遺伝的にコードされたカルシウムセンサーを発現する鋤鼻器のスライス標本のイメージング神経細胞応答

この手順の全体的な目標は、MRO鼻器官ニューロンのフェロモン応答をイメージングするための生きた組織スライスを準備する方法を説明することです。これは、まず、遺伝的カルシウム指標GCaMP 2を発現するマウスから生きたMRO鼻腔臓器またはVNO組織切片を調製することによって達成されます。次のステップは、スライスを維持し、刺激を加え、イメージングするための顕微鏡ステージ上に灌流システムを設定することです。

応答。次に、さまざまなフェロモン刺激を用いてタイムラプスイメージング実験を行い、続いてイメージング結果のデータ解析を行います。最終的に、異なるフェロモン刺激に対するVNOニューロンの応答パターンが得られます。

この技術や、カルシウムDのローディングや解離細胞でのイメージングなどの既存の方法の主な利点は、細胞の無傷の形態を維持し、スライスの健康をよりよく維持し、より強いシグナルを得ることができることです。この方法は、リガンドとその受容体の特定や個々のワームワームの鼻ニューロン応答のプロファイリングなど、温かい鼻系の研究における重要な質問のいくつかに答えるのに役立ちます。この方法は、嗅覚、血清、脳乾癬などの他のシステムにも適用できます。

一般に、この方法に不慣れな個人は、良好な乾癬を取得し、滲出システムを設定するのが難しいため、苦労する可能性があります。この手順を開始する前に、添付の原稿に従って、マウス、人工脳脊髄液リンガー溶液、4%低融点アロス、フェロモン刺激などの必要な溶液を準備します。次に、低融点のアロスの2本のチューブをヒートブロックに置きます。

温度を摂氏60度以上に設定して、アロスを溶かします。ゲルが液化したら、チューブを摂氏37度のヒートブロックに移します。VNOスライスを準備します。

安楽死させたGCaMP Two Mouseの首を切った後、ハサミで下顎骨を切って下顎を切除します。次に、隆起した上口蓋組織を剥がして鼻腔を露出させます。次に、2つの前切歯の間に外科用刃を挿入して顎の骨を分離します。

顎の骨を慎重に取り外してVNOを露出させます。この時点で、尾骨をつかんでVNO全体を鼻腔から持ち上げます。VNOを冷酸素化マウス、CSF溶液に移します。

解剖スコープのすぐ下で、鉗子の先端を中隔骨の壁に沿って静かにスライドさせることにより、2つのvnoを分離します。VNO組織を包んでいるバルナーボーンを剥がします。次に、骨腔からVI NO組織全体をそっと持ち上げます。

このステップでは、神経上皮の損傷を避けるために細心の注意を払う必要があります。次に、組織表面に残った小さな骨片を完全に取り除きます。埋め込み前に、上のままのフラグメント。

組織は、組織をarosブロックから引き出すカッティングブレードによって捕捉される可能性があります。その後、鉗子を使用してVNO組織の後端を保持し、溶けたアロスにそっと沈めます。氷の上でチューブをすばやく冷却します。

arosを固めるには、埋め込みと冷却のプロセスに2分もかかりません。次に、VNOを含むarosブロックをトリミングし、ティッシュホルダーに接着します。続いて、ティッシュホルダーを金属シリンダーに挿入し、残りのチャンバーに追加の低融点アロを充填します。

低融点のarosが氷上で固まったら、直ちに切片化に進み、すぐに冷酸素化マウスA CSFを組織スライサーの切片室に供給し、スライスをそれぞれ180〜200ミクロンの厚さで切断します。次に、切片スライスを収集してインキュベーションチャンバーに移します。スライスは、酸素化マウスA CSFで室温で6〜8時間生存可能です。

この手順では、まず灌流チャンバーの中央にVNOスライスを配置し、スライスアンカーでスライスを押さえます。アンカーのねじ山は、スライスの低融点アロス部分のみを押す必要がありますが、VNO組織を押し付けないでください。次に、酸素化されたマウスA CSFを、毎秒約100マイクロリットルで入口ポートを介して灌流チャンバーに送達します。

液体は、出口ポートを介して吸引針を介して排出され、新鮮なマウスA CSFの連続的な流れを提供します。次に、30ミリリットルのシリンジにリンガー溶液を充填し、シリンジポンプにクランプします。ポンプ速度を毎分300〜600マイクロリットルに設定します。

スライス上にリンガー溶液を連続的に流すには、リンガーの出口をA-H-P-L-C注入ループに接続します。インジェクションループ制御には2つのフロールートがあります。ロード位置で、マウスの尿のサンプルをハミルトン精密シリンジでサンプルループにロードします。

余分なサンプルは、廃棄物出口を通ってサンプルループから出ます。シリンジポンプによって注入されたリンゲル溶液は、サンプルループをバイパスして、注入位置で灌流チップに接続されている出口に直接行きます。ポンプ溶液はサンプルループを流れ、フェロモン刺激を出口に押し込みます。

イメージング実験の前。灌流液の流れをスムーズにするために、気泡を取り除きます。次に、5 倍または 10 倍のレンズの下で灌流チップを調整し、チップがビアン O スライスから約 1 mm 離れるようにします。

サンプルの遅延時間と持続時間を測定するには、蛍光色素をサンプルループに0.1%rho domine six G色素をロードします。次に、バルブを注入位置に切り替えます。画像取得開始から5秒後、10秒から30秒の間に蛍光シグナルを検出します。

また、蛍光シグナルの滑らかな曲線は、ディッピングレンズ下で発生する乱流がほとんどなく、酸素化マウスのA CSFが十分にスライスに到達していることも示しています。10 x または 20 x の水浸レンズを備えた Zeiss Axio スコープ FS 2 顕微鏡は、GAMP 2 信号を検出するためのタイムラプス イメージングに使用されます。450〜490ナノメートルの標準的なGFPバンドパスフィルターが使用されます。

落射蛍光画像は、GCaMP 2の発現レベルに応じて、1つずつ、または2つずつ回転するCCDカメラで取得されます。まず、取得速度を1フレーム/秒に設定します。光の強度を調整して、GCaMP 2つのシグナルの漂白と細胞への写真の損傷を最小限に抑えます。

次に、バルブを特定の時点での注入位置に切り替えて、一連の実験内ですべての試行で一貫した時間遅延が得られるようにします。次に、サンプル注入中に運動アーチファクトが発生した場合に刺激が灌流セットアップを再調整するため、リンガー溶液を使用してテストランを実行します。その後、マウスの尿を溶液中で1〜100に希釈した状態でポジティブコントロールランを行い、異なるサンプル間の相互汚染を防ぎます。

ハミルトンシリンジをリンガー溶液で少なくとも3回洗浄します。同様に、適用する前に、異なる刺激の間にサンプルループをリンガー溶液で少なくとも3回洗浄します。次の刺激は、MRO鼻感覚ニューロンが回復するまで4〜10分待って、1つのスライスから取得したすべての画像の画像登録を行います。

このプロセスを自動化するために、Avisionでカスタム作成されたVBAスクリプトが使用されます。この場合、同じ実験内のすべての画像フレームは、応答する細胞を識別するために画像減算を実行するために弾性を使用して、共通に選択された参照フレームに対して登録されます。イメージJバージョン1.42のカスタム記述マクロは、このプロセスを自動化するために使用されます。

最小投影イメージはスタックごとに生成され、応答するセルは、最小投影が生スタックから差し引かれた後に出現します。次に、減算されたスタックから関心領域を特定し、画像Jのマルチ測定プラグインを使用してROI座標を取得します。次に、1つの実験のすべてのスタックを処理し、すべてのROI座標をROIマスターリストに保存します。その後、ROIマスターリストを使用して、カスタムで記述されたマクロと画像Jからのマルチ測定プラグインを使用して、生の画像スタックからのセル応答を測定します。

ここでは、4匹のマウスから採取した尿サンプルを用いたVNOイメージング実験の一例を示します。約80個の細胞が尿刺激の少なくとも1つに対する応答を示し、それらの応答デルタFをF値で割った値がヒートマップにプロットされます。これは、細胞1、2、および3の応答トレースであり、尿刺激による活性化の時間経過を示しており、細胞1は両方の女性の尿サンプルに対する応答を示しますが、男性サンプルには応答しません。

一方、セル2は逆の活性化パターンを示し、両方のオスサンプルに応答します。セル3のみが、個々のオスとメスの両方のサンプルによって活性化されます。マストが完成すると、スライスは30分で準備でき、適切に実行されれば、ピアノニューロンは6〜8時間生き続けることができます。

この方法を試す際には、組織培養グレードの試薬を使用し、組織調製物と接触する際に組織固定試薬を避けることを覚えておくことが重要です。このビデオを見れば、マウス発現G Campを使用してウィーンのニューロンの熱応答をイメージングするための生体組織乾癬の準備方法について十分に理解できるはずです。