Imuno-fluorescência Ensaio de Leptospirose superfície exposta Proteínas

As proteínas de superfície bacteriana fazem contato direto com as células hospedeiras e também estão envolvidas na absorção de nutrientes do meio ambiente. Portanto, a localização superficial de proteínas bacterianas é um passo fundamental para a identificação de fatores de virulência. Aqui, um método para avaliar a exposição superficial de proteínas em aspirados de lepto intactos é apresentado em comparação com ensaios de imunofluorescência descritos anteriormente.

Os detalhes do método descritos aqui são projetados para minimizar a manipulação das células em um esforço para manter a integridade da membrana externa. A primeira suspensão espiral lepto é adicionada às lâminas da câmara de vidro. As lâminas são incubadas para permitir que as células adiram os pináculos lepto aderentes são fixados com aldeído paraforme 2% para preservar uma membrana externa intacta para avaliação da proteína de superfície, ou com 100% de metanol para permear a membrana externa para revelar proteínas subsuperficiais.

Os pináculos lepto fixos são então marcados com anticorpos específicos e visualizados por anticorpos secundários marcados com fluorescência. As proteínas localizadas na superfície podem ser marcadas e observadas em células intactas e permeáveis, enquanto as proteínas subsuperficiais só podem ser observadas em células permanentes. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da patogênese microbiana, como uma proteína localizada na superfície bacteriana, onde pode desempenhar um papel nas interações do patógeno hospedeiro.

O método aqui apresentado é projetado para minimizar a manipulação das células, o que deve ajudar a manter a integridade da membrana. Este método envolve uma concentração mais baixa de lavagem do agente fixador com membrana alterada, tampão estabilizador e menos etapas de lavagem do que os ensaios descritos anteriormente. Além disso, nosso método de imunofluorescência de superfície enfatiza a importância dos controles positivos e negativos, essenciais para uma interpretação precisa dos dados.

Demonstrando o procedimento estará a Dra. Maria Pinney, pós-doutoranda em meu laboratório. Leptospira Interrogans é um patógeno BSL dois. Trabalhar com células vivas requer manuseio e precaução adequados.

Um jaleco e luvas devem ser usados o tempo todo. Toda pipetagem e/ou manuseio de recipientes abertos de células vivas deve ser realizada em fluxo laminar. Capuz de biossegurança cultiva leptospira em meio EMJH suplementado com 1% de soro de coelho a 30 graus Celsius quando as bactérias atingem a fase logarítmica intermediária a tardia.

Aproximadamente seis dias depois, colher a cultura por centrifugação a 2000 vezes G por sete minutos em temperatura ambiente após a centrifugação. Remover o sobrenadante por aspiração e ressuspender suavemente o sedimento em PBS com cloreto de magnésio de cinco milimolares até uma concentração final de cinco vezes 10 elevado às oitavas células por mililitro. Ao lado de cada poço de duas lâminas de vidro da câmara do poço.

Adicione um mililitro da suspensão celular aqui. Uma lâmina de teste e uma lâmina de controle são preparadas para cada ensaio de proteína de superfície com o segundo poço usado para os controles, conforme mostrado aqui, incubar a 30 graus Celsius para permitir que as células adiram. Após 80 minutos, aspire cuidadosamente o líquido para remover as células não ligadas às lâminas de teste, que serão usadas para avaliar as proteínas expostas à superfície.

Adicione um mililitro por poço de 2% de formaldeído em PBS com cloreto de magnésio cinco milimolares para fixar as bactérias intactas restantes no vidro. Incubar por 40 minutos a 30 graus Celsius nas lâminas de controle, que serão usadas para avaliar as proteínas do subsolo. Fixe as células e permeie a membrana externa adicionando um mililitro de metanol 100% gelado a cada poço.

O metanol permeará a membrana externa, desnaturará as proteínas e fixará as células ao vidro. As lâminas incubam a menos 20 graus Celsius por 20 minutos. Aspirar os agentes de fixação após a fixação.

As células não são mais viáveis e não precisam ser manuseadas em um capuz de biossegurança. Para rotular as bactérias com anticorpos específicos, comece adicionando um mililitro de tampão de bloqueio a cada poço em todas as lâminas para bloquear a ligação não específica. Incube a 30 graus Celsius por 90 minutos.

Durante a incubação, diluir o anticorpo primário em tampão de bloqueio. Os anticorpos usados aqui são direcionados contra as proteínas de leptospira interrogans. O anticorpo MPL 54 reconhece uma proteína de membrana externa de 54 kilodalton exposta à superfície.

O anticorpo anti plano A reconhece a subunidade A do gelano periplasmático e o anticorpo anti OL um reconhece o lepto espiral poin, que é uma proteína da membrana externa. Prepare também os controles negativos diluindo soros de coelho pré-imunes ou fluido ascítico de camundongo que não contenha anticorpos no tampão de bloqueio. Após incubação por 90 minutos, remova o tampão de bloqueio por aspiração e adicione um mililitro de anticorpos primários diluídos ou cera de controle a cada poço incubar a 30 graus Celsius por uma hora.

Remova o líquido por aspiração e lave os poços três vezes com PBS, adicione um mililitro de anticorpos secundários marcados com LOR 4 88 a cada poço e a mancha de ácido nucleico fluorescente DPI diluída em tampão de bloqueio. Esta etapa garante a detecção da ligação de anticorpos e a presença de todos os spiro keets independentes da ligação de anticorpos, respectivamente. Incube as lâminas a 30 graus Celsius por 45 minutos.

Retirar o líquido por aspiração e lavar os poços duas vezes com PBS e uma vez com água destilada, retirar as câmaras e a fita adesiva das lâminas de vidro. Em seguida, seque as lâminas ao ar livre por cerca de 10 minutos. Adicione 20 microlitros de meio de montagem anti-desbotamento dourado prolongado para cada amostra no slide.

Em seguida, coloque uma lamínula de 24 por 50 milímetros e incube durante a noite em temperatura ambiente no escuro. Esta etapa é necessária para permitir que o meio de montagem cure. No dia seguinte.

Sele a lamínula com esmalte. Visualize a coloração por microscopia de fluorescência usando um filtro de detecção ciano ou azul para DPI e um filtro de detecção verde para LOR 4 88. Para garantir que uma representação precisa das amostras seja feita, certifique-se de avaliar toda a área da câmara para cada amostra.

Registre os dados criando imagens de um campo representativo para cada amostra. Ao fazer imagens do exor 4 88 fluorescência, use o mesmo tempo de exposição para todas as amostras. O uso de um tempo de exposição consistente permitirá uma comparação mais precisa dos resultados com antígenos de teste versus controles.

Certifique-se de avaliar toda a área da câmara para cada amostra antes de tirar conclusões. A análise de imunofluorescência foi realizada para avaliar a exposição superficial de MPL 54 em Leptospira inters. Como mostrado aqui, um forte sinal de fluorescência foi detectado.

Este sinal estava ausente nas células incubadas com soros pré-imunes, mas permaneceu consistente nas células permanentes. Se a proteína estiver na superfície, uma intensidade de fluorescência substancial será detectada em aspirações de lept intactas. Se a proteína estiver subsuperficial, ela só será detectada em células permeadas, geralmente em um teste positivo.

Aproximadamente a mesma intensidade de fluorescência é observada em células intactas e permanentes. Quando as células não permeáveis foram incubadas contra a proteína plana subsuperficial, uma coloração não foi observada, indicando que a membrana externa permaneceu intacta durante o experimento. Por conseguinte, pode concluir-se que o ML 54 está exposto à superfície quando se observa significativamente menos fluorescência nas células intactas do que nas células permeadas.

Ou a proteína está em um local subsuperficial com alguma coloração de fundo não específica de células intactas ou os anticorpos estão se ligando preferencialmente a epítopos não nativos que são expostos após o metanol permeável. Em ambos os casos, resultados ambíguos como esse requerem abordagens alternativas, como biotina de superfície ou proteólise de superfície, para determinar se a proteína está exposta à superfície ou não. Ao tentar este procedimento, é importante incluir um número suficiente de controles para garantir que a membrana alter permaneça intacta.

Esses controles incluem metanol sérico premium, células permanentes e anti-soro para proteínas subsuperficiais.