Name: Solo lectura y pareadas final Sec ARNm bibliotecas de Illumina de 10 nanogramos ARN total (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-10-27T13:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 49 s
Description: Aprende a preparar bibliotecas de secuenciación Illumina mRNA-Seq a partir de solo 10 nanogramos de ARN total mediante amplificación lineal T7. Este método permite el análisis de expresión génica en poblaciones celulares difíciles de obtener.

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Este trabajo fue apoyado por fondos del Instituto Morgridge para la Investigación y la Universidad de Wisconsin Foundation. Damos las gracias a Krista Eastman por su asistencia editorial.

<ol><li>Tang, F., Barbacioru, C., Wang, Y., Nordman, E., Lee, C., Xu, N., Wang, X., Bodeau, J., Tuch, B. B., Siddiqui, A., Lao, K., Surani, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mRNA-Seq+whole-transcriptome+analysis+of+a+single+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">mRNA-Seq whole-transcriptome analysis of a single cell.</a> Nature Methods. 6, 377-382 (2009).</li>
<li>Armour, C. D., Castle, J. C., Chen, R., Babak, T., Loerch, P., Jackson, S., Shah, J. K., Dey, J., Rohl, C. A., Johnson, J. M., Raymond, C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Digital+transcriptome+profiling+using+selective+hexamer+priming+for+cDNA+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Digital transcriptome profiling using selective hexamer priming for cDNA synthesis.</a> Nature Methods. 6, 647-649 (2009).</li>
<li>Mortazavi, A., Williams, B. A., McCue, K., Schaeffer, L., Wold, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+and+quantifying+mammalian+transcriptomes+by+RNA-Seq%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Mapping and quantifying mammalian transcriptomes by RNA-Seq.</a> Nature Methods. 5, 621-628 (2008).</li>
<li>Mamanova, L., Andrews, R. M., James, K. D., Sheridan, E. M., Ellis, P. D., Langford, C. F., Ost, T. W., Collins, J. E., Turner, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FRT-seq+amplification-free%2C+strand-specific+transcriptome+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">FRT-seq amplification-free, strand-specific transcriptome sequencing.</a> Nature Methods. 5, 130-132 (2010).</li>
<li>Sengupta, S., Ruotti, V., Bolin, J., Elwell, A., Hernandez, A., Thomson, J., Stewart, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+consistent%2C+fully+representative+mRNA-Seq+libraries+from+ten+nanograms+of+total+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Highly consistent, fully representative mRNA-Seq libraries from ten nanograms of total RNA.</a> Biotechniques. 49, 898-904 (2010).</li>
<li>Langmead, B., Trapnell, C., Pop, M., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrafast+and+memory-efficient+alignment+of+short+DNA+sequences+to+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Genome.+Biology%22%5BJournal%5D)">Ultrafast and memory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome.</a> Genome. Biology. 10, R25-R25 (2009).</li>
<li>Li, B., Ruotti, V., Stewart, R. M., Thomson, J. A., Dewey, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-Seq+gene+expression+estimation+with+read+mapping+uncertainty%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">RNA-Seq gene expression estimation with read mapping uncertainty.</a> Biotechniques. 26, 493-500 (2010).</li>
<li>Thomson, J. A., Itskovitz-Eldor, J., Shapiro, S. S., Waknitz, M. A., Swiergiel, J. J., Marshall, V. S., Jones, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+stem+cell+lines+derived+from+human+blastocysts%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts.</a> Science. 282, 1145-1147 (1998).</li>
<li>mRNA-Seq-8 Sample Prep Kit [Internet]. , Illumina. Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.illumina.com/products/mrna_seq_8_sample_prep_kit.ilmn">http://www.illumina.com/products/mrna_seq_8_sample_prep_kit.ilmn</a> Forthcoming.</li>
<li>ScriptSeq mRNA-Seq Library Preparation Kit (Illumina -compatible) Epicentre [Internet]. , Epicenter. Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.epibio.com/item.asp?id=578">http://www.epibio.com/item.asp?id=578</a> Forthcoming.</li>
</ol>

Los autores revelan que JAT es uno de los fundadores, los accionistas, consultor y miembro del consejo de celulares Dynamics International (CDI). También se desempeña como asesor científico y tiene intereses financieros en las tácticas Empresas II de células madre.

Los protocolos actuales para la toma de pares bibliotecas final requieren entre 1 mg 9 a 2,5 mg 10 importe de partida de ARN total. A continuación les presentamos nuestra amplificación lineal T7 basada (T7LA) para preparar los dos una sola lectura y bibliotecas pares Illumina final de secuenciación y demostrar que este método permite la generación de bibliotecas de precios tan bajos como 10 ng de ARN total, la producción de datos que es comparable a la de mínimamente ampliado (MinAmp) bibliotecas de material veces más, a partir 1000 (10 mg de ARN total). Las 10 bibliotecas ng no sólo descubrir las semejanzas en el número total de genes, sino que también producen las firmas de expresión genética que son similares (Figuras 3a yb). Por otra parte, tanto la única lectura y bibliotecas pares final producido por el método T7LA son muy similares entre sí (Figura 3c), que permite a los investigadores comparar los datos generados por las bibliotecas a partir de cualquiera de los protocolos. Desde estas bibliotecas fueron preparados a partir de ARN humano de células madre embrionarias, se realizaron búsquedasde 30 genes de células madre específicas entre las bibliotecas y encontrar que casi todos los de estos genes (93-100%) se identifican por las bibliotecas a partir de al menos 10 ng de RNA total de partida (Figura 4), validando así el protocolo. Creemos que el protocolo sería muy útil para los investigadores, especialmente en circunstancias como las celdas de flujo ordenado o láser micro-disección del tejido en que el material de partida es limitante. En tales circunstancias, el protocolo que permitirá la generación de datos de expresión génica comparable a las bibliotecas a partir de cantidades mucho más grandes de partida ya que el protocolo produce perfiles de expresión comparable a través de al menos 3 órdenes de magnitud a partir de ARN.

<table border="1"><tbody><tr><td> Empresa </td><td> Kit / Reactivo </td><td> Catálogo # </td><td> Comentarios especiales </td></tr><tr><td> Ambion </td><td> La fragmentación de reactivos </td><td> AM8740 </td><td></td></tr><tr><td> Ambion </td><td> Revestimiento de acrilamida </td><td> AM9520 </td><td></td></tr><tr><td> Ambion </td><td> MEGAscript T7 Kit </td><td> AM1334 </td><td></td></tr><tr><td> Ambion </td><td> DEPC no tratados de agua libre de nucleasa </td><td> AM9932 </td><td></td></tr><tr><td> Fermentas </td><td> dNTP conjunto </td><td> R0181 </td><td></td></tr><tr><td> Fermentas </td><td> dNTPs metilado </td><td> R0431 </td><td> Para la preparación de la muestra individual de sólo lectura </td></tr><tr><td> Illumina </td><td> TruSeq SR Grupo Generación kit v5 </td><td> GD-203-5001 </td><td> Para la preparación de la muestra individual de sólo lectura </td></tr><tr><td> Illumina </td><td> TruSeq Sec Kit v5 36 ciclos </td><td> FC-104-5001 </td><td></td></tr><tr><td> Illumina </td><td> Sec. de chips preparación de muestras Kit </td><td> IP-102-1001 </td&gt; <td> Para la preparación de la muestra individual de sólo lectura. Pueden ser reemplazados con los ORC muestra de ADN Mix Master Set de preparación un gato # E6040S </td></tr><tr><td> Illumina </td><td> TruSeq PE Grupo Generación kit v5 </td><td> PE-203-5001 </td><td> Para la preparación de parejas de la muestra final, sólo </td></tr><tr><td> Illumina </td><td> Muestras pareadas final Prep Kit </td><td> PE-102-1001 </td><td> Para la preparación de parejas de la muestra final, sólo </td></tr><tr><td> Invitrogen </td><td> 1kb plus escalera </td><td> 10787-018 </td><td></td></tr><tr><td> Invitrogen </td><td> E. coli RNasa H </td><td> 18021-014 </td><td></td></tr><tr><td> Invitrogen </td><td> RNasa fuera </td><td> 10777-019 </td><td></td></tr><tr><td> Invitrogen </td><td> Buffer 5x segunda cadena </td><td> 10812-014 </td><td></td></tr><tr><td> Invitrogen </td><td> E. coli DNA polimerasa </td><td> 18010-017 </td><td></td></tr><tr><td> Invitrogen </td><td> E-gel SYBR seguro del 2% </td><td> G521802 </td><td></td></tr><tr><td> Invitrogen </td><td> Superíndice III (5X buffer FS y TDT 0,1 M) </td><td> 18080-085 </td><td></td></tr><tr><td> Invitrogen </td><td> Trizol </td><td> 12183555 </td><td></td></tr><tr><td> Invitrogen </td><td> ARN quibit kit de ensayo </td><td> Q32852 </td><td></td></tr><tr><td> Invitrogen </td><td> dsDNA SA qubit kit de ensayo </td><td> Q32851 </td><td></td></tr><tr><td> Invitrogen </td><td> E. coli ADN ligasa </td><td> 18052-019 </td><td></td></tr><tr><td> Invitrogen </td><td> ADN polimerasa T4 </td><td> 18005-025 </td><td></td></tr><tr><td> Invitrogen </td><td> Ultra Pure DNasa RNasa agua </td><td> 10977-015 </td><td></td></tr><tr><td> Invitrogen </td><td> Superíndice II doble varados cDNA síntesis kit </td><td> 11917-020 </td><td></td></tr><tr><td> Invitrogen </td><td> Primer azar (Invitrogen) </td><td> 48190-011 </td><td> Para la preparación de parejas de la muestra final, sólo </td></tr><tr><td> IDT </td><td> Not1Nonamer B imprimación </td><td> N / A </td><td> Para un solo sam Leerejemplo de preparación sólo </td></tr><tr><td> IDT </td><td> Oligo dT T7 </td><td> N / A </td><td></td></tr><tr><td> NEB </td><td> Not1 digestión kit </td><td> R0189S </td><td> Para la preparación de la muestra individual de sólo lectura </td></tr><tr><td> Qiagen </td><td> Rneasy MinElute kit </td><td> 74204 </td><td></td></tr><tr><td> Qiagen </td><td> RNeasy Mini Kit (50) </td><td> 74104 </td><td></td></tr><tr><td> Qiagen </td><td> Gel kit de purificación </td><td> 28604 </td><td></td></tr><tr><td> Qiagen </td><td> DNasa conjunto </td><td> 79254 </td><td></td></tr><tr><td> Qiagen </td><td> Rneasy MinElute kit </td><td> 74204 </td><td></td></tr><tr><td> Zymo Investigación </td><td> ADN limpia y concentrador (250X) </td><td> D4014 </td><td></td></tr></tbody></table>

solo lectura y pareadas final sec arnm bibliotecas de illumina de 10 nanogramos arn total

Single Read and Paired End mRNA-Seq Illumina Libraries from 10 Nanograms Total RNA

La secuenciación del transcriptoma todo por ARNm-Seq ahora se utiliza ampliamente para llevar a cabo la expresión génica global, la mutación, la expresión específica de alelo y otros análisis en todo el genoma. ARNm-Seq, incluso abre la puerta para el análisis de expresión génica de no secuenciado los genomas. ARNm-Seq ofrece una alta sensibilidad, un rango dinámico amplio y permite la medición del número de copias de transcripción en una muestra. Analizador de Illumina genoma lleva a cabo la secuenciación de un gran número (&gt; 10 7) de la secuencia relativamente corto se lee (&lt;150 pb). El &quot;fin de pares&quot;, enfoque, en el que una lectura única y larga es la secuencia en sus dos extremos, permite el seguimiento de los cruces alternativos de empalme , inserciones y eliminaciones, y es útil para de novo de montaje transcriptoma. Uno de los principales desafíos que enfrentan los investigadores es una cantidad limitada de material de partida. Por ejemplo, en experimentos donde se cosechan las células de micro-disección con láser, disponible a partir del ARN total de may medida en nanogramos. Preparación de las bibliotecas de mRNA-Sec de las muestras se han descrito 1, 2, sino que implica importantes amplificación por PCR que puedan introducir sesgos. Otros ARN-Seq procedimientos de construcción de la biblioteca con un mínimo de amplificación de PCR se han publicado 3, 4, sino que requieren cantidades de microgramos a partir de ARN total. A continuación se describe un protocolo para la plataforma Illumina Genoma Analyzer II para la secuenciación de ARNm-Seq para la preparación de la biblioteca, que evita importantes amplificación por PCR y sólo requiere de 10 nanogramos de ARN total. Aunque este protocolo ha sido descrito previamente y validado para un solo fin de la secuencia 5, donde se ha demostrado para producir bibliotecas de dirección sin la introducción de un sesgo de amplificación importantes, aquí lo validamos para su utilización como un protocolo de final emparejados. Nos selectivamente amplificar ARN mensajero de partida poliadenilado ARN total utilizando el método basado en Eberwine T7 amplificación lineal, acuñado &quot;T7LA &quot;(T7 amplificación lineal). La amplificación de poli-A ARNm están fragmentados, transcripción reversa y el adaptador de liga para producir la biblioteca de la secuencia final. Para ambas carreras finales individuales de lectura y pares, las secuencias se asignan a los humanos transcriptoma 6 y normalizado para que los datos de varias ejecuciones se pueden comparar. Presentamos la medida de expresión génica en las unidades de las transcripciones por millón (TPM), que es una medida superior a RPKM al comparar muestras 7.

Aquí se describe un método para la preparación de los dos pares de solo lectura y final Illumina Sec-mRNA bibliotecas genómicas para el análisis de expresión genética basado en la amplificación del ARN T7 lineal. Este protocolo requiere solamente 10 nanogramos de ARN total a partir bibliotecas y genera muy consistente que representa transcripciones conjunto.

Solo lectura y pareadas final Sec ARNm bibliotecas de Illumina de 10 nanogramos ARN total

La secuenciación del transcriptoma completo mediante mRNA-Seq se utiliza actualmente de forma extensiva para realizar análisis globales de expresión génica, mutaciones, expresión alelo-específica y otros...

El objetivo general de este procedimiento es generar bibliotecas de secuencias de mRNA Illumina a partir de pequeñas cantidades de material inicial. El primer paso del procedimiento consiste en transcribir a la inversa el ARN total con cebadores DTT siete para producir ADNc. El ADNc se utiliza para la amplificación del ARN mediante transcripción in vitro. Posteriormente, el ARN amplificado se somete a fragmentación aleatoria.La transcripción inversa del ARN fragmentado produce ADNc, el cual experimenta ligación de adaptadores, selección por tamaño y amplificación por PCR. En última instancia, este protocolo muestra el perfil de expresión génica de la muestra mediante la medición del número de copias de los genes. La principal ventaja de esta técnica es que requiere únicamente 10 nanogramos de ARN total inicial.Eso es órdenes de magnitud menor que lo requerido por otros protocolos existentes. Además, puede generar bibliotecas emparejadas a partir de cantidades tan pequeñas de ARN inicial. Este método permitirá a los científicos explorar nuevas preguntas en biología, posibilitando la determinación de perfiles de expresión génica a partir de poblaciones celulares difíciles de obtener, como las derivadas de captura láser, microdisección o de citometría de flujo.La idea de desarrollar este método surgió inicialmente cuando necesitábamos analizar la expresión génica a partir de un número muy limitado de células diferenciadas de células madre amnióticas humanas. La demostración visual de este método es fundamental, ya que los pasos que implican el manejo de ARN son difíciles de aprender debido a la cantidad muy pequeña de ARN, que puede degradarse fácilmente. El procedimiento será demostrado por Angela Elwell, Jennifer Bolen y Baal Kimm Wynn de mi laboratorio.El método para preparar bibliotecas de secuenciación de lectura simple y de extremos emparejados en paralelo es un procedimiento de varios pasos, como se muestra en este diagrama de flujo. Primero, se aísla ARN total de las células o tejidos de interés y se utiliza para preparar ADNc de doble cadena. Luego, los ARN mensajeros poliadenilados se amplifican selectivamente a partir del ADNc mediante el método de amplificación lineal T siete basado en ewin. A continuación, el poli A amplificado se fragmenta aleatoriamente.Después de purificar el ARN fragmentado, se transcribe a ADNc. El ADNc se reparan los extremos y se añaden bases al extremo tres prima de los fragmentos de ADN. A continuación, se realiza la ligación de adaptadores al ADN y no se lleva a cabo digestión. En el caso de la biblioteca de lectura simple, la biblioteca de ADN se aísla mediante purificación en gel y se amplifica por PCR para ligar los adaptadores de Illumina.Finalmente, después de cuantificar la biblioteca de ADN, esta queda lista para la secuenciación. Para los fines de este video, solo se demostrarán algunos procedimientos seleccionados dentro de este protocolo. La transcripción inversa de los ARNm poliA fragmentados a ADNc implica la síntesis de la primera y segunda cadena.Para la síntesis del primer filamento para la biblioteca de lectura simple, agregue los siguientes reactivos en un tubo de PCR: 10 microlitros de poli mRNA fragmentado y un microlitro del cebador aleatorio no uno nonamérico. La secuencia del cebador no uno nonamérico se muestra aquí. La secuencia cercana al extremo cinco prime mostrada en verde es el sitio de restricción no uno.Aunque la secuencia mostrada en azul es el complemento inverso de la secuencia del adaptador B de Illumina del kit de secuenciación de la placa, incubar la mezcla a 70 grados Celsius durante cinco minutos en el termociclador y luego enfriar rápidamente en hielo. Manteniendo la mezcla en hielo, añadir los siguientes reactantes del kit Superscript III: cuatro microlitros de tampón 5x para primera cadena, dos microlitros de DTT y 1,5 microlitros de mezcla de dNTP. En la mezcla de dNTP, utilizar 5-metil-dCTP en lugar de dCTP. Colocar el tubo en el termociclador a 42 grados Celsius durante dos minutos y luego añadir un microlitro de la transcriptasa inversa Superscript III e incubar a 42 grados Celsius durante una hora.A continuación, prepare la reacción para la síntesis del primer filamento para la biblioteca de extremo para. Añada los siguientes reactivos en un tubo PCR: 10 microlitros de poli NNA fragmentado y un microlitro de cebador hexámero aleatorio. Incube a 65 grados Celsius durante cinco minutos en el termociclador y luego enfríe rápidamente en hielo.Manteniendo el tubo en hielo, agregue los siguientes reactivos del kit Superscript III: cuatro microlitros de tampón para primera cadena 5 x, dos microlitros de DTT y 1,5 microlitros de dNTPs. Incube en el termociclador a 45 grados Celsius durante un minuto. Luego, agregue un microlitro de Superscript III, transcriptasa inversa e incube a 45 grados Celsius durante una hora. Transcurrida una hora,Ambas reacciones están listas para la síntesis de la segunda cadena. Añada a cada mezcla sobre hielo los siguientes reactivos del kit Superscript Two: 91 microlitros de agua libre de nucleasas, 30 microlitros de tampón 5 x para la segunda cadena, tres microlitros de dNTPs, un microlitro de ligasa de ADN de E. coli, cuatro microlitros de polimerasa de ADN de E. coli y un microlitro de RNasa H de E. coli. Mezcle cada tubo mediante inversiones, luego centrifugue brevemente e incube a 16 grados Celsius durante dos horas.Para la reparación de extremos del ADNc para la biblioteca de lectura simple, añada a 40 microlitros de ADNc purificado los siguientes reactivos: cinco microlitros de tampón de ADN ligasa T4 con 10 milimolares de ATP, dos microlitros de mezcla de dNTP, un microlitro de ADN polimerasa T4, un microlitro de enzima klino y un microlitro de T4 PNK para la reparación de extremos del ADNc. Para la biblioteca de lectura apareada, añada a 30 microlitros de ADNc purificado estos reactivos: 45 microlitros de RNAsa, agua libre de DNAsa.10 µL de tampón de la ligasa T4 de ADN con 10 milimolar. ATP 4 µL de mezcla de 10 milimolar DNTP, 5 µL de polimerasa T4 de ADN, 1 µL de enzima klino y 5 µL de T4 PNK; incubar ambos tubos en el termociclador a 20 °C durante 30 minutos tras la reparación final.El siguiente paso en este protocolo consiste en añadir bases de adenina al extremo tres prima de los fragmentos de ADN para la biblioteca de lectura simple. Prepare la siguiente mezcla de reacción: 34 microlitros de muestra de ADN, cinco microlitros de tampón klino, 10 microlitros de DATP y un microlitro de klino exo. Para la biblioteca de lectura apareada, prepare la siguiente mezcla de reacción: 32 microlitros de muestra de ADN, cinco microlitros de tampón clin out.Diez microlitros de DATP y tres microlitros de clin out exo; incubar ambas mezclas de reacción a 37 grados Celsius durante 30 minutos antes de preparar las reacciones para la ligación del adaptador. Descongelar los adaptadores sobre hielo y diluirlos uno a veinte para la biblioteca de lectura simple. Utilizar el kit de preparación de muestras de secuencia de chip de Illumina para preparar la siguiente mezcla de reacción: diez microlitros de muestra de ADN, un microlitro de mezcla de oligos de adaptador, quince microlitros de tampón de ligasa de ADN 2X y cuatro microlitros de ligasa de ADN; incubar durante 15 minutos.A temperatura ambiente para la biblioteca de extremos emparejados, utilice el kit de preparación de muestras de extremos emparejados de Illumina para preparar la siguiente reacción. Mezcle 10 microlitros de muestra de ADN, 10 microlitros de mezcla de oligos de adaptador PE, 25 microlitros de tampón de ligasa 2X y 5 microlitros de ligasa de ADN; incube durante 15 minutos a 20 grados Celsius al final de las incubaciones respectivas. Purifique ambas reacciones de ligación utilizando columnas XMO.Eluir, la biblioteca de lectura simple y 44 microlitros de agua eluyen la biblioteca de extremos emparejados con seis microlitros de tampón de elución, seguido de otra elución en cinco microlitros de EB. Realice una digestión solo con NotI exclusivamente para la biblioteca de lectura simple. Incube de dos horas a toda la noche a 37 grados Celsius tras purificar la reacción utilizando una columna ZY IMO.Eluir la biblioteca de lectura simple con seis microlitros de tampón EB, seguido de una segunda dilución con cinco microlitros de EB. El ADN con adaptador ligado, para ambas bibliotecas, ya está listo para la selección por tamaño. El procedimiento de selección por tamaño del ADN con adaptador ligado se realiza utilizando un 2% del gel Cyber Safe EE de Invitrogen; para comenzar este procedimiento, ejecutar el programa cero de pre-corrida durante dos minutos.Después de la precarga, cargue 10 microlitros del marcador de un KB más y las muestras de ADN 2D. Rellene los pozos vacíos con 10 microlitros de agua y ejecute el programa. Un gel 2 % durante 28 minutos.Una vez finalizada la corrida, seleccione los fragmentos de gel de 200 a 300 pares de bases con una cuchilla nueva. Se evaluó el número de genes identificados por las distintas bibliotecas, y esta tabla muestra información sobre los números de agrupamientos. Genes identificados tasa de error y porcentaje de alineamiento de las bibliotecas de lectura simple y de extremos emparejados para ambas bibliotecas, de lectura simple y de extremos emparejados.Las bibliotecas de 10 nanogramos de T siete LA identificaron casi el mismo número de genes que las bibliotecas amplificadas de 10 microgramos de UN con un valor de TPM de 10 o más. En el caso de las bibliotecas de lectura simple, la biblioteca de 10 nanogramos de T siete LA identificó el 100 % de los 8.500 genes identificados por la biblioteca amplificada de 10 microgramos de UN para bibliotecas paradigmáticas. La biblioteca de 10 nanogramos de T siete LA identificó el 86 % de los genes identificados por la biblioteca de 10 microgramos de UN no amplificada.Las bibliotecas elaboradas con menos de 10 nanogramos no fueron capaces de identificar tantos genes. Por ejemplo, en el protocolo de lectura simple, la biblioteca de T siete LA de un nanogramo identificó solo aproximadamente el 50 % de los genes identificados por la biblioteca de min amp de 10 microgramos. Por lo tanto, la cantidad mínima de ARN total para usar con el protocolo T siete LA debe limitarse a 10 nanogramos mediante la asignación de un gen de mantenimiento.GA DH muestra que todas las bibliotecas T seven LA elaboradas con al menos 10 nanogramos de ARN inicial identificaron todos los exones, incluyendo el exón extremo cinco prime. La barra de escala a la izquierda para las bibliotecas de lectura simple indica un total de 350 lecturas. La barra de escala en el centro para las bibliotecas DEN indica un total de 5.000 lecturas.Una comparación de las bibliotecas de lectura simple y de extremos emparejados T seven LA de 10 nanogramos con las bibliotecas min amp muestra un alto grado de similitud. Se obtuvo un coeficiente de correlación de Spearman de 0,90 entre la biblioteca T seven LA de 10 nanogramos con lectura simple y la biblioteca min amp de 10 microgramos, y una correlación de 0,95 entre la biblioteca T seven LA de 10 nanogramos con extremos emparejados (PEREN) y la biblioteca min amp de 10 microgramos. Además, se realizó una comparación entre las dos bibliotecas de lectura simple y PEREN elaboradas a partir de 10 nanogramos de ARN total, y el coeficiente de correlación muy elevado demuestra que ambos tipos de bibliotecas elaboradas mediante el protocolo T seven LA producen una firma de expresión génica muy similar.Finalmente, dado que estas bibliotecas se prepararon a partir de ARN de células madre embrionarias humanas, se buscó la presencia de genes específicos entre las bibliotecas. Casi todos estos genes fueron identificados mediante las bibliotecas elaboradas a partir de al menos 10 nanogramos de ARN total inicial, lo que valida este protocolo. Durante la realización de este protocolo, es fundamental recordar manipular las muestras de ARN pequeño con extrema precaución para evitar su degradación.Después de ver este video, debería tener una muy buena comprensión de cómo preparar bibliotecas Illumina, lectura simple Mr.Aeq y bibliotecas Paradigm a partir de cantidades muy pequeñas de material inicial.

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