RNA İçeren Exosomes İzolasyonu ve Karakterizasyonu

Aşağıdaki deneyin genel amacı, ilgilenilen hücrelerin ve biyolojik sıvının eksozom içeren RNA'yı serbest bırakıp bırakmadığını veya içerip içermediğini belirlemektir. Eksozomları izole etmenin ilk adımı, hücreleri ve hücre kalıntılarını uzaklaştırmaktır. Daha sonra, süpernat daha sonra daha büyük parçacıkları uzaklaştırmak için filtrelenir.

Eksozomlar daha sonra ikinci bir adım olarak ultrasantrifüjleme yoluyla peletlenir. Eksozomlar, izole edilen veziküllerin eksozomların morfoloji boyutuna ve protein bileşimine sahip olduğunu göstermek için elektron mikroskobu, akış sitometrisi ve batı kan analizi ile karakterize edilir. Daha sonra RNA, saflaştırılmış eksozomlardan izole edilir.

Hangi RNA'nın, eksozomların saflaştırılması, tespiti ve karakterizasyonu için bu iyi bilinen yöntemlerle elde edilen sonuçları içerdiğini belirlemek için, eksozomların biyolojik işlevleri gibi daha fazla çalışmayı kolaylaştırabilir. Bu sunum size eksozomların farklı yollarla nasıl izole edilebileceğini gösterecek ve bunu sunacak olan iki kişi benim iki doktora öğrencim Maria, El ve Cecelia. Er.İyi şanslar.

İnsan kütle hücre hattı, HC olanı, eksozomları izole etme prosedürünü başlatmak için bu eksozom izolasyon gösterisi için kullanılır. İlk olarak, eksozom içermeyen serum ile hücreleri orta derecede büyütün. Daha sonra hücre süspansiyonunu konik tüplere aktarın ve dört santigrat derecede 10 dakika boyunca 300 kez G'de santrifüjleyin.

Hücreleri peletlemek için süper adı ultra santrifüj tüplerine aktarın ve hücreleri ve hücre kalıntılarını daha da uzaklaştırmak için numuneyi dört santigrat derecede 20 dakika boyunca 16.500 kez G'de santrifüjleyin. Ardından, 200 nanometreden daha büyük parçacıkları daha fazla uzaklaştırmak için SANE'yi 0,2 mikronluk bir filtreden geçirin. Son olarak, süzülmüş aklı selim içeren ultrasantrifüj tüpleri, eksozomları peletlemek için dört santigrat derecede 70 dakika boyunca 120.000 kez G'de bir ultrasantrifüj ile kapatılır.

Eksozomlar, ultrasantrifüj tüpünün kesilmesi, snat'ın atılması ve eksozomla zenginleştirilmiş peletin yeniden askıya alınmasıyla elde edilir. Maksimum eksozom alımı için. Resus, eksozomla zenginleştirilmiş peleti, uygun bir tamponun küçük bir hacminde tekrar tekrar bir eend orph tüpüne süspanse eder.

Bir öncekiyle aynı hacimde ek tampon ile iki kez durulayın. Tampon, eksozomu takip eden deneylerin türüne bağlıdır. Yalıtım. Elektron mikroskobu için, bozulmamış eksozomlardan yaklaşık 10 mikrogram ekzozomal protein kullanın.

PBS'de yeniden askıya alındı. Karbon kaplı nikel ızgara elektron mikroskobu, eksozomlar yalnızca boyut morfolojisine dayalı olarak tanımlanabildiğinden, immün boyama olmadan gerçekleştirilebilir. Bununla birlikte, anti CD 63 veya anti MHC Sınıf iki gibi bir birincil antikorun kullanılması ve ardından 10 nanometre altın etiketli ikincil antikorların kullanılması önerilir.

Eksozomlar mevcut akış sitometri ekipmanı tarafından tespit edilemeyecek kadar küçük olduğundan, önce eksozomları antikor kaplı boncuklara bağlamak gerekir. Ekzozomal hücresel kökene bağlı olarak, farklı antikorlar manyetik veya lateks boncuklara bağlanır. Bu gösterimde, her numune için anti CD 63 kaplı lateks boncuklar kullanılacaktır.

Bozulmamış eksozomun 30 ila 40 mikrogram ekzomal proteinine eşit bir hacim kullanın. PBS'de asılı kalan eksozomları, hafif hareket altında gece boyunca dört santigrat derecede boncuklar halinde inkübe edin. Ertesi gün 300 mikrolitre 200 milimolar glisin eklenerek bloke edildi ve 30 dakika inkübe edildi.

Eksozom boncuk kompleksini iki kez yıkayın ve eksozom boncuk komplekslerini dört santigrat derecede 50 mikrolitre IgG antikoru ile inkübe edin. Eksozom boncuk komplekslerini iki kez yıkayın, ekzom boncuk komplekslerine 90 mikrolitre, yıkama tamponu ve tercih edilen 10 mikrolitre antikor ekleyin ve karanlıkta 40 dakika inkübe edin. Nazik hareket altında, ekzom boncuk komplekslerini iki kez yıkayın, 300 mikrolitre yıkama tamponu ekleyin ve numuneleri akış sitometri tüplerine aktarın ve akış sitometrisi kullanarak veri elde edin.

Bu western blot gösterimi, Western blot ve kullanılan farklı antikorlardan önce uygun bir protein izolasyonunun önemine odaklanacaktır. Eksozom peletini tercih edilen protein lizis pufunda çözün ve pipetleyin, ardından eksozomları daha da ilerletmek için girdap karıştırın, numuneyi bir su banyosunda sonikleştirin, numuneyi beş dakika boyunca 13.000 kez G santrifüjleyin ve SANE'yi yeni bir einor tüpüne aktarın. Toplam proteini tercih edilen bir yöntemle ölçün ve proteini jelin üzerine yükleyin.

Daha sonra proteinleri jel elektroforezi ve elektro lekeleme bloğu ile ayırın ve aktarın ve eksozom spesifik belirteçler olmadığı için eksozomlarla zenginleştirilmiş proteinlere karşı immün boyama yapmadan önce zarı yıkayın. Tüm farklı hücresel kökenlerden eksozomlar açısından zenginleştirilmiş proteinler, eksozom tespiti için yaygın olarak kullanılır. Bunlar tetraspaninler, örneğin CD dokuz, CD 63 ve CD 81 gibi proteinlerdir.

Ezrin gibi hücre iskeleti ile ilişkili proteinler ve TSG 1, 0, 1 ve LY gibi multiveziküler biyogenezde yer alan proteinler, negatif kontrol olarak, endoplazmik retikulumdan kexin ve GRP 78 gibi diğer bölmelerden veziküllerde yaygın olarak bulunan kontamine proteinleri kontrol eder. Planlanan deneylere bağlı olarak farklı RNA izolasyon kitleri kullanılabilir. Bu gösterimde, RNA izolasyonu gerçekleştirilirken kolon tabanlı bir yöntem kullanılacaktır.

Nükleik asit ve nükleaz içermeyen pipet uçları kullanmak ve hem tezgahı hem de ekipmanı kirleticilerden ve RNA'lardan arındırmak önemlidir. Eksozom peletini 350 mikrolitre lizis çözeltisi içinde çözün ve numuneyi girdaplayın. 200 mikrolitre% 95 etanol ekleyin ve bir girdap kullanarak karıştırın.

Bir toplama tüpüne bir sütun yerleştirin ve parçalanmış eksozomları sütuna aktarın ve santrifüjleyin Kolonun kuru olduğundan emin olmak için 400 mikrolitre yıkama solüsyonunda üç kez yıkayın. Son yıkamadan sonra 14.000 kez G'de iki dakika santrifüjleyin ve kuru sütunu RNA'sız bir eend rph tüp eline yerleştirin. Ekstrakte edilen toplam ekzozomal RNA'nın tespiti ve analizi için 50 mikrolitre elucian tamponundaki RNA.

Bir Agilent 2100 biyoanalizörü, eksozomlar mevcut akış sitometrisi yöntemleriyle tespit edilemeyecek kadar küçük olduğundan, RNA 6.000 nano veya RNA 6.000 piko kiti ile birlikte kullanılabilir. Analiz edilmeden önce antikor kaplı boncuklara bağlanırlar. Bu eksozom boncuk kompleksleri bir akış sitometrisini toplayabildiğinden, dağılım grafiği tek, ikili ve üçlü eksozom boncuk komplekslerinin farklı popülasyonlarını içerebilir.

Burada gösterildiği gibi, ok, daha fazla analiz edilen popülasyon olan tek eksozom boncuk komplekslerinin popülasyonunu gösterir. Bir akış sitometrisi histogramı, CD 63 proteini için pozitif olan tek bir eksozom boncuk popülasyonunu gösterir. Açık eğri ne kadar sağa doğruysa, CD 63 için örnek o kadar pozitiftir.

Eksozomların küçük boyutları nedeniyle, sadece elektron mikroskobu ile görselleştirilebilirler. Eksozomların tipik morfolojik özellikleri arasında yuvarlak şekilli 30 ila 100 nanometre boyutunda veziküller bulunur. CD 63 için altın liberal antikorlu bir eksozom immüno boyası, Arrow Western blot ile gösterilmiştir.

Sonuçlar, ekzomal örnekte endoplazmik retikulum proteini calnexin'in yokluğunu gösterir, ancak eksozomlar açısından yaygın olarak zenginleştirilmiş bir protein olan CD 81'deki tetraspanın varlığını gösterir. Hücresel RNA esas olarak, bu biyoanalizör analizinde solda görülen 18 s ribozomal RNA alt birimi ve sağda görülen 28 s alt birimi için iki tepe noktası olarak görülen ribozomal RNA içerir. Bununla birlikte, ekzozomal RNA'lar, çok az ribozomal RNA içerdikleri veya hiç içermedikleri ve kısaca haberci, RNA ve mikro RNA gibi RNA'lar bakımından zenginleştirildikleri için profillerinde farklılık gösterir.

İzolasyonu doğru yapıldığı takdirde yaklaşık üç saat içinde gerçekleştirilebilir. Bu yöntemi kullanırken, daha büyük ic'lerin kirlenmesini önlemek için dosyalama yapılmaması da dahil olmak üzere tüm adımları gerçekleştirmek önemlidir. Bu tekniğin geliştirilmesinden sonra, eksozomları hem biyokimyasal hem de biyolojik olarak karakterize etmek çok daha kolay hale geldi.

Ayrıca, farklı sistemlerde eksozom aracılı hücreden hücreye iletişim hakkında çok daha fazla şey öğrendik. Ayrıca teknik, eksozomların farklı hastalıklar için biyobelirteç olarak geliştirilmesini mümkün kılmıştır. İlginiz için çok teşekkür ederim.