Detecção de vírus infecciosos de Campo mosquitos coletados por Vero Ensaio Cultura de Células

O objetivo geral deste procedimento é triar mosquitos coletados em campo para detecção de infecção viral por meio do ensaio de cultura celular Vero. Primeiro, os mosquitos coletados em campo são separados de acordo com a espécie. Em seguida, os mosquitos são homogeneizados utilizando um moinho de mistura.

Uma vez que os homogenatos de mosquito tenham sido preparados, as células Vero são cultivadas em preparação para o teste viral; cada cultura de células Vero é então inoculada com um único homogenato de mosquito, colocada em um agitador durante cinco minutos e, em seguida, incubada a 37 graus Celsius para permitir a propagação dos vírus. Por fim, as culturas são examinadas visualmente em busca de evidências de efeitos citopáticos induzidos por vírus. A principal vantagem desta técnica em relação a métodos existentes, como a R-T-P-C-R, é que ela permite o rastreamento de mosquitos para uma ampla diversidade de agentes virais que se multiplicam em cultura celular.

Esse método pode ajudar a responder perguntas-chave na área de entomologia médica, como os papéis que diferentes espécies de mosquitos desempenham no suporte à transmissão de vírus. Utilize uma instalação de nível de biossegurança dois para o seguinte procedimento. Coloque o saco de coleta contendo mosquitos vivos a menos 20 graus Celsius por 15 minutos para anestesiá-los.

Uma vez que os insetos estejam anestesiados, transfira o saco para um recipiente isolado contendo gelo seco e exponha os mosquitos ao dióxido de carbono por um a três minutos para garantir a imobilização completa. Em seguida, coloque os mosquitos sobre uma bandeja previamente resfriada sobre uma cama de gelo seco. Utilizando pinças de ponta fina, identifique os insetos fêmeas e transfira-os para copos plásticos individuais.

Fêmeas podem ser diferenciadas de machos pela análise das peças bucais e antenas. Selle as copas e coloque-as sobre gelo úmido. Utilizando um microscópio estereoscópico montado em uma mesa eletrônica refrigerada e uma chave taxonômica.

Identifique a espécie de cada lote de mosquitos, agrupando mosquitos da mesma espécie em frascos rotulados de dois mililitros com tampa de encaixe contendo uma esfera de cobre. Até 50 indivíduos podem ser reunidos em um único tubo conforme forem sendo preenchidos. Coloque os frascos em sacos rotulados dentro de um recipiente de isopor sobre gelo seco.

Após a identificação de todos os mosquitos, eles podem ser armazenados a menos 80 graus Celsius até a homogeneização. Utilize uma instalação de biossegurança nível três para este procedimento e trabalhe em uma cabine de biossegurança classe dois. Adicione cerca de um mililitro de PBSG por tubo e coloque os tubos contendo os mosquitos dentro de uma cassete pré-resfriada para moinho agitador.

Fixe a cassete carregada em um moinho de mistura e homogenize os pools de mosquitos por quatro minutos a 25 ciclos por segundo. Após a homogenização dos mosquitos, transfira os tubos para uma microcentrífuga refrigerada hermética contra aerossóis e centrifugue. O homogenato de mosquitos a 7.000 RPM durante seis minutos.

Os tubos após centrifugação podem ser armazenados a menos 80 graus Celsius até o teste do vírus. Deite o meio de cultura de um frasco T 175 de células confluentes de leitão em um béquer de resíduos contendo água sanitária. Adicione cinco mililitros de PBS ao frasco e lave as células uniformemente antes de deitar o PBS no béquer de resíduos.

Após lavar as células, adicione 2,5 mililitros de tripsina EDTA e incube o frasco a 37 graus Celsius e 5%CO2 por cinco minutos para destacar as células. Assim que as células forem destacadas, adicione cinco mililitros de MEM e pipete as células para cima e para baixo várias vezes para romper quaisquer agregados. Em seguida, adicione mais 15 mililitros de MEM.

Coloque 40 frascos T 25 em dois suportes dentro da cabine de segurança biológica e remova as tampas dos frascos, colocando-as diretamente à frente de cada frasco. Usando uma pipeta estéril, alíquota quatro mililitros de MEM em cada frasco. Em seguida, adicione 0,5 mililitro de células vari suspensas e tampe os frascos. Empilhe os frascos em uma bandeja e agite-os suavemente para garantir que o meio cubra uniformemente o fundo dos frascos.

Incube as culturas a 37 graus Celsius e 5%CO2 durante a noite ou até que as células atinjam 80 a 90% de confluência. Remova 20 frascos pequenos do incubador e rotule-os com o número de acesso correspondente de cada grupo de mosquitos. Decante a maior parte do meio de cada frasco para o descarte, deixando apenas o suficiente para cobrir a monocamada celular.

Transfira 100 microlitros de sobrenadante de cada homogenato de mosquito para o frasco respectivamente rotulado e feche bem os frascos. Após a transferência dos sobrenadantes, coloque os frascos em um agitador ajustado entre 35 e 40 RPM por cinco minutos. Retorne com os frascos para a cabine de segurança biológica e adicione quatro mililitros de meio de crescimento a cada um.

Tampe os frascos e incube-os a 37 graus Celsius e 5%CO2 por três a sete dias. Quando as culturas estiverem prontas para triagem, inspecione visualmente o meio primeiro. Meio turvo indica efeitos citopáticos induzidos por vírus ou contaminação com outros microrganismos, ou ambos; examine as culturas que apresentam meio turvo sob um microscópio óptico invertido.

Os vírus geralmente fazem com que as células fiquem deformadas e se desprendam dos frascos de cultura. Se for detectada contaminação por bactérias, leveduras ou fungos, ou se a cultura contiver grande quantidade de detritos de mosquito, reteste o pool original de mosquitos após filtrá-lo por uma seringa de 0,22 mícrons. Filtre e distribua assépticamente um a dois mililitros de meio provenientes de culturas positivas para vírus e não contaminadas por outros microrganismos em tubos criogênicos rotulados.

Armazene as amostras contendo vírus a menos 80 graus Celsius até a identificação, utilizando os ensaios diagnósticos apropriados com este ensaio. Nove tipos diferentes de vírus de quatro famílias taxonômicas foram recuperados de mosquitos coletados em Connecticut durante um período contínuo de vigilância estadual de 1997 a 2010. Vários desses vírus, incluindo o vírus da encefalite equina do leste e o vírus do Nilo Ocidental, são conhecidos por causar doenças em humanos.

Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como classificar, processar e triar mosquitos para infecção viral por meio do ensaio de cultura celular viral.