Ableitung von Gliazellen Eingeschränkte Vorstufen aus E13-Mäusen

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, gliale eingeschränkte Vorläufer oder GRP-Zellen aus dem fetalen Rückenmark zu gewinnen. Dies wird erreicht, indem das Rückenmark aus E 13-Föten extrahiert und auf Kulturplatten mit GFK-Selektivmedien übertragen wird. Als nächstes wird Immuno Panning verwendet, um die GRP-Population anzureichern und die Nicht-GRP-Linie zu eliminieren.

Die gereinigten GFK-Zellen können eingefroren und langfristig gelagert werden. Die gereinigten GFK-Zellen können aufgetaut und für zukünftige Experimente verwendet werden, z. B. um die Migration von transplantierten GRP-Zellen durch eine einzige zellweite Passage zu zeigen. Die visuelle Demonstration dieser Methode ist von entscheidender Bedeutung, da die chirurgischen Schritte schwer zu erlernen sein können, insbesondere für das unerfahrene Auge.

Heute demonstrieren Roche De Silva und Joel Marx. Wer ist Student in unserem Labor Beschaffung von trächtigen Maus-Muttertieren am embryonalen Tag E 12 oder E 13 der fetalen Entwicklung aus einer kommerziellen Quelle oder am Tag der Herstellung im Haus. E one wird durch das Vorhandensein eines vaginal gelegenen Schleimpfropfens definiert.

Am Tag danach wird ein Weibchen mit einem Männchen untergebracht, das alle Instrumente und die Gewebekulturhaube desinfiziert hat. Bereiten Sie eine saubere Petrischale mit 20 Millilitern Kaltdissektionsmedium vor. Bereiten Sie als nächstes die Maus mit einer betäubenden Injektion von Chloralhydrat vor.

Sobald die Maus keinen Schmerzreflex durch ein Zehenkneifen zeigt, z. B. durch Zervixluxation oder Enthauptung, euthanasiert sie sie. Wir ziehen es vor, kein CO2 zur Betäubung des Tieres zu verwenden, da dies möglicherweise nachgelagerte Auswirkungen auf die Lebensfähigkeit der Föten und letztendlich der abgeleiteten Zellen hat. Öffnen Sie nach der Desinfektion des Bauchbereichs den Bauch mit einer großen Schere und Pinzette, um die Gebärmutter zu entfernen. Je nach Stamm enthält die Gebärmutter acht bis 14 Föten.

Legen Sie die Gebärmutter in eine frische Kaltdissektion, Medium in eine saubere Petrischale, um die Föten zu isolieren. Waschen Sie zuerst Blut und überschüssiges Gewebe ab. Entnehmen Sie dann jeden Fötus aus dem Gebärmutterhorn und trennen Sie ihn vom Embryonalsack und der Plazenta.

Bringen Sie die Föten mit einer kleinen Schere in eine Schüssel mit frischer, kühler Sezierung. Mittel. Das kühle Medium senkt die Stoffwechselaktivität und bewahrt die Lebensfähigkeit der abgeleiteten Zellen Unter einem Präpariermikroskop. Schneide mit Pinzette und Federschere die Haut entlang des Rückenmarks durch, schäle sie zurück und lege das Rückenmark frei.

Durchschneiden Sie das Rückenmark etwa bei C eins und am Anfang des Schwanzes. Entfernen Sie dann vorsichtig das Rückenmark mit seinem gesamten Knochen- und Knorpeltransfer und sammeln Sie jedes vorbereitete Rückenmark in einer einzigen Schale. Mit frischem Präpariermedium entnehmen wir das gesamte Rückenmark, obwohl sich dort eine größere Population von GFK-Zellen befindet.

Schließlich wählt jedoch das GRP-Medium für den GRP-Phänotyp aus und diese Population wird weiter durch H zwei B fünf Immun maximiert, um ein Überwachsen von meningealem Gewebe zu verhindern. Entfernen Sie in nachfolgenden Zellkulturen aufgrund der entstehenden hervorstehenden peripheren Nerven so viel wie möglich aus dem Rückenmark. Dies ist schwieriger als die Entfernung von Hirnhautgewebe aus extrahiertem Hirngewebe.

Sobald so viel Hirnhäute wie möglich entfernt wurden, übertragen Sie das Rückenmark in eine 20-Millimeter-Petrischale und fahren Sie mit der Dissoziation fort. Die Zellen in Vorbereitung. Erwärmen Sie ein Aliquot von Trypsin mindestens eine halbe Stunde lang in einem 37 Grad Celsius warmen Wasserbad.

Die folgenden Schritte sollten schnell durchgeführt werden, um die Lebensfähigkeit des abgeleiteten Rückenmarksgewebes zu verbessern. Übertragen Sie das Rückenmark in ein 50-Milliliter-Zentrifugenröhrchen, das Trypsin und DNA enthält. Anschließend die Mischung mit einer Pipette kurz tritrieren.

Inkubieren Sie die Mischung 10 Minuten lang bei 37 Grad Celsius tri. Bewerten Sie es erneut und setzen Sie die Inkubation für weitere 10 Minuten fort. Geben Sie dann fünf Milliliter GFK-Medium für fünf Minuten in die Zentrifuge.

Bei 1000 U/min wird der Überstand und die Wiederbelebung angesaugt. Suspendieren Sie das Pellet in 10 Millilitern GFK-Medium mit DNAs eins. Inkubieren Sie nun weitere 10 Minuten und pelletieren Sie die Zellen fünf Minuten lang bei 1000 U/min.

Saugen Sie den Überstand an und resuspendieren Sie das Pellet. In frischem GFK Medium. Die Zellen werden durch ein 40- bis 70-Mikron-Zellsieb geleitet und auf PLL-Laminin-beschichteten T 25-Kolben plattiert.

Inkubieren Sie die Zellen und wechseln Sie 100% des Mediums am nächsten Tag und dann jeden zweiten Tag oder öfter, wenn die Nährstoffe gefaltet sind. An diesem Punkt haben sich GRPs angeheftet und begonnen, Prozesse zu erweitern, die mit Hilfe von Immuno Panning optimiert werden können. Züchten Sie die Zellen weiter, bis sie zu 85 bis 90 % zusammenfließen oder eine Schwäche überwunden ist.

Ernten Sie dann Zellen mit einem Gummipolizisten oder Trypsin. Reanimation resuspendiert die Zellen in frischen Medien und expandiert sie in drei T 25-Kolben, wobei das Medium mindestens alle 48 Stunden gewechselt wird. Wenn die Kolben die Konfluenz erreicht haben, ernten sie wie bisher in fünf Milliliter GFK-Medien. Tri rate die Zellsuspension, um Klumpen aufzubrechen und sie auf A zwei B fünf beschichtete bakteriologische zu übertragen.

Petrischalen inkubieren die Zellen auf den A-B-Platten eine Stunde lang bei Raumtemperatur ohne Schütteln. Aspirieren Sie dann das Medium und waschen Sie die Platten vier- bis achtmal mit PBS, um eine hohe Stringenz für unspezifische Bindung der Zellen an die Platte aufrechtzuerhalten. Mit einem Gummipolizisten.

Sammeln Sie die gewaschenen Zellen in zwei Millilitern GFK-Medien und überführen Sie die Suspension dann auf PLL-laminabeschichtete Platten oder Kolben mit GFK-Medium. Sobald die Zellen eine Konfluenz von 85 bis 90 % erreicht haben, ernten Sie das nachdenkliche Trypsin, verdünnen und inaktivieren Sie das Trypsin mit acht Millilitern GFK-Material, Medium und sammeln Sie die Zellen als Pellet. Das Volumen der Zellen aus einem T 25-Kolben wird in einem Milliliter GFK-Gefriermedium oder der Zellen aus einem T 75-Kolben in zwei Milliliter GFK-Gefriermedium resuspendiert.

Passen Sie bei Bedarf die Konzentration der Zellsuspension an, geben Sie die Zellen in kryogene Fläschchen und frieren Sie die Zellen am nächsten Tag langsam über Nacht in einem kryogenen Behälter mit Isopropanol bei minus 80 Grad Celsius ein. Übertragen Sie die Zellen in die Langzeitlagerung. Die Zellen sind nach dem Auftauen sechs Monate bis ein Jahr später zu 60 bis 80 % lebensfähig.

Die Rentabilität hängt weitgehend von der Qualität der PLL-Lamininbeschichtung ab. Nach zwei Tagen in Kultur wurde beobachtet, dass sich plattierte Rückenmarkszellen unterschiedlicher Morphologien maximal anreicherten. Die GRP-Populationszellen sind Immunpan zu selektieren für die A zwei B fünf Population.

Wenn es ein Problem mit der Kontamination von Neuroepithelzellen gibt, kann ein doppeltes Immunpanning angewendet werden, um zuerst die NCA-positive Population zu eliminieren, gefolgt von einer A-zwei-B-Fünf-Selektion. Ein T drei freies B 27-Supplement wurde zugesetzt, um die Kontamination reifer Oligodendrozyten zu reduzieren. Gereinigte GFK-Zellen waren an ihrem kleinen Soma und zwei oder drei kurzen Fortsätzen zu erkennen.

Oft gab es auch eine kleine persistente Population von A, zwei B, fünf negativen Zellen, die neuroepithelial waren und in der Lage waren, entweder GRP oder N rp zu werden. Glücklicherweise war es umso wahrscheinlicher, dass die Zellen den GRP-Phänotyp annahmen, je länger sie auf GRP-Medium gehalten wurden. Die grundlegenden Techniken dieses Verfahrens können verwendet werden, um andere Zelltypen abzuleiten, die zusätzliche Fragen beantworten können, wie z.B. welche Zelle besser für die Zellersatztherapie geeignet ist oder ob Cortex-abgeleitete Neuronen gute Modelle für die in vitro Myelinisierung sein können.