Solo lectura y pareadas final Sec ARNm bibliotecas de Illumina de 10 nanogramos ARN total

El objetivo general de este procedimiento es generar bibliotecas de secuencias de ARNm de Illumina a partir de pequeñas cantidades de material de partida. El primer paso del procedimiento es transcribir inversamente el ARN total con siete cebadores DTT para producir CD NA. El cd NA se utiliza para la amplificación de ARN por transcripción in vitro. Posteriormente, el ARN amplificado se somete a fragmentación aleatoria.

La transcripción inversa del ARN fragmentado produce CD NA, que se somete a la ligadura del adaptador, la selección del tamaño y la amplificación por PCR. En última instancia, este protocolo muestra el perfil de expresión génica de la muestra a través de la medición del número de copias del gen. La principal ventaja de esta técnica es que solo requiere 10 nanogramos de ARN total inicial.

Eso es órdenes de magnitud menos de lo que se requiere de otros protocolos existentes. Además, puede generar emparejamientos en bibliotecas a partir de cantidades tan pequeñas de ARN inicial. Este método permitirá a los científicos explorar cuestiones novedosas en biología, permitiendo la determinación de perfiles de expresión génica a partir de poblaciones celulares difíciles de obtener, como las derivadas de la captura láser, la microdisección o la citometría de flujo.

Primero tuvimos la idea de desarrollar este método cuando necesitábamos perfilar la expresión génica de un número muy limitado de células diferenciadas de las células madre amniónicas humanas. La demostración visual de este método es fundamental, ya que los pasos de manejo del ARN son difíciles de aprender debido a la pequeña cantidad de ARN que se puede degradar fácilmente. Para demostrar el procedimiento estarán Angela Elwell, Jennifer Bolen y Baal Kimm Wynn de mi laboratorio.

El método para preparar bibliotecas de secuenciación final de lectura única y emparejadas en paralelo es un procedimiento de varios pasos, como se muestra en este diagrama de flujo. En primer lugar, el ARN total se aísla de las células o tejidos de interés y se utiliza para preparar CD-NA bicatenario. A continuación, se amplifican selectivamente a partir del CD NA utilizando el método de amplificación lineal ewin basado en T seven. A continuación, el poli amplificado a A se fragmenta aleatoriamente.

Una vez que se limpia el ARN fragmentado, se transcribe a CD NA. El CD NA se repara en el extremo y se añaden bases a los tres extremos primarios de los fragmentos de ADN. Después de eso, el ADN se liga con un adaptador y no se lleva a cabo ninguna digestión. En el caso de la biblioteca de láminas única, la biblioteca de ADN se aísla mediante purificación en gel y se amplifica mediante PCR para ligar los adaptadores de Illumina.

Finalmente, una vez cuantificada la biblioteca de ADN, está lista para la secuenciación. A los efectos de este video, solo se demostrarán los procedimientos seleccionados dentro de este protocolo. La transcripción inversa de los ARNm de poliA fragmentados a ADNc implica la síntesis de primera y segunda cadena.

Para la síntesis de la primera cadena para la biblioteca de lectura única, agregue los siguientes reactivos en un tubo de PCR A, 10 microlitros de ARNm de polietileno fragmentado y un microlitro de un cebador no aleatorio. Aquí se muestra la secuencia del cebador no nonamer. La secuencia proximal de cinco primos que se muestra en verde no es el único sitio de restricción.

Mientras que la secuencia que se muestra en azul es el complemento inverso de la secuencia del adaptador B de illumina del kit de secuencia de chips, incube la mezcla a 70 grados centígrados durante cinco minutos en el termociclador y luego enfríe rápidamente en hielo. Mientras mantiene la mezcla en hielo, agregue estos reactivos del kit de tres superíndices cuatro microlitros de cinco x tampón de primera hebra, dos microlitros de DTT y 1,5 microlitros de mezcla de DNTP En la mezcla de DNTP, use cinco DCTP de metilo en lugar de DCTP. Coloque el tubo en el termociclador a 42 grados centígrados durante dos minutos y luego agregue un microlitro de superíndice tres, transcriptasa inversa e incube a 42 grados centígrados durante una hora.

A continuación, configure la reacción para la síntesis de la primera hebra para la biblioteca de parafines. Agregue los siguientes reactivos en un tubo de PCR, 10 microlitros de poli NNA fragmentado y un microlitro de cebador de hexámero aleatorio. Incubar a 65 grados centígrados durante cinco minutos en el termociclador y luego enfriar rápidamente en hielo.

Manteniendo el tubo en hielo, agregue los siguientes reactivos del kit de tres primeros hilos en superíndice, cuatro microlitros de cinco x tampón de primera hebra, dos microlitros de DTT y 1,5 litros de DN NTPs. Incubar en el termociclador a 45 grados centígrados durante un minuto. A continuación, añada un microlitro de superíndice tres, transcriptasa inversa e incube a 45 grados centígrados durante una hora después de una hora.

Ambas reacciones están listas para la síntesis de la segunda hebra. Añadir a cada una de las mezclas en hielo, estos reactivos del superíndice dos kits de 91 microlitros de agua libre, 30 microlitros de tampón de cinco x segundo hebra. Tres microlitros de DN NTPs, un microlitro de e-coli, ADN ligasa, cuatro microlitros de e-coli, ADN polimerasa y un microlitro de E. coli R nase H.Mezcle cada tubo por inversión, luego centrifugue brevemente e incube a 16 grados centígrados durante dos horas.

Para la reparación final del CDNA para la biblioteca de lectura única, agregue a 40 microlitros de CD NA purificado, los siguientes reactivos, cinco microlitros de tampón de ADN ligasa T cuatro con 10 milimolares. A TP dos microlitros de DNTP Mezcle un microlitro de T cuatro ADN polimerasa, un microlitro de enzima klino y un microlitro de T cuatro PNK para la reparación final del CD NA Para la biblioteca de extremos emparejados, agregue a 30 microlitros de CD NA purificado, estos reactivos 45 microlitros de ARN. D NS Agua libre.

10 microlitros de tampón T cuatro ADN ligasa con 10 milimolares. Un TP de cuatro microlitros de 10 milimolares. La mezcla DNTP de cinco microlitros de T cuatro ADN polimerasa, un microlitro de enzima klino y cinco microlitros de T cuatro PNK incuban ambos tubos en el termociclador a 20 grados centígrados durante 30 minutos después de la reparación final.

El siguiente paso en este protocolo es agregar bases de adenina a los tres extremos principales de los fragmentos de ADN para la biblioteca de lectura única. Prepare la siguiente mezcla de reacción: 34 microlitros de muestra de ADN, cinco microlitros de tampón klino, 10 microlitros de DATP y un microlitro de klino exo. Para la biblioteca de extremos emparejados, prepare la siguiente mezcla de reacción: 32 microlitros de muestra de ADN, cinco microlitros de tampón de salida clin.

10 microlitros de DATP y tres microlitros de clin out exo incuban ambas mezclas de reacción a 37 grados centígrados durante 30 minutos antes de configurar las reacciones para la ligadura del adaptador. Descongele los adaptadores en hielo y dilúyalos de uno a 20 para la biblioteca de lectura única. Utilice el kit de preparación de muestras de secuencia de chips Illumina para preparar la siguiente mezcla de reacción: 10 microlitros de muestra de ADN, un microlitro de mezcla de oligonucleótidos adaptadores, 15 microlitros de dos tampones de ligasa XDNA y cuatro microlitros de ADN ligasa, incubar durante 15 minutos.

A temperatura ambiente para la biblioteca de extremos emparejados, utilice el kit de preparación de muestras finales emparejadas de Illumina para preparar la siguiente reacción. Mezclar 10 microlitros de muestra de ADN, 10 microlitros de oligonucleótido adaptador de PE, mezclar 25 microlitros de dos tampones de ligasa XDNA y cinco microlitros de ADN ligasa, incubar durante 15 minutos a 20 grados centígrados al final de las respectivas incubaciones. Limpie ambas reacciones de ligadura utilizando columnas XMO.

Elute, la biblioteca de lectura única y 44 microlitros de agua eluyen la biblioteca de extremos emparejados con seis microlitros de tampón de ilusión, seguida de otra ilusión en cinco microlitros de eb. Realice una no digestión solo para la biblioteca de lectura única. Incube durante dos horas o toda la noche a 37 grados centígrados después de purificar la reacción con una columna ZY IMO.

Eluir la biblioteca de lectura única con seis microlitros de tampón eb, seguido de una segunda dilución con cinco microlitros de eb. El adaptador ligado, el ADN de ambas bibliotecas ya está listo para ser seleccionado por tamaño. El procedimiento de selección de tamaño para el adaptador de ADN ligado se realiza utilizando un EE 2%cyber safe de Vitrogen para comenzar este procedimiento, ejecute el programa cero antes de la ejecución durante dos minutos.

Después de la pre-ejecución, cargue 10 microlitros de la escalera de más de un KB y las muestras de NA 2D. Llene los carriles vacíos con 10 microlitros de agua para correr el programa. Un egel 2%run durante 28 minutos.

Cuando la tirada sea de tamaño completo, seleccione el par base de 200 a 300 rodajas de gel con una hoja de afeitar nueva. Se evaluó el número de genes identificados por las distintas bibliotecas, y esta tabla muestra información sobre el número de conglomerados. Los genes identificaron la tasa de error y el porcentaje de alineación de las bibliotecas de lectura única y de extremo emparejado tanto para bibliotecas de lectura única como para bibliotecas de extremo emparejadas.

Las bibliotecas T seven LA de 10 nanogramos identificaron casi el mismo número de genes que las bibliotecas amplificadas UN de 10 microgramos con un TPM de 10 o más. En el caso de las bibliotecas de lectura única, la biblioteca LA de 10 nanogramos T seven identificó el 100% de los 8.500 genes identificados por la biblioteca amplificada UN de 10 microgramos para bibliotecas de paradigmas. La biblioteca de 10 nanogramos T 7 LA identificó el 86% de los genes identificados por la biblioteca de 10 microgramos sin pled.

Las bibliotecas hechas con menos de 10 nanogramos no fueron capaces de identificar tantos genes. Por ejemplo, en el protocolo de lectura única, la biblioteca LA de un nanogramo T seven identificó solo alrededor del 50% de los genes identificados por la biblioteca amp de 10 microgramos mínimos. Por lo tanto, la cantidad más baja de ARN total para su uso con el protocolo T seven LA debe limitarse a un mapeo de 10 nanogramos de un gen de limpieza.

GA DH muestra que todas las bibliotecas T seven LA hechas con al menos 10 nanogramos de ARN inicial identificaron todos los exones, incluido el extremo cinco exones primos. La barra de escala de la izquierda para las bibliotecas de lectura única indica 350 lecturas en total. La barra de escala en el centro de las bibliotecas DEN indica 5.000 lecturas en total.

Una comparación de las bibliotecas de 10 nanogramos T seven LA de lectura única y extremo emparejado con las bibliotecas de min amp muestra un alto grado de similitud. Se obtuvo una correlación de Spearman de 0,90 entre la biblioteca LA de 10 nanogramos T seven y la biblioteca de amplificadores de 10 microgramos mínimos, y se obtuvo una correlación de 0,95 entre la biblioteca PEREN de 10 nanogramos T seven LA y la biblioteca de amplificadores mínimos de 10 microgramos. Además, se realizó una comparación entre las dos bibliotecas de lectura única y peren hechas a partir de 10 nanogramos de ARN total, y el coeficiente de correlación muy alto demuestra que ambos tipos de bibliotecas hechas usando el protocolo T seven LA producen una firma de expresión génica muy similar.

Finalmente, dado que estas bibliotecas se prepararon a partir de células madre embrionarias humanas ARN 30, se buscaron genes específicos entre las bibliotecas. Casi todos estos genes fueron identificados por las bibliotecas hechas a partir de al menos 10 nanogramos de ARN total inicial, validando así este protocolo. Al realizar este protocolo, es importante recordar que debe manipular las muestras pequeñas de ARN con extrema precaución para evitar la degradación.

Después de ver este video, debería tener una muy buena comprensión de cómo preparar Illumina, Mr.Aeq single read y Paradigm Libraries a partir de cantidades muy pequeñas de material inicial.