. MeDIP seçici (anti-5 mC) 5-methylcytosine özgüllüğü antikorlar kullanılarak genomik DNA örneği metillenmiş DNA parçaları ayıklar iki günlük bir işlemdir.

Metillenmiş DNA Immunoprecipitation

Bu videoda, gastrointestinal tümör dokusundan elde edilen FFPE veya formalinle sabitlenmiş parafine gömülü kesitlerin işlenmesini gösteriyoruz. Deparafinizasyon ve rehidrasyon adımları, sonraki analitik uygulamalar için doku örneğinin işlenmesine izin verir.

Doku Bölümlerinin Deparafinizasyonu ve Rehidrasyonu: FFPE Doku Slaytlarından Parafin Mumu Çıkarmak İçin İki Aşamalı Bir Prosedür ve ardından doku rehidrasyonu

Kriosfer geçmiş çevre koşullarında kalıcı korunmuş organizmalar erişim imkanı sunmaktadır. Bir protokol toplamak ve toprak ve buz permafrost çekirdeklerini dekontaminasyonunda sunulmuştur. Eksojen kolonilerin ve DNA yokluğu tespit mikroorganizmalar sondaj veya işleme malzeme yerine, kontaminasyonu temsil ettiğini göstermektedir.

Antik Biyolojik Topluluklar barındırmıştır İç Araştırma Dondurulmuş Çekirdek dış bölümünden Eksojen Malzeme Kaldırma

Bu modifiye çıkarma protokolü histopatolojik doku blokları ilgi daha doğrusu hedef bölgelerden RNA ve DNA verimi artırır.

RNA ve DNA Ekstraksiyon hem Formalin sabit Parafin gömülü Doku Çekirdek hazırlanması

Bu iletişim kuralı kimliği ve lenf düğümlerinden hayvancılık ve yaban hayatının yaklaşımlar örnekleme, eksizyon adımlar dahil olmak üzere büyük hayvanlar dokulardan lenf nodu transcriptomic profilleme için RNA izolasyonu için yordamlar genel bakış sağlar sonrası koleksiyonu saklama ve işleme için RNA analizi için birden fazla hayvan ve dikkat edilmesi gereken noktalar artı temsilcisi sonuçları arasında tutarlılığı sağlamak için.

Toplanması ve işlenmesi büyük hayvanlar lenf düğümlerinden RNA analizi için: büyük hayvan türlerinin lenf nodu Transcriptomic çalışmalar için hazırlanıyor

Bu protokol, formalin sabit parafin gömülü doku örneklerinin yüzde tümör içeriğini artırmak için bir yöntem sunar.

Tümör Makrodiseksiyonu ile Tümör İçeriğinin Arttırılması

Bu protokol, çeşitli klinik örneklerden verimli histon çıkarımı ve ardından LC-MS/MS ile translasyonel sonrası modifikasyon analizini sağlar. Önemli histon modifikasyonlarının sağlam tespitini kolaylaştırarak, büyük klinik kohortlarda kapsamlı epigenetik profilleme için değerli bir araç olarak hizmet eder.

Kütle Spektrometrisi ile Epigenetik Profilleme için Klinik Örneklerden Histonların Ekstraksiyonu

Burada, akciğer kanseri hücrelerinde tam kan içeren ve sprek olan yapay bir örnekten nadir kanser hücrelerinin izole edilmesini gösteren bir protokol sunuyoruz. Protokol, yarı otomatik, etiketsiz hücre izolasyon platformu kullanır. Zenginleştirilmiş hücreler, epidermal büyüme faktörü reseptör mutasyonları için damlalı dijital PCR kullanılarak analiz edilir.

Dolaşan Nadir Hücrelerde Epidermal Büyüme Faktörü Reseptör DNA Mutasyonlarının Profillenmesi Hücre İzolasyon Sistemi ve Damla Dijital PCR Kullanılarak

Biz sezyum klorür yoğunluk gradiyenti santrifüj arıtma için 0.22 mikron Sterivex filtreler, konsantre planktonik biyokütle yüksek molekül ağırlıklı genomik DNA çıkarılması için bir metodu tanımlar.

0.22 mcM Sterivex Filtreler ve Sezyum Klorür Yoğunluk Gradient Santrifüj DNA Ekstraksiyon

Mikrobiyal topluluk yüksek molekül ağırlıklı ve yüksek kalitede genomik DNA izole etmek için bir metodoloji tarif edilir.

Topraklar ve tortulları Yüksek Moleküler Ağırlık Genomik DNA çıkarımı

Öğrenin, parafin gömülü doku örneklerinden DNA izolasyonu için ksilen ile deparafinizasyon, etanol serisi ile rehidrasyon ve proteinaz K ile sindirim yöntemlerini. Bu protokol yüksek kaliteli DNA elde edilmesini sağlar.

Genetik ve epigenetik Analizleri Parafin Gömülü Malzeme DNA Ekstraksiyon

Daha fazla video keşfet