פרופיל Voltage-Expression מגודרת אשלגן mRNA ערוץ בנוירונים Nigral באמצעות תא יחיד RT-PCR טכניקות

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא לזהות RNA שליח בתוך נוירונים בודדים. דבר זה מושג באמצעות patch clamping והקלטה של נוירונים בודדים, ולאחר מכן שאיבה מלאה של הציטופלזמה מכל נוירון שהוקלט לצורך בידוד ה-mRNA והציטופלזמה. לאחר מכן, מכינים cDNA המוגבר באמצעות PCR.

בסופו של דבר, ניתן לזהות mRNA ספציפי עבור רצפטורים, תעלות יונים ואנזימים באמצעות מערכת דימוי ג'ל קונבנציונלית. שמי הוא, אני עובד במרכז למדעי הבריאות של אוניברסיטת טנסי. באופן כללי, אנשים שאינם בקיאים בשיטה זו יתקשו בתהליך, כיוון שכמות ה-mRNA בנורון בודד קטנה ביותר ועלולה ללכת לאיבוד בקלות.

התחילו את הפרוטוקול על ידי שימוש במיקרוטום רטט (vibratome) לחיתוך פרוסות מוח קורונליות בעובי 300 µm המכילות את החלק הרוסטראלי המרכזי של ה-substantia nigra. ניתן לבודד מוחות מחולדות Sprague-Dawley בנות 15 עד 40 ימים. הליך חיתוך הפרוסות מבוצע בטמפרטורת קרח בתוך תמיסת חיתוך עשירה בסוכרוז, מחומצנת ב-95% oxygen ו-5% carbon dioxide, וב-pH של 7.4. דגרו את הפרוסות בנוזל צליקרוספליבי מלאכותי (artificial cerebral spinal fluid) עם הזרמת גז של 5% carbon dioxide ו-95% oxygen.

שמרו על טמפרטורה של 34 °C והשאירו את הפרוסות שם למשך 45 דקות. לאחר מכן, שמרו את פרוסות המוח בטמפרטורת החדר עד להקלטה. התחילו בהעברת פרוסת מוח אחת לתא הקלטת patch clamp.

בביצוע פרפוזיה רציפה של נוזל מוחי-שדרתי מלאכותי מחומצן בטמפרטורה של 32 °C. מלאו את פיפטות ה-patch בתמיסה תו-תאית שעברה אוטוקלאב והוכנה עם מים נקיים מ-DNAs ו-RNAs. הורידו פיפטה טעונה לתוך האמבט.

בדקו שההתנגדות היא בין שניים לשלושה mega ohms. ראשית, אתרו את ה-substantial nigra לפי מיקומה האנטומי המובחן. לאחר מכן, באמצעות אופטיקת namar ועדשה של 60x, בחרו תאים גדולים ב-SNC וב-SNR לצורך הקלטה.

אלו הם בוודאי נוירונים דופמינרגיים או GABAergic. השתמשו בתצורת whole cell עם giga tight seal קונבנציונלית לביצוע current clamp ו-voltage clamp. יש לבצע הקלטות אלו בדרך כלל תוך פחות מחמש דקות כדי למזער את פירוק ה-mRNA.

בתוך כדקה, ניתן לספק "טביעות אצבע" אלקטרופיזיולוגיות עבור הנוירונים הרלוונטיים על ידי הקלטה של תכונות הממברנה והספייקים שלהם בלבד. לאחר קבלת נתונים מנוירון רלוונטי, השתמש בשאיבה עדינה באמצעות הפה כדי לשאוב החוצה את הציטופלזמה. יש להיזהר לא לשבור את האיטום ההדוק, שמא אחרת.

פסולת חוץ-תאית, כולל mRNA, עלולה להישאב אל תוך פיפטת ה-patch ולזהם את תוכן התא. העבירו את תוכן התא לשפופרת PCR של 0.2 milliliter על ידי שבירת קצה הפיפטה והפעלת לחץ חיובי קל. עם הסיום, הניחו מיד את השפופרת במקפיא של 20- מעלות כדי לשלול זיהום של פסולת חוץ-תאית שעשויה להכיל mRNAs.

הכינו בקרת שלילה על ידי איסוף התוכן מפלטת פיפט (patch pipette) שהורדה אל תוך הרקמה ללא שימוש בשאיבה. לאחר איסוף תוכן תאי מ-10 עד 20 נוירונים, התחילו מיד בתגובת השעתוק ההפוך. כדי למזער את פירוק ה-mRNAs, התחילו בעיכול של כל DNA גנומי מזוהם באמצעות DNase, למשך חמש דקות, ב-25 degrees Celsius.

שלב זה הוא קריטי להפחתת תוצאות חיוביות שגויות פוטנציאליות ואין לעקוף אותו. לאחר מכן, בצעו אינאקטיבציה של ה-DNAs באמצעות 1.2 µL של 25 mM EDTA והדגירו את הדגימות בטמפרטורה של 70 °C למשך חמש דקות. כעת, השתמשו בערכה זמינה מסחרית לסינתזה של CD NA כדי לוודא שה-genomic DNA הוסר לחלוטין.

בצע תגובת ביקורת עבור כל דגימה ללא reverse transcriptase, כאשר כל שאר מרכיבי התגובה נותרים ללא שינוי. אחסן את התוצרים בטמפרטורה של 20°C- עד שיידרשו לצורך תכנון ה-PCR.

פריימרים בהתאם לרצפים ב-Gen bank; במידת האפשר, יש להכין פריימרים שחוצים את אזור ה-intron כדי לסייע בזיהוי זיהום של DNA גנומי. כדי לבדוק את יעילותם של זוגות הפריימרים, יש לבחון אותם בשלב הראשון על cDNA ממוח שלם. בצעו הגברה ב-PCR של 5 µL מתוך 30 µL של cDNA למשך 35 מחזורים, תוך שימוש בפרוטוקול סטנדרטי למחזור תרמי.

עבור השלב השני, בצעו הגברה באמצעות PCR למיקרוליטר אחד של תוצרי ה-PCR מהשלב הראשון עם אותם הפריימרים, והשתמשו בפרופיל מחזורים שונה מעט. כעת, הפרידו את התוצרים על ג'ל AGROS בריכוז 2.5% והדמי unopened אותם באמצעות ברומיד אתידיום או Gel Green. תחת אור UV, גזרו את פסי ה-DNA החיוביים ורצפו אותם באמצעות ערכה זמינה מסחרית לצורך איסוף ה-DNA.

הומשוו המאפיינים האלקטרופיזיולוגיים של נוירונים ב-substantial nigra, pars compacta וב-pars reticulata. נוירונים GABAergic ב-SNR הפגינו פריקה ספונטנית בתדירות גבוהה יותר, של כ-10 hertz. למשפיקים (spikes) היה משך בסיס של כ-one millisecond בעקבות הזרקת זרם להיפר-פולריזציה.

נוירונים GABAergic ב-SNR הראו תגובת SAG עדינה המעידה על זרם שמופעל באופן חלש. לעומת זאת, נוירונים דופמינרגיים בניגרום הראו פריקים ספונטניים בתדר נמוך עם משך בסיס של כ-3 milliseconds. נוירונים דופמינרגיים הראו גם SAG בולט בתגובה להיפר-פולריזציה, המעיד על ביטוי חזק של זרם IH בנוירונים GABAergic ב-SNR, אך לא בנוירונים דופמינרגיים.

בדיקת Single cell R-T-P-C-R זיהתה mRNA עבור glutamic acid decarboxylase one, אנזים מפתח בסינתזת GABA. לעומת זאת, ב-Single cell R-T-P-C-R זוהה mRNA עבור tyrosine hydroxylase, אנזים מפתח לסינתזת דופמין, בתוך נוירונים דופמינרגיים מזוהים של SNC ו-SNR, אך לא בנוירונים GABAergic.

בשלב הבא, נעשה שימוש ב-single cell R-T-P-C-R כדי לאפיין את ביטוי תתי-היחידות של תעלת KV three המופעלות על ידי מתח, המשנות את התכונות של תעלות אשלגן תלויות מתח. בדוגמה של SNR gaba, mRNA של נוירונים עבור KV 3.1, 3.2, 3.3 ו-3.4 זוהו בנאורון S-N-R-D-A לדוגמה בלבד. KV 3.2, 3.3 ו-3.4 זוהו בנתונים מאוחדים.

KV 3.1 זוהה בתדירות גבוהה יותר בנוירונים GABAergic של ה-SNR מאשר בנוירונים דופמינרגיים של ה-nigra, מה שמעיד על רמת ביטוי גבוהה יותר של KV 3.1 בנוירוני ה-SNR GABA המהירים. בעת ביצוע הליך זה, חשוב לזכור להשתמש בכפפות ולשמור על הכלים נקיים מזיהומים לאחר פיתוחם. טכניקה זו סללה את הדרך עבור חוקרים בתחום מדעי העצבים לחקור את הביטוי והתפקוד של רצפטורים ותעלות יונים במערכת העצבים.