Name: 확인을 위해 Allelotyping PCR 살모넬라 enterica serovars Enteritidis, 해더, 하이 델베르크, 그리고 Typhimurium (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-07-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 18 s
Description: 학습하세요 Salmonella enterica의 다중 PCR을 이용한 신속한 혈청형 분석 방법을. Enteritidis, Hadar, Heidelberg, Typhimurium을 식별하여 식품 안전 및 역학 연구에 활용할 수 있습니다.

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이 작품은 USDA 보조금 1999-35212-8680, 2005-01378, 그리고 2010-04288-01, USDA 수식 자금과 조지아의 동물용 의약품 농업 연구 부여의 국가에 의해 지원되었습니다. 본 출판물에 설명된 프로토콜은 감독 연구 과정의 일환으로 학부에서 사용하기 위해 개발되었습니다 : MIBO 4900L, 진 4960H, BCMB 4960L, 그리고 조지아 대학에서 BIOL 4960H와 모러 여러 분자 역학 연구 프로젝트에 학생들이 사용하는 실험실. 우리는 연구 학부 교육을 통합하는 노력을 지원하기위한 많은 학부 모러와 리 연구소에서 연구를 수행한 학생 및 부서 의자, 존 글리슨 감사하고 싶습니다.

<ol><li>Dauga, C., Zabrovskaia, A., Grimont, P. A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Restriction+fragment+length+polymorphism+analysis+of+some+flagellin+genes+of+Salmonella+enterica%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Restriction fragment length polymorphism analysis of some flagellin genes of Salmonella enterica.</a> J. Clin. Microbiol. 36, 2835-2843 Forthcoming.</li>
<li>Hong, Y., Liu, T., Lee, M. D., Hofacre, C. L., Maier, M., White, D. G., Ayers, S., Wang, L., Berghaus, R., Maurer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+screen+of+broth+enrichments+for+Salmonella+enterica+serovars+Enteritidis%2C+Hadar%2C+Heidelberg%2C+and+Typhimurium+using+an+allelotyping+multiplex+PCR+that+targets+O+and+H+antigen+alleles%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Food+Prot%22%5BJournal%5D)">A rapid screen of broth enrichments for Salmonella enterica serovars Enteritidis, Hadar, Heidelberg, and Typhimurium using an allelotyping multiplex PCR that targets O and H antigen alleles.</a> J. Food Prot. 72, 2198-2201 (2009).</li>
<li>Hong, Y., Liu, T., Lee, H. ofacre, Maier, C. L., White, M., Ayers, D. G., Wang, S., Berghaus, L., R, M. aurer <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((J.Rapid+screening+of+Salmonella+enterica+serovars+Enteritidis%2C+Hadar%2C+Heidelberg+and+Typhimurium+using+a+serologically-correlative+allelotyping+PCR+targeting+the+O+and+H+antigen+alleles%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Microbiol%22%5BJournal%5D)">J.Rapid screening of Salmonella enterica serovars Enteritidis, Hadar, Heidelberg and Typhimurium using a serologically-correlative allelotyping PCR targeting the O and H antigen alleles.</a> BMC Microbiol. , (2008).</li>
<li>Liu, T., Liljebjelke, K., Bartlett, E., Hofacre, C. L., Sanchez, S., Maurer, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+nested+PCR+to+detection+of+Salmonella+in+poultry+environments%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Food+Prot%22%5BJournal%5D)">Application of nested PCR to detection of Salmonella in poultry environments.</a> J. Food Prot. 65, 1227-1232 (2002).</li>
<li>Maurer, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+detection+and+limitation+of+molecular+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Rev.+Food+Sci.+Tech%22%5BJournal%5D)">Rapid detection and limitation of molecular techniques.</a> Ann. Rev. Food Sci. Tech. 2, 259-279 (2011).</li>
<li>Moscoso, H., Alvarado, I., Hofacre, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+analysis+of+infectious+bursal+disease+virus+from+bursal+tissues+collected+on+FTA+filter+paper%5BTitle%5D)+AND+%22Avian+Dis%22%5BJournal%5D)">Molecular analysis of infectious bursal disease virus from bursal tissues collected on FTA filter paper.</a> Avian Dis. 50, 391-396 (2006).</li>
<li>Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSambrook%2C+J+%22Molecular+cloning%3A+a+laboratory%22">Molecular cloning: a laboratory</a>. , 2nd ed, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, N.Y. (1989).</li>
<li>Wittwer, C. T., Fillmore, G. C., Hillyard, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+polymerase+chain+reaction+capillary+tubes+with+hot+air%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Automated polymerase chain reaction capillary tubes with hot air.</a> Nucleic Acids Res. 17, 4353-4357 (1989).</li>
</ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

속 (예 : invA)에 고유한 살모넬라균 대상 유전자의 검출을위한 대부분의 상용 PCR 검사. 그러나, 모든 살모넬라균 동물 인구의 인간이나 유행에 질병을 일으킬 능력 같은 것입니다. 살모넬라 LPS O - 항원과 flagellinH1 및 H2의 항원에 antigenic 차이의 조기 인식이 antigenic 차이에 따라 2,500여 serovars에 살모넬라균의 분화로 연결했다. 속 살모넬라균에서 확인된 46 독특한 O 항원과 독특한 flagellin 86 (H) 항원이있다. 살모넬라균 하나 (H1) 또는 두 가지 (H1 &amp; H2) flagellins을 가지고 있습니다. O, H1, 그리고 2500 살모넬라균의 serovars에 대한 H2의 항원 계정의 다양한 조합이 오늘 인정. serovar는 개별 O 및 H의 항원의 확인에서 파생된 antigenic 수식을 기반으로 할당됩니다. antigenic 수식은 O로 기록됩니다 : H1 : H2, 그리고 어디에가 &quot;-&quot;O - 항원에 대한 부정적인 살모넬라균에 대한 H1 H2 또는 flagellin 및 &quot;NT&quot;(비 typeable)의 부재를 의미합니다. 예를 들어, serovar Typhimurium의는 S. 할당됩니다 Enteritidis가 수식 D1과 분리 부여하는 동안 1,2 : I : enterica은 antigenic 수식 B로 분리 G, 미터 : -. 살모넬라균 인구에서이 antigenic 유사 따라서 쉽게 PCR에 의해 악용될 수있는 뉴클레오 티드 수준 차이의 외적 발현이다. 우리는 식별 S.위한 allelotyping PCR을 개발하기 위해 구체적인 O 및 H의 대립 유전자와 관련된 유전자 차이를 발견했습니다 enterica serovars : Enteritidis, 해더, 하이 델베르크, 그리고 Typhimurium (3). , 해더 (C2 : z10 : E, N, X), 하이 델베르크 (B - H1 : Enteritidis에 대한 H2의 antigenic 수식을 (D1 : G, M) 살모넬라균 serovar의 올바른 할당과보고 O와 관련된 모든 대립 유전자에 대한 검사가 필요합니다 : R : 1,2), 그리고 Typhimurium (B : I : 1,2). O의 allele 또는 항원, H1 g의 발견에 대한 지식이없이는 혼자 미터 allele 반드시 살모넬라균은 다른 살모넬라균의 serovars로 Enteritidis로 분리 식별하지 않습니다 Agona, 캘리포니아, 그리고 몬테비데오, 또한이 같은 allele을 가지고. allelotyping PCR 원래 포어가 살모넬라균의 serovars 언급 감지하도록 설계되었습니다 동안이 검사는 추가로 19 serovars를 (표 3) 확인할 수 있습니다. 우리 allelotyping PCR 원래 O 및 H 대립 유전자를 감지하도록 설계되었습니다. 우리는 O - 특정 antisera를 사용하여보다는 분리된 살모넬라균 문화와 함께 작업하면 O allelotyping PCR를 수행, 슬라이드 응집 검사로 O - 항원을 식별하기위한 연습에,보다 실용적이고 비용 효과가있다. 그러나, 우리는 당신의 실험실 화면 (2) 또는 살모넬라균이 FTA 카드 (6)에 제출한 격리 입력이 PCR을 사용하는 경우 O allelotyping PCR를 사용하는 것이 좋습니다, 그리고 샘플의 첫 번째 화면과 살모넬라균 특정 PCR (4 포함하지 ). PCR 또는 생화학 / antigenic 시험에 의해 살모넬라균으로 확인하는 경우에만 해당 샘플에 allelotyping의 PCRs을 제한합니다. 이 문서에서 설명하는 프로토콜은 아이다호 기술 Rapidcycler 한 많은 가열 블록 thermocyclers보다 짧은 시간 안에 반응 볼륨과 실행의 반응 조건을 확장할 수있는 핫 공기 thermocycler와 함께 사용하기위한 최적화되었습니다. 프라이머의 농도를 조정,, 또는 MgCl 2 농도를 조정 가열 블록 thermocycler와 함께 사용하기 위해이 프로토콜을 적응하기 위해서는 낮추는 / 어닐링 온도를 높여 경험적으로 반응 조건을 최적화해야 할 수 있습니다. 예를 들어, 우리는 MJ 연구 PTC - 200 thermocycler는 다음에 대한 프로토콜을 적응 있었다. 표 1에 설명되어있는 동일한 반응 볼륨 작업, concentrationof는 I 프라이머 세트는 2.5 μm의로 희석되었다 작업 주식은, 어닐링 온도 55 ° C 45 ° C, 그리고 인큐베이션 변성에 시간, 소둔 및 확장 단계에서 저하되었다 I / G, M allelotyping PCR 20 s의 길어되었습니다. 해당 긍정과 부정 컨트롤을하는 것이 출판 프로토콜을 포함하여 PCR의 초기 시작 설치 및 최적화에 필수적입니다. , 해더 (C2 : z10 : E, N, X), 하이 델베르크 (B : R - Enteritidis (D1 : G, M) 우리는 특별히 Anatum (: E, H 1,6 E1), 알려진 살모넬라균의 serovars을 획득하는 것이 좋습니다 : 1,2), 몬테비데오 (C1 : G, M, S : 1,2,7)과 Typhimurium (B : I : 1,2) 및 실험실 대장균 K12 변형 (DH5α, LE393, JM109 등 ) 각각이 문서에서 설명하는 allelotyping PCR 검사에 대한 긍정적이고 부정적인 컨트롤로. 이 살모넬라균의 serovars 몇 가지 테스트하는 allele에 따라 긍정적이거나 부정적인 중 컨트롤 역할을합니다. 특정주의 사항 및 가이드라인이와 다른 진단 PCR을 수행하는 동안 다음해야합니다. 첫째, 물리적 분리템플릿 준비, PCR은 셋업 및 겔 전기 영동 가능한 PCR을 오염과 거짓 - 탐지 잘못된보고 이월 방지에 중요합니다. 이러한 컨트롤들이 발생으로 문제를 파악하고 결과 (5)의 해석에 도움로서뿐만 아니라, 적절한 컨트롤의 포함은 일상적인 PCR에 필요합니다. 가장 중요한 일관성 특히 amplicon 크기의 amplicon (PCR 제품) 검색 andestimation에 대한 전기 조건에 관련하여, 필수입니다. 이 지점을 설명하기 위해, 우리는 의도적으로 그림 1A에서 예정보다 일찍 전기 영동을 일시 중지. 분자량 표준 (차선 1 13)와 긍정적인 제어 (레인 2) 충분히 정확하게 크기를 추정하거나 크기 작은 차이 (~ 50 BP)가있다 DNA 조각의 분리를 관찰하는 분리되지 않습니다. DNA 조각의 적절한 분리, 특히 분자량 기준은 반응을보고하는 것은 amplicon의 크기와 때로는 어떤 PCR의 일일 실행 (5 관찰이 아닌 특정 amplicons의 구분 &quot;진정한 긍정&quot;의 정확한 평가에 따라 달라집니다로 필수적입니다 ). 예를 들어, 그림 1B, 레인 7 (크기 ~ 700 BP)에서 불특정 amplicon있다. 염료 앞에는 아가로 오스 겔의 중간 지점에서만되었을 때 전기, 너무 일찍 중단했다, 500 BP와 700 BP의 DNA 조각 사이에 약간의 차별이있을 것입니다. 따라서, 레인 7 예제는 잘못 I와 G, m의 대립 유전자 모두에 대해 같은 긍정적인보고되었습니다 것입니다. 마지막 하나는 모든 테스트와 관련된 한계를 인식해야합니다. 1.5,, 1,6, 1,7 항원 복합, E, N, X / E H1/H2 allelotyping PCR 중 일부는 H2 1,2에 속하는 대립 유전자의 미묘한 유전적 차이를 분별하는 차별적인 힘 (권력)이 없어 , N, G, m의 allele을 포함 z15 항원 복잡하고 H1 G의 항원 복합. 다른 epitopes이 flagellar 항원에 존재에 대해 하나 또는 두 개의 아미노산의 변화는 계정. 우리가 flagellin 유전자 시퀀스 (3) 이러한 때로는 단일 기본 쌍 차이를 이용할 수 primers를 디자인하는 것은 그러므로 힘들었다. 예를 들어, 살모넬라균 serovars 더블린 (D1 : G, P : -)과 베르타은 (D1 : F, G, T : -) primers를 mallelotyping, 우리의 g와 함께 PCR 양성하고 있습니다. , 브래드 포드 (1.5 : : R B)에서, 하이 델베르크 (1,2 B : R) 라고스 (: I 1.5 B)에서 H2 allelotyping의 primers는 Typhimurium를 (1,2 : I B) 구분 수 없습니다 Glostrup에서 (C2 : z10 : E, N, z15) Winneba (B : R : 1,6) 또는 리모 (B ​​: R : 1,7) 또는 해더 (E, N, X C2 : z10). 이러한 serovars의 일부를 발생의 가능성이 있지만 : 라고스, 브래드 포드, Winneba, 리모 또는 Glustrup가 원격이고, 그것은 가능성이며, 어느 시험 &#39;제한 또는 다른 확실한 테스트 조건을 제공합니다. 결론적으로,이 PCR 기반 serotyping가 급격히 S.를 식별하는 enterica serovars Enteritidis, 해더, 하이 델베르크와 Typhimurium, 그리고 O, H1, H2 및 대립 유전자의 19 serovars 추가와 관련된. 이 분석은 serotyping의 살모넬라균 전통 미생물 접근하기 위해 신속하고 비용 효율적인 대안입니다.

<table border="1"><tbody><tr><th> 재료 이름 </th><th> 유형 </th><th> 회사 </th><th> 카탈로그 번호 </th><th> 논평 </th></tr><tr><td> Luria Bertani </td><td></td><td> 어부 </td><td></td><td> (또는 유사한 소스) </td></tr><tr><td> Microfuge 튜브 </td><td> 1.5 ML 용량 </td><td> 어부 </td><td></td><td> (또는 유사한 소스) </td></tr><tr><td> 에탄올 </td><td> 200 증명 </td><td> 어부 </td><td></td><td> (또는 유사한 소스) </td></tr><tr><td> DH 2 O </td><td> 분자 생물학 그라드 </td><td> 시그마 </td><td></td><td> (또는 유사한 소스, PCR 전용) </td></tr><tr><td> 10 × PCR 버퍼 : </td><td> 20 MM MgCl 2 </td><td> 아이다호 기술 </td><td></td><td> (버퍼 BSA, Ficoll과 Tartrazine와 함께 제공) </td></tr><tr><td></td><td> 30 MM MgCl 2 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> 40 MM MgCl 2 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> PCR primers </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> DMSO </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> dNTP </td><td></td><td> 로체 </td><td></td><td> (또는 유사한 소스) </td></tr><tr><td> DNA 형성 촉매 DNA 중합 효소 </td><td></td><td> 댄빌 </td><td></td><td> (또는 유사한 소스) </td></tr><tr><td> 모세관 pipettes </td><td> 10 μl 볼륨 </td><td> 아이다호 기술 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 짧았 </td><td></td><td> 아이다호 기술 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 아가로 오스 </td><td> 낮은 EEO, 분자 생물학 학년 </td><td> BioRad </td><td></td><td> (또는 유사한 소스) </td></tr><tr><td> 50 X 태 버퍼 또는 배 TBE 버퍼 </td><td></td><td> 어부 </td><td></td><td> (또는 유사한 소스) </td></tr><tr><td> Ethidium 브로마이드 </td><td></td><td> BioRad </td><td></td><td> (또는 유사한 소스) </td></tr><tr><td> 수평, 겔 곰팡이와 잠수 겔 전기 영동 챔버 </td><td></td><td> BioRad </td><td></td><td> (또는 유사한 소스) </td></tr><tr><td> 전원 공급 장치 </td><td></td><td> BioRad </td><td></td><td> (또는 유사한 소스) </td></tr><tr><td> 분자 영상기 젤 독 시스템 </td><td></td><td> BioRad </td><td></td><td> (또는 유사한 소스) </td></tr></tbody></table> 표 4. 자료

확인을 위해 allelotyping pcr 살모넬라 enterica serovars enteritidis, 해더, 하이 델베르크, 그리고 typhimurium

An Allelotyping PCR for Identifying Salmonella enterica serovars Enteritidis, Hadar, Heidelberg, and Typhimurium

이 속 독특한 살모넬라균 대상 유전자 식별을 위해 현재 상업 PCRs 테스트. 그러나,이 두 종족, 여섯 subspecies, 그리고 2,500 이상의 살모넬라균의 serovars 있으며, 모든 공공 건강에 자신의 중요성 같은 것입니다. 예를 들어, S.를 찾는 테이블 달걀 계층 농장에 enterica subspecies IIIa 애리조나는 S.의 고립에 비해 하찮은 것은 enterica subspecies I serovar Enteritidis, 테이블 계란의 소비에 연결된 살모넬라 증의 주요 원인. Serovars은 antigenic의 lipopolysaccharide의 차이 (LPS) (O 항원)과 flagellin (H1 H2와의 항원)를 기준으로 식별됩니다. 이러한 antigenic 차이는이 표현형과 관련된 유전자 및 유전자 대립 형질의 다양성의 겉모양 수 있습니다. 우리는 멀티 플렉스 PCR, allelotyping을 개발했다고 네 개의 주요 S. 사이의 유전자 차이에 대한 키 enterica subspecies I serovars는 가금류에서 발견과 미국에 상당한 인간의 질병을 앓고 있습니다. PCR 프라이머 쌍은 핵심 유전자 또는 특정 살모넬라균의 serovar 독특한 그 유전자 또는 allele 특정 크기의 amplicon을 생산하기위한 시퀀스를 타겟으로했다. 살모넬라균 serovar는이 특정 LPS에 대한 PCR 검사 결과의 조합에 따라 분리에 할당됩니다 그리고 flagellin 유전자 대립 형질. 이 문서에서 설명하는 멀티 플렉스 PCRs는 S.의 검색을위한 구체적인 enterica subspecies I serovars Enteritidis, 해더, 하이 델베르크, 그리고 Typhimurium. 우리가 분리 살모넬라균에 대한 serovar을 식별하는 멀티 플렉스 PCRs를 사용하는 방법을 보여줍니다.

우리는 살모넬라균 enterica serovars Enteritidis, 해더, 하이 델베르크, 그리고 Typhimurium의 급속한 탐지를위한 멀티 플렉스 PCR을 설명합니다. 특정 살모넬라균의 serovars는 유전자와 주어진 serovar의 O - 항원 생합성 클러스터 및 flagellin 고유의 시퀀스로 PCR 다중을 대상으로 확인할 수 있습니다. Serovar는 대상 allele에 해당하는 특정 크기 amplicons (PCR 제품)의 모양에 따라 분리 살모넬라균에 다음 할당됩니다.

확인을 위해 Allelotyping PCR 살모넬라 enterica serovars Enteritidis, 해더, 하이 델베르크, 그리고 Typhimurium

살모넬라(Salmonella)를 식별하기 위한 현재의 상용 PCR 검사는 이 속(genus)에 특이적인 유전자를 표적으로 합니다. 하지만, 두 개의 종과 6개의 아종, 그리고 ... 이상의

다음 실험의 전반적인 목표는 특정 살모넬라 항원 대립유전자를 식별하는 것입니다. 이는 이러한 대립유전자와 관련된 특정 서열 차이를 식별하기 위해 타겟 PCR을 수행함으로써 달성됩니다. 대립유전자 특이적 프라이머가 포함된 PCR 반응 혼합물에 샘플 템플릿을 첨가하여 OH1 및 H2 대립유전자 타이핑을 진행합니다.PCR은 써모사이클러(thermocycler)에서 수행합니다. 다음으로, 젤 전기영동을 통해 PCR 샘플을 크기별로 분리하여 각 샘플에 앰플리콘(amplicon)이 존재하는지 확인하고 그 크기를 측정하거나 이를 분리합니다. 이후 앰플리콘 크기를 PCR에 사용된 각 프라이머 세트의 예상 크기와 대조하여, 특정 살모넬라 항원의 동정을 나타내는 PCR 결과를 얻습니다.PCR을 통한 대립유전자 분석 후, OH 1 및 H 2 다중 PCR 분석 결과를 바탕으로 혈청형(SEROVAR) 지정이 이루어집니다. 본 영상에서 설명하는 프로토콜이 SYP보다 갖는 주요 장점은 분석 속도가 빠르고, 결과 해석이 더 쉬우며, 비용이 적게 든다는 점입니다. 이 방법은 가금류 또는 낙농 농장 내부 또는 농장 간의 salmonella VARs 분포 및 지속성을 결정하는 것과 같이 역학 분야의 몇 가지 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다.이 기술의 함의는 Salmonella serovars arius 또는 urian에 의한 살모넬라증의 신속한 진단으로 확장됩니다. 이 방법의 시각적 시연은 이 PCR 기반 방법을 사용하여 살모넬라를 혈청형 수준까지 분석하는 방법을 이해하는 데 매우 중요합니다. 이 절차의 시연은 조지아 대학교 Lee Mauer 연구소의 연구원인 Adriana Pedroso와 Yin Chang이 수행하며, 이후의 PCR 반응을 위한 전세포 DNA 템플릿을 준비합니다.먼저 1 mL의 LB 배지에 salmonella를 접종합니다. 단일 콜로니로부터 분리합니다. 200~250 rpm의 진탕 속도와 37 °C의 배양 온도에서 배양합니다.다음 날, 1 mL 배양액을 1.5 mL 마이크로 원심분리 튜브로 옮기고, 약 2분 동안 4,500 ×g로 원심분리하여 세포를 펠렛화합니다. 그 다음 상층액을 흡입하여 제거하고, 박테리아 펠렛을 1 mL의 100% Ethanol에 재현탁합니다. 에탄올에 현탁된 세포를 실온에서 10분 동안 배양한 후, 이전과 동일하게 세포를 원심분리합니다. 펠렛을 1 mL의 PBS에 재현탁합니다. 원심분리 후 상층액을 흡입하여 제거하고 펠렛을 1 mL의 멸균 증류수에 재현탁합니다. 마지막으로 세포 현탁액을 희석합니다.증류수로 1:20으로 희석하여 PCR 준비 단계 전까지 최대 한 달 동안 -20 °C에서 보관합니다. PCR 반응 혼합물의 조제 및 분주는 물리적으로 분리된 공간에서 수행해야 하며, 가급적 UV 램프가 설치된 전용 PCR 워크스테이션에서 진행하는 것이 좋습니다. 먼저, UV 램프와 10% bleach를 이용한 닦아내기로 작업 표면을 오염 제거합니다. 그 다음, PCR 작업 전용으로 지정된 피펫과 배리어 피펫 팁을 사용하여 수행합니다.먼저 프라이머를 증류수로 5 × 10⁻⁴ M 농도로 희석하여 마스터 프라이머 스톡을 만듭니다. 그다음, 이 스톡을 증류수로 1:20으로 희석하여 25 µM의 작동 농도로 맞춥니다. 냉동고에서 PCR 시약과 전세포 템플릿을 꺼내 얼음 위에서 해동합니다.tac DNA polymerase는 필요할 때까지 냉동고에 보관하십시오. 서면 프로토콜의 표 1에 따라 PCR 시약들을 혼합합니다. 다음으로, PCR 반응액 9 µL를 피펫으로 분취합니다.멸균된 96-웰 라운드 바텀 폴리스티렌 마이크로타이터 플레이트의 각 웰에 혼합합니다. 첫 번째 열의 상단부터 시작하여 아래로 내려간 다음 다음 열의 상단으로 이동하며, 첫 번째 웰에는 음성 대조군으로 사용할 증류수 1 µL를 첨가합니다. 이어서 두 번째 웰의 PCR 믹스에 양성 대조군 템플릿 0.5 µL를 분주하고, 세 번째 웰에는 E. coli K 12 DH5α 1 µL를 분주합니다.세 번째 샘플 템플릿 1 µL를 나머지 웰에 추가합니다. H1 I 및 gyp PCR의 경우, Salmonella enterica CVaR TYM과 Enteritidis가 각각 I 및 G alleles의 양성 대조군으로 사용됩니다. Salmonella CVaR, Heidelberg 및 Haar는 r 및 z10 alleles를 검출하기 위한 두 번째 H1 allele 타이핑 PCR에서 각각 양성 대조군으로 사용됩니다. 다음으로 10 µL 용량의 유리 모세관을 Idaho technology용 지정 홀더에 배치합니다.홀더에 Rapid cycler를 고정한 후, 유리 모세관을 웰 바닥에 접촉시켜 각 모세관에 PCR 반응 혼합물을 충전합니다. 홀더를 기울여 액체가 튜브 아래로 이동하게 함으로써 모세관 끝단과 PCR 혼합물 사이에 공간을 확보합니다. 부탄 토치로 모세관의 양 끝을 열봉합하기 전, 모세관 튜브와 홀더를 Idaho technology rapid cycler에 넣고 서면 프로토콜의 표 1에 설명된 서모사이클러 프로그램을 사용하여 다양한 all ELO 유형의 PCR을 수행합니다.써모사이클러 프로그램이 완료되면, 표준 절차에 따라 에티듐 브로마이드가 포함된 15 × 10 cm, 1.5% 분자생물학 등급 아가로스 겔을 사용하여 겔 전기영동 단계를 진행하십시오. 겔이 응고되면, 0.25 mg/mL 농도로 200 µL가 미리 혼합된 1× TAE 전기영동 버퍼가 담긴 수평 침지형 전기영동 챔버로 겔을 옮기십시오.6배 농도의 DNA 로딩 다이 40 µL가 포함된 DNA 분자량 마커를 준비하여, 첫 번째, 중간 및 마지막 웰에 미리 혼합된 DNA 분자량 마커 4.8 µL를 로딩합니다. 다음으로, 홀더에서 PCR 샘플 반응액이 들어 있는 유리 모세관을 꺼내 유리 커터로 모세관의 양 끝을 흠집 냅니다. 그런 다음 양손의 엄지와 검지를 유리 커터로 표시된 모세관의 양쪽에 대고 모세관을 꺾어 분리합니다. PCR 반응 혼합물의 반대쪽 끝에 모세관 디스펜서를 배치하고, 액체가 튜브의 맨 아래에 도달할 때까지 플런저를 천천히 시계 방향으로 돌립니다.로딩할 웰에 모세관을 넣고 플런저를 시계 방향으로 천천히 돌려 정량된 샘플을 웰에 분주합니다. 모세관으로 웰을 찌르지 않도록 주의하며, 액체가 모세관에서 완전히 빠져나간 후에도 플런저를 계속 돌려 웰에 기포가 유입되지 않도록 주의하십시오. 모든 샘플과 표준 물질의 로딩이 완료되면, 전원 공급 장치의 정전압을 90 volts로 설정합니다.전기영동이 완료되면, 젤을 UV 트랜스일루미네이터로 옮겨 DNA 단편과 분자량 표준물질을 시각화하고 gel dock XR 시스템으로 이미지를 캡처합니다. 마지막으로, 모세관 홀더를 10% 표백제에 15~30분 동안 담급니다. 증류수로 3회 헹군 후 PCR 준비실에 다시 놓아 자연 건조합니다.이 첫 번째 에티듐 브로마이드 염색 젤은 salmonella entera var, enteritis, hadda Heidelberg.Antifa와 관련된 O 대립유전자에 대한 멀티플렉스 PCR 결과를 보여줍니다. 1번과 13번 레인에는 100 base pair DNA 래더가 포함되어 있습니다.2번 레인에는 O 대립유전자 B, C1, C2, D1 및 E에 대한 멀티플렉스 PCR 대조군이 포함되어 있습니다. 나머지 3번에서 12번 레인에는 살모넬라 분리균이 포함되어 있습니다. 살모넬라 분리균의 대립유전자 지정은 왼쪽에서 오른쪽으로 사용된 대립유전자 프라이머 세트의 예측 결과 및 PCR 대조군의 크기와 일치하는 증폭 산물을 기준으로 결정됩니다. 증폭 산물의 크기는 다음과 같습니다: D1 620 base pairs, C2 400 base pairs, E 280 base pairs, C1 340 base pairs 및 B 560 base pairs.이 이리듐 브로마이드 염색 젤은 eye 및 gm 대립유전자의 FLA 젤을 식별하기 위한 H1 대립유전자 멀티플렉스 PCR 결과를 보여줍니다. 젤은 이전에 보여준 것과 동일한 순서로 로딩되었습니다. 다시 한번, 왼쪽에서 오른쪽으로 사용된 4가지 H1 대립유전자 프라이머 세트에 대해 예측된 바와 같이, PCR 컨트롤과 크기가 일치하는 앰플리콘의 존재 여부에 따라 각 분리주에 H1 대립유전자가 할당됩니다.앰플리콘 크기는 GM 310 base pairs, I 510 base pairs입니다. 이 에티듐 브로마이드 염색 젤은 gellin 대립유전자 r 및 z 10을 식별하기 위한 H one allele 멀티플렉스 PCR 결과를 보여줍니다. 젤 로딩은 앞서 설명한 방식과 동일하게 수행되었으며, 각 분리주에 할당되는 H one allele은 PCR 컨트롤과 크기가 일치하는 앰플리콘의 존재 여부에 따라 결정됩니다. 사용된 4가지 H one allele 프라이머 세트에 대해 예측된 바와 같이, 앰플리콘 크기는 R 170 base pairs 및 Z ten 360 base pairs입니다.이 기술은 적절히 수행될 경우 4시간 이내에 완료할 수 있습니다. 본 절차를 진행하는 동안, PCR carryover 오염 가능성을 최소화하기 위해 템플릿 준비, PCR 셋업, 그리고 겔 전기영동 단계를 물리적으로 분리하여 수행하십시오.

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Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

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