Name: Análise de biofilme oral de Palatal Expansores por fluorescência de hibridização in situ e microscopia confocal a laser Scanning (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-10-20T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 44 s
Description: Aprenda a analisar biofilmes orais de expansores palatais usando hibridização in situ por fluorescência e microscopia confocal a laser. Este método permite visualizar a estrutura e composição bacteriana tridimensional.

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Este trabalho foi apoiado pelo Fonds de Higiene da Universidade Médica de Graz. Todos os atletas deram o seu consentimento informado. Aprovação institucional do protocolo do estudo foi obtido a partir da Universidade Médica de Graz.

1. Coleta de amostras <ol><li> Remover fixa palatal expansores após 4 meses de serviço intra-oral. Use NOLA Sistema de campo seco para isolar os aparelhos antes de removê-los (Figuras 1 e 2). </li><li> Use um alicate esterilizado, luvas e bandejas para remover expansores sem adição de contaminação (Figuras 3 e 4). </li><li> Armazenar objetos em Sarstedt 120 ml frascos a -20 ° C. Leve para o laboratório em gelo e processo no prazo de 24 horas. </li></ol> 2. Fixação de biofilme <ol><li> Raspe biofilme flocos com um bisturi estéril, ou coletar peças com pinças esterilizadas. </li><li> Adicionar gelada 4% solução de PFA até amostra é bem cobertos. </li><li> Incubar a mistura a +4 ° C (não congelar) durante 3 a 12 horas. Vezes maior fixação ou temperaturas mais altas de fixação pode tornar a célula de envelopes gram-negativas células menos permeável a sondas de oligonucleotídeo. </li><li> Remoção da solução de PFA e lave com gelado 1X PBS. Repita este passo 2-3 vezes ao remove PFA residual. </li><li> Ressuspender a amostra em 1 vol. gelada 1X PBS e adicionar 1 vol. gelada-96% (v / v) de etanol. </li><li> Conservar a amostra a -20 ° C. Amostras fixadas de acordo com este protocolo pode ser armazenado por vários meses a anos. </li></ol> 3. Desidratação das amostras fixas <ol><li> Aplicar mL 50-30 de PFA fixa material de amostra para uma lâmina de microscópio. </li><li> Seco a 46 ° C por cerca de 15 min ou em temperatura ambiente por mais tempo. Descongele a lisozima ea formamida. </li><li> Adicionar 250 mL de lisozima (1mg/ml) em temperatura ambiente por 10 min, facilitando assim a penetração das sondas nas células por destruição parcial das paredes celulares. </li><li> Dip slides em 50%, 80% e 96% (v / v) de etanol por 3 min cada. O efeito desidratante da série concentração de etanol irão se desintegrar as membranas celulares. </li><li> Secar as lâminas a 46 ° C por 10 min. </li></ol> 4. Hibridização in situ <ol><li> Prepare 1 ml detampão de hibridação fresco (ver Tabela 1 para as concentrações). Formamida concentrações utilizadas neste estudo: 10% (EUBmix), 20% (Bac303, IGP, MUT590) ou 45% (LGCmix). </li><li> Descongele as soluções sonda de oligonucleotídeos. Sondas descongelados devem ser mantidos em gelo e protegido da luz. </li><li> Adicionar 2 mL de cada sonda a 200 mL de tampão de hibridação, misture bem e aplique a mistura para a amostra desidratada em uma lâmina de microscópio. </li><li> Coloque um pedaço de papel de tecido em uma placa de Petri quadrados e despeje o tampão de hibridação restantes para o papel de seda. </li><li> Colocar imediatamente a lâmina horizontalmente no prato e fechar o prato. Incubar em estufa a 46 ° C por 1-5 horas (90 min será suficiente na maioria dos casos). As funções prato como uma câmara de umidade evitando a evaporação da solução de hibridização do slide. Em particular, a evaporação de formamida pode causar não-específica sonda ligação a células não-alvo. </li><li> Prepare 50 ml de tampão de lavagem (ver Tabela 2 para concentrations). Prepare a solução de lavagem em um tubo de 50 ml e pré-aquecimento a 48 ° C em banho-maria. A etapa de lavagem é realizada a 48 ° C. </li><li> Retire o prato com a lâmina do forno de hibridização. Lave imediatamente o tampão de hibridação com um pequeno volume de pré-aquecido tampão de lavagem, e transferir o deslizar para dentro do tampão de lavagem restante. </li><li> Colocar o tubo contendo a solução de lavagem eo slide volta para o banho de água e incubar a 48 ° C por 10-15 min. </li><li> Remover slide do tubo e mergulhar gelada DDH 2 O por 2-3 segundos para eliminar a tampão de lavagem residual. </li><li> De ar seco a lâmina o mais rápido possível (o uso do ar comprimido é recomendado). Secagem rápida vai reduzir sonda dissociação. </li><li> Slides secas podem ser armazenadas no escuro a -20 ° C por várias semanas sem perda significativa de sonda-conferidos sinal de fluorescência. </li></ol> 5. Microscopia <ol><li> Depois de FISH e lavagem, apply duas gotas de perto antifadent para as extremidades esquerda e direita de um slide (fatias congelado deve ser aquecido à temperatura ambiente antes de esta etapa). </li><li> Coloque uma tampa microscópio escorregar em cima e espere até que o antifadent se espalhou por todo o slide. Note-se que uma quantidade excessiva de antifadent podem borrar a imagem de microscópio. </li><li> Observe as amostras sob um microscópio confocal de varredura a laser equipado com filtros adequados ou lasers. Nós usamos uma Leica TCS unidade (HCX PL APO/63x; NA 1.2). Os dados podem ser analisados ​​com software, tais como IMARIS ou AMIRA. </li><li> Slides embutidos em antifadent podem ser armazenados a +4 ° C (não congelar) por até 7 dias antes da sonda de fluorescência conferidos começa a declinar. Alternativamente, o antifadent pode ser removido com DDH 2 O, e as lâminas secas podem ser armazenadas a -20 ° C por um período prolongado de tempo. </li></ol> 6. Resultados representativos: Raspagem biofilme off aparelhos ortodônticos fixos (Figura 5) produz flocos adequado (Figura 6) que pode ser hibridizado diretamente sobre lâminas de vidro revestidas de microscopia. Desta forma, diferentes grupos de bactérias orobiome podem ser identificadas no seu ambiente tridimensional natural por rRNA marcação bacteriana com diferentes sondas marcadas específicas (Figuras 7 e 8). Na Figura 7, o biofilme foi corado com EUBmix (verde, todas as bactérias) e LGCmix (amarelo, Firmicutes). Firmicutes aparecem em verde, como eles foram coradas com amarelo e azul. Na Figura 8, o biofilme foi corado com EUBmix (vermelho, todas as bactérias), Bac303 (azul, Bacteroidetes) e IGP (amarelo, Porphyromonas gingivalis). Porphyromonas gingivalis é mostrado em branco amarelado, como todos os três sondas se ligam ao seu DNA e da sobreposição de cores resulta em um sinal branco. Diferenças morfológicas entre os grupos de bactérias também podem ser identificados (Figuras 9 e 10). Grandes aglomerados de bactérias cocóide são mostrados na Figura 9, onde a coloração foi realizada com EUBmix (verde, todos os bacteria). Formas diferentes de bactérias orais foram visualizados na Figura 10, onde as bactérias filamentosas cocóide e podem ser distinguidos pela coloração com EUBmix (vermelho). Além disso, uma estrutura em forma de cogumelo típico do biofilme pode ser processado através de modelagem em 3D dos dados CLSM (figuras 11 e 12) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/2967/Film1%20Klug%20Santigli%2001_2_JES_Web.mov">Clique aqui para assistir a um filme da modelagem 3D.</a> <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/2967/2967fig1.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Fixed expansor palatal in situ. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/2967/2967fig2.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Nola Sistema de campo seco. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/2967/2967fig3.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. Esterilizado alicates, luvas e bandeja. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/2967/2967fig4.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 4"> Figura 4. Removido expansor. <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/2967/2967fig5.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 5"> Figura 5. Scraping off biofilme com um bisturi estéril. <img alt="Figura 6" src="/files/ftp_upload/2967/2967fig6.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 6"> Flocos de resina Figura 6. Diretamente hibridizado em lâminas de vidro revestido. <img alt="Figura 7" src="/files/ftp_upload/2967/2967fig7.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 7"> Figura 7 imagem CLSM:. Diferenciação de um grupo específico de bactérias. Sobreposição de dados 2D em 3D CLSM pilha. Biofilme corado com EUBmix (verde, todas as bactérias) e LGCmix (amarelo, Firmicutes). <img alt="Figura 8" src="/files/ftp_upload/2967/2967fig8.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 8"> Figura 8 imagem CLSM:. Diferenciação de um grupo específico de bactérias. Sobreposição de dados 2D em 3D CLSM pilha. Manchada com biofilme EUBmix (vermelho, todas as bactérias), Bac303 (azul, Bacteroidetes) e IGP (amarelo, Porphyromonas gingivalis). <img alt="Figura 9" src="/files/ftp_upload/2967/2967fig9.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 9"> Figura 9 imagem CLSM:. Diferenciação de morfologias específicas. Sobreposição de dados 2D em 3D CLSM pilha. Biofilme corado com EUBmix (verde, todas as bactérias). Grandes aglomerados de bactérias cocóide (setas). <img alt="Figura 10" src="/files/ftp_upload/2967/2967fig10.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 10"> . Figura 10 imagens CLSM: diferenciação de morfologias específicas. Sobreposição de dados 2D em 3D CLSM pilha. Biofilme corado com EUBmix (vermelho, todas as bactérias). Cocóide (seta abaixo) e bactérias filamentosas (seta acima) podem ser distinguidas. <img alt="Figura 11" src="/files/ftp_upload/2967/2967fig11.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 11"> Figura 11. Mushroom estrutura, vistas 3D a partir de baixo. Pilhas de biofilme flocos (raspado a superfície de um aparelho ortodôntico), coradas com EUBmix e procedimentosssed com IMARIS (imagem CLSM). <img alt="Figura 11" src="/files/ftp_upload/2967/2967fig11.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 11"> Figura 12. Mushroom estrutura, vista lateral 3D. Pilhas de biofilme flocos (raspado a superfície de um aparelho ortodôntico) processados ​​com IMARIS (imagem CLSM). <table border="1"><tbody><tr><td colspan="4"> Tampão de hibridação (200 mL) </td></tr><tr><td> Concentração de formamida </td><td> 10% </td><td> 20% </td><td> 45% </td></tr><tr><td> 5 M NaCl </td><td> 36 </td><td> 36 </td><td> 36 </td></tr><tr><td> 1 M Tris-HCl </td><td> 4 </td><td> 4 </td><td> 4 </td></tr><tr><td> 2% SDS </td><td> 1 </td><td> 1 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> FA </td><td> 20 </td><td> 40 </td><td> 90 </td></tr><tr><td>2 O </td><td> 138 </td><td> 118 </td><td> 68 </td></tr><tr><td> Qualquer sonda FISH </td><td> 2 </td><td> 2 </td><td> 2 </td></tr></tbody></table> Tabela 1. Constituintes de tampão de hibridação (concentrações em mL). <table border="1"><tbody><tr><td colspan="4"> Tampão de lavagem (50 ml) </td></tr><tr><td> Concentração de formamida </td><td> 10% </td><td> 20% </td><td> 45% </td></tr><tr><td> 5 M NaCl </td><td> 4500 </td><td> 2150 </td><td> 300 </td></tr><tr><td> 1 M Tris-HCl </td><td> 1000 </td><td> 1000 </td><td> 1000 </td></tr><tr><td> 0,5 M EDTA </td><td> 0 </td><td> 500 </td><td> 500 </td></tr><tr><td> 2 O DDH </td><td> 44 500 </td><td> 46 350 </td> 48 200 </tr></tbody></table> Tabela 2. Constituintes de tampão de lavagem (concentrações em mL). Movie 1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/2967/Film1%20Klug%20Santigli%2001_2_JES_Web.mov">Clique aqui para assistir o filme.</a>

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Não há conflitos de interesse declarados.

O protocolo descrito aqui é uma abordagem altamente viável para biofilmes coloração coletados de materiais duros. Amostragem e hibridação são as etapas mais críticas. Durante a amostragem, os cuidados devem ser tomados para que as fatias de espessura adequada são coletados para garantir que a estrutura do biofilme permanece intacta. Durante a hibridização, é essencial para evitar flutuações excessivas de temperatura, evitando ligação não específica, ou perda de ligação, das sondas fluorescente etiquetado. Este protocolo FISH é um método elegante para a mancha biofilme heterogêneos normal diretamente em lâminas de vidro, sem interromper sua composição. Os slides podem ser imediatamente utilizado para microscopia sem precisar mover a amostra, mais uma vez. Desta forma, uma melhoria em relação a coloração em tubos é obtido pela força de cisalhamento menor sendo aplicada ao biofilme. Fatias de&gt; 50 mm de espessura podem ser preparados e investigados dessa forma.

análise de biofilme oral de palatal expansores por fluorescência de hibridização in situ e microscopia confocal a laser scanning

Oral Biofilm Analysis of Palatal Expanders by Fluorescence In-Situ Hybridization and Confocal Laser Scanning Microscopy

Microscopia de varredura confocal a laser (CLSM) do biofilme heterogênea natural é hoje facilitado por uma vasta gama de técnicas de coloração, sendo um deles hibridização fluorescente in situ (FISH). 1,2 Realizamos um estudo piloto em que as amostras coletadas de biofilme oral fixa aparelhos ortodônticos (palatal expansores) foram corados por FISH, com o objectivo de avaliar a organização tridimensional de biofilme naturais e acúmulo de placa. 3,4 FISH cria uma oportunidade para corar as células em seu ambiente nativo do biofilme com o uso de 16S fluorescente etiquetado rRNA de metas de sondas. 4-7,19 Em comparação com técnicas alternativas como a rotulagem de imunofluorescência, este é um barato, a técnica de rotulagem rigorosa e direto para investigar diferentes grupos de bactérias em biofilme consórcios mistos. 18,20 sondas foram usadas Geral que se ligam a Eubacteria ( EUB338 + + EUB338II EUB338III; seguir EUBmix), 8-10 Firmicutes (LGC354 AC;. LGCmix seguir), 9,10 e Bacteroidetes (Bac303) 11 Além disso, as sondas de ligação específico para Streptococcus mutans (MUT590) 12,13 e Porphyromonas gingivalis (IGP) foram usados ​​13,14 . A extrema dureza dos materiais de superfície envolvidos (aço inoxidável e resina acrílica) obrigaram-nos a encontrar novas maneiras de preparar o biofilme. Como estes materiais de superfície não poderia ser facilmente cortado com uma cryotome, vários métodos de amostragem foram exploradas para obter biofilme oral intacta. O mais viável dessas abordagens é apresentada na presente comunicação. Pequenos flocos da resina biofilme de transporte de acrílico foram raspados com um bisturi estéril, tomando cuidado para não danificar a estrutura do biofilme. Fórceps foram usados ​​para coletar biofilme das superfícies de aço. Uma vez coletadas, as amostras foram fixadas e colocado diretamente sobre lâminas de vidro revestidas polysine. FISH foi realizada diretamente sobre esses slides com as sondas mentioned acima. FISH vários protocolos foram combinados e modificados para criar um novo protocolo que foi fácil de manusear. 5,10,14,15 Posteriormente as amostras foram analisadas por microscopia confocal de varredura a laser. Bem conhecidos 3,4,16,17 configurações podem ser visualizados, inclusive cogumelo estilo de formações e aglomerados de bactérias cocóide permeado por canais. Além disso, a composição bacteriana do biofilme típico dessas estruturas foram analisados ​​e imagens 2D e 3D criado.

Nós apresentamos um protocolo para análise estrutural e de composição do biofilme oral natural de aparelhos ortodônticos com<em&gt; In situ</em&gt; Hybridization (FISH) e microscopia de varredura confocal a laser (CLSM). Amostras de biofilme oral foram coletados de expansores palatinos, raspagem de resina acrílica flocos de fora de sua superfície e encaminhá-los para o processamento molecular.

Análise de biofilme oral de Palatal Expansores por fluorescência de hibridização in situ e microscopia confocal a laser Scanning

A microscopia confocal de varredura a laser (CLSM) de biofilmes heterogêneos naturais é hoje facilitada por uma ampla gama de técnicas de coloração, sendo que uma delas...

O objetivo geral deste procedimento é obter biofilme oral nativo de expansores palatinos para hibridização in situ por fluorescência. Isso é realizado primeiramente removendo o expansor palatino, que contém o biofilme de quatro meses de idade proveniente do paciente. Em seguida, lascas de resina acrílica contendo o biofilme são raspadas do expansor palatino.Em seguida, a fluorescência na hibridização em dupla do biofilme fixado é realizada diretamente em lâminas revestidas. Por fim, a análise do biofilme corado é realizada por meio de microscopia confocal de varredura a laser. Ao final, a estrutura e composição das comunidades de biofilmes bacterianos são demonstradas por hibridização fluorescente in situ e microscopia confocal de varredura a laser. Tivemos pela primeira vez a ideia deste método quando encontramos biofilmes espessos em expansores ortodônticos visíveis a olho nu.Eles nos fizeram pensar nas possíveis associações entre eles e doenças periodontais. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área da microbiologia bucal, como a disposição espacial e a composição dos biofilmes orais nativos. O método é interdisciplinar e precisa ser realizado por diferentes especialistas.Portanto, Elizabeth é ortodontista e Barbara é bióloga de laboratório molecular para começar. Após quatro meses de superfície intraoral, utilizando o sistema de campo seco NOLA, isole o expansor palatino fixo para evitar contaminação. Remova o aparelho da boca do paciente usando pinças esterilizadas, luvas e bandejas.Armazene os objetos em frascos de 120 mililitros a menos 20 graus Celsius. Transporte-os para o laboratório sobre gelo e processe dentro de 24 horas para fixar os espécimes. Remova lascas de biofilme com uma lâmina estéril ou colete pedaços com pinça estéril.É fundamental raspar lascas de resina acrílica de espessura adequada para garantir que a estrutura do biofilme permaneça intacta em temperatura gelada. Solução de 4% de paraformaldeído até que a amostra esteja bem coberta. Incube a mistura a quatro graus Celsius por três a 12 horas.Tempos mais longos de fixação ou temperaturas mais altas de fixação podem tornar os envelopes celulares de células gram-negativas menos permeáveis a sondas de oligonucleotídeos. Após a incubação, remova a solução de paraformaldeído e lave com PBS gelado uma vez. Repita este passo duas a três vezes para remover o paraformaldeído residual, transfira a amostra para um volume de PBS gelado uma vez e adicione um volume de etanol gelado a 96%. Armazene a amostra a menos 20 graus Celsius.As amostras podem ser armazenadas por vários meses a anos para desidratar a amostra. Primeiro, aplique de cinco a trinta microlitros de material da amostra fixado com paraldeído em um microscópio. Seque a amostra por 15 minutos a 46 graus Celsius ou por um período mais longo à temperatura ambiente enquanto a amostra estiver secando, para que a lisozima e a formamida quebrem parcialmente as paredes celulares.Para melhor entrada das sondas, adicione 250 microlitros de uma solução de um miligrama por mililitro de lisozima durante 10 minutos à temperatura ambiente, mergulhe as lâminas em etanol 50, 80 e 96% por três minutos cada. O efeito desidratante da série de concentrações de etanol desintegrará as membranas, facilitando a captação da sonda oligonucleotídica. Por fim, seque as lâminas a 46 graus Celsius para realizar a hibridização in situ U.Inicie preparando um mililitro de tampão de hibridização fresco e pré-aqueça-o a 47 graus Celsius. Deixe as soluções de sondas oligonucleotídicas descongelarem no gelo e mantenha-as protegidas da luz. Coloque um pedaço de papel de filtro em uma placa de Petri quadrada e pipete 800 microlitros do tampão de hibridização sobre o papel de filtro.Feche a câmara novamente imediatamente, pois o tampão contém formamida; adicione dois microlitros de cada sonda a 200 microlitros do restante do tampão de hibridização. Misture bem e aplique a mistura imediatamente sobre a amostra desidratada em uma lâmina de microscopia; coloque a lâmina horizontalmente no recipiente e cubra-a. Incube o recipiente em estufa por uma a cinco horas a 46 graus Celsius.O recipiente atua como uma câmara de umidade, impedindo a evaporação da solução de hibridização da lâmina. Em particular, a evaporação da formamida pode causar ligação não específica da sonda a células não-alvo. Prepare 50 mililitros de tampão de lavagem e aqueça-o a 48 graus Celsius em banho-maria.Retire o recipiente com a lâmina do forno de hibridização. Lave imediatamente o tampão de hibridização com um pequeno volume de tampão de lavagem pré-aquecido e transfira a lâmina para o tampão de lavagem restante. Coloque o tubo contendo o tampão de lavagem e a lâmina de volta no banho-maria e incube por 10 a 15 minutos a 48 graus Celsius.Para corar as amostras com mais de uma sonda, repita os passos anteriores após a remoção do tampão de lavagem, tendo o cuidado de começar com a forma mais alta em uma concentração suave. Remova a lâmina do tubo e mergulhe no gelo.Água destilada fria por dois a três segundos. Para eliminar o tampão de lavagem residual, seque a lâmina ao ar o mais rapidamente possível, pois a secagem rápida reduz a dissociação da sonda.Armazene as lâminas secas no escuro a menos 20 graus Celsius por várias semanas sem perda significativa do sinal de fluorescência conferido pela sonda. Para imaginar as amostras, aplique duas gotas do reagente Antifa próximo às extremidades esquerda e direita de uma lâmina e, em seguida, adicione uma lamínula. Observe as amostras em um microscópio confocal de varredura a laser equipado com filtros ou lasers apropriados; as lâminas podem ser armazenadas a quatro graus Celsius por até sete dias, ou podem ser lavadas com água bidestilada e armazenadas a menos 20 graus Celsius por períodos mais longos.É a raspagem de biofilme de aparelhos ortodônticos fixos. Você obterá fragmentos adequados que podem ser hibridados diretamente em lâminas de vidro revestidas para microscopia, de modo que diferentes grupos do microbioma oral, incluindo bactérias em configuração tridimensional, podem ser identificados por meio de sondas específicas. Nesta figura, o biofilme foi corado com EUB mix e LGC mix, sendo que firmacutas aparecem verdes, pois foram coradas com amarelo e azul.Aqui, o biofilme foi corado com a mistura EUB 3 0 3 e POIG. Bactérias do grupo Bactérias DTS aparecem em rosa e púrpura. Porphyromonas gingivalis é mostrada em branco amarelado, pois os três sondas se ligam ao seu DNA e a sobreposição de cores resulta em um sinal branco morfológico.As diferenças entre grupos de bactérias também podem ser identificadas, bem como certas estruturas, como grandes aglomerados de bactérias cocos. Exemplos de tais aglomerados são mostrados aqui, onde a mistura EUB foi utilizada para coloração. Além disso, uma estrutura típica semelhante a um cogumelo do biofilme pode ser processada por meio de modelagem 3D dos dados de CLSM.Esta é uma animação 3D do biofilme corado com EUB. Este método pode fornecer informações sobre a formação de biofilme induzida ortodonticamente. Também pode ser aplicado a qualquer outra superfície artificial no corpo humano que carregue estruturas complexas de biofilme com possível patogenicidade.Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como preparar biofilmes orais nativos para hibridização com fluorescência em C dois e microscopia confocal a laser. É importante lembrar que esta é uma área interdisciplinar e que você só pode ter sucesso em equipe. Portanto, trate sempre seus colegas com respeito.

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