Name: E13 farelerin Glial Yasak Öncüleri türetilmesi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-06-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 56 s
Description: Öğrenin, E13 fetüslerinden glial yasak öncüleri (GRP) türetme ve immuno panning ile zenginleştirme yöntemini. Bu protokol, oligodendrosit gelişimi ve demiyelinizan hastalıklar için hücre nakli araştırmalarında kullanılabilir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Biz CTP hücrelerin kullanımı konusundaki anlayış ve geri besleme için Dr Devin Gary teşekkür etmek istiyorum.

Giriş Bu protokolü biz E13 fare fetusların omurilikten glial kısıtlı öncüsü (CTP) hücreleri, ayıklamak seçin ve plaka nasıl gösterir. Bu hücreler oligodendrocytic ve astrositik hücre soyları içindeki erken öncüleri olan ve A2B5 bunların ifadesi tarafından tanımlanır. FGF-2 ile takviye CTP ortamda, A2B5 + GRP erken oligodendrocytic soy işaretleri PDGFαR ve NG2 1,2 ifade başlayacak. Bu oligodendrosit soyu hücreleri, ayrı fenotipik aşamaları, morfolojik değişimler, aynı zamanda belirli bir gelişme aşamasına belirteçlerinin ifadesi ile karakterize edilen, her biri bir dizi geçer. Bu öncül hücreler henüz multipl skleroz, lökodistrofiler ve periventriküler lökomalazi (PVL) 3,4,5,6 dahil olmak üzere merkezi sinir sistemi beyaz cevher hastalıklarında hücre tabanlı tedavi yaklaşımları için potansiyel bir kaynak olarak çalışılmaktadır 6,7,8,9 başarılı remiyelinizasyon bildirdin. Bunlar, glial prekürsör hücreleri gibi omurilik hasarı ve kas erimesiyle ilgili lateral skleroz 10,11,12,13 gibi diğer beyaz madde hastalığı modellerinin çalışmalarda da kullanılmıştır. Laboratuvarımız biz PVL, serebral palsi 14,15,16 önde gelen nedeni bir restoratif yaklaşım olarak CTP türetilen bu hücrelerin omurilik etkinliğini değerlendiren hangi bir erken postnatal hipoksi-iskemi fare modeli geliştirmiştir. CTP hücreleri astrositik yolunun 17 içine ayırt etmek için bir eğilim var bu yana yaygın olarak beyaz cevher hasarı incelemek için kullanılmış olan OPC modeli edilen bir kemirgen beyin de var. OPC fenotip zaten oligodendrosit soy yolu, irreve görünüyor bir fenomen girdirsible. Ancak, GRP ve hatta E10.5 de elde NEP dahil oligodendrosit öncüllerinden daha geniş bir spektrum yanıtı değerlendirirken ilgileniyorlar. Bu nedenle yaptığımız işi için omurilik edilen CTP modelini benimsedik. Hücre değiştirilmesi için GRP kullanımı yanı sıra, beyaz madde hastalıkların vahşi tip ve transjenik kemirgen modellerden bu hücrelerin in vitro türetilmesi ortamda bir normal ve hastalık koşullar altında glial farklılaşma içine daha fazla çalışma sağlar. Önceki yayınlar olgunlaşma bağımlı glutamat eksitotoksik, oksidatif stres ve nöro-inflamasyonu 18,19 karıştığı seçin faktörler gibi çeşitli dış stresörlere oligodendrocytic soy öncü hücrelerin seçici açığına delil göstermek. Çalışmalarımız hücrelerin duyarlılığını değerlendirerek, bu beyaz madde yaralanmaların gelişiminin arkasındaki hücresel ve moleküler mekanizmasının anlaşılması üzerine odaklanmıştıroligodendrosit soy spektrum olası tedavi yaklaşımları analiz yanı sıra hakaret etmek. Malzemeler Hayvanlar ile ilgili tüm prosedürleri PHS politikası ve JHU IACUC uygundur. Tüm işlemler aseptik koşullarda sürdürmek için bir laminer akış kaputu yapılmalıdır. Genellikle diseksiyonlar yatay bir akış kaput ve dikey akış kaput in vitro çalışmalar yapılmaktadır. Tüm medya diseksiyonlar esnasında soğuk kullanılır. Çalışmamızda kullanılan fareler vahşi tip CD-1 suşu ve bir C57/BL6 arka planda bir transgenik GFP vardır. Bir CD-1 fare baraj genellikle tohum 1-2 T25 şişeler için yeterlidir 10 + fetus verir. Genellikle, iki baraj başına 1 T25 şişe içine toplanmış ve kaplama bir zaman ve fetal omurilik kurban edilir. Bir kez hücrelerin genişledi ve daha sonraki çalışmalar için in vitro karakterize edilebilir elde edilmiştir. 1. Medya ve şişeler hazırlanması <ul type="disc"><li> CTP stok; N2 (100X; Invitrogen) ve Takviyeler Bovine Serum Albumin (BSA;% 0.5 w / v) DMEM / F12 01:01 (Invitrogen) + B27 (Invitrogen 50x): orta Diseksiyon ortam olarak kullanılır. </li><li> Çözülme orta: diseksiyon orta aynıdır. </li><li> Kültür ortamı: CTP stoku orta + FGF-2 (10-20 ng / ml; Invitrogen) ve heparin (1 mcg / ml; Sigma). </li><li> PLL / laminin kaplı 75 cm 2 veya 25 cm 2 şişe (T75 veya T25). </li><li> Daha sonra aspire 1 saat boyunca 37 ° C'de inkübe damıtılmış H2O içerisinde; doku kültür şişeleri (75 cm 2, Falcon) 15-20μg/ml poli-L-lisin (Sigma PLL) ile kaplandı. Şişeler PBS sonra sonra aspire ve hücreleri kaplama olmaya hazır olana kadar taze PBS veya medya eklendi, 1 saat boyunca 37 ° C'de 15-20 mcg / ml PBS içinde Laminin (Sigma) ile kaplı olan 1X yıkanır. Kaplama ardından, matara kurumasına asla izin verilmemeli, ancak 4 de PBS veya medya tutulabilir kullanımdan önce kısa dönemler için ° C. </li></ul> 2. Araçlar ve Diğer Material <ul type="disc"><li> Petri: 4 başına baraj: diseksiyon için 3 Petri (75 mm), hasat omurilik toplamak için bir 20 mm çanak. </li><li> Büyük makaslar (43 mm Çalışma makas, Roboz) ve baraj s karnın açılması için doku Forseps. </li><li> Rahim Anatomi ve fetus (15 mm Micro Kesme Makas, Roboz) kaldırılması için küçük makas. </li><li> Mikro Kesme yay makas (6 mm) fetusların omurilik incelemek. </li><li> Mikro cerrahi sırasında baraj ve fetal vücut demirleme ve daha sonra bir kez maruz omurilik kaldırılması için açılı Forseps Dissecting. </li><li> 40 veya kaplama öncesi hücre enkaz kaldırma için 70 mikrometre hücre süzgecinden. </li><li> % 0.05 tripsin 37 ° C'ye kadar önceden ısıtılmış </li><li> 10, bir 100X stoğu olarak hazırlanmıştır mg / ml DNAz 1 (Sigma), (1 g / ml). </li><li> Hayvan cesetleri için Bio-tehlike çantası. </li><li> Işlenmesi için 15 ve 50 ml'lik bir santrifüj tüpü omurilik ekstre edilmiştir. </li></ul> 3. Zamanlı Pr Belirlenmesiegnancy Hamile fare barajlar ya embriyonik gün E12 ya da in-house tespit fetal gelişim veya gebelik E13 teslim belirterek ticari kaynaklardan sıralanır. Kısaca, iki kadın öğleden sonra bir erkek ile birlikte konur ve birlikte bir gecede terk etti. Ertesi gün kadın vajinal bulunan mukus tıkacın varlığı gözleniyor. Mukus tıkacın hayvanlar sonradan kilo artış oranı izlemek için günlük tartılır böylece çiftleşme oluştu sadece bir göstergesidir. Mukus plug görülmektedir günlük embriyonik günde bir (E1) olarak tanımlanır. 4. Doku Derivasyon <ol><li> Aseptik koşullarda korumak için yatay bir akış başlık altında çalışın. </li><li> % 70 etanol ile kaput ve çalışma alanının aşağı püskürtün. </li><li> Otoklav aletleri veya% 70 etanol ile bolca sprey. </li><li> Aletleri, medya ve kullanım için mikroskop hazırlayın. </li><li> Steril Petri di içine soğuk diseksiyon orta 20 ml dökünsh. </li><li> Servikal çıkık ya decapitation takiben intraperitonal (IP) tatbik kloral hidrat (500 mg / kg) ile anestezi hayvan. </li><li> % 70-90 etanol (dezenfeksiyon) ile baraj karın bölgesine Sprey </li><li> Büyük makas ve forseps ile karın açın. <ol type="a"><li> CD1 ve C57/BL6 suşlarında: Genellikle 8 ila 14 fetusun rahim içinde olacaktır. Fetusların sayısı suşu bağlıdır. </li></ol></li><li> Fetus kan ve doku artıkları yıkamak için temiz bir petri taze soğuk diseksiyon orta yavrular ve yer de dahil olmak üzere fare rahim ayıklayın. </li><li> Uterin boynuz her fetus ayıklayın ve küçük makas kullanarak embriyonik kese ve plasenta ayırmak. Yeni bir Petri kabındaki taze diseksiyon ortama çıkarılan fetus aktarın. <ol type="a"><li> Diseksiyon orta metabolik aktivitesi düşük ve elde edilen hücrelerin canlılığını korumak için düşük sıcaklıkta olmalıdır. </li><li> İki forseps ile şu andan itibaren Çalışma vemikro yay makas diseksiyon. </li></ol></li><li> Diseksiyon mikroskobu altında çalışan, mikro cerrahi makas ve omurilik maruz geri kabuğu ile spinal kord boyunca cilt kesti. </li><li> Yaklaşık C1 azından mikrocerrahi makasla ve kuyruk başında spinal kord transect. </li><li> , Künt forseps ile omurilik çıkarın tüm kemik ve kıkırdak çıkarıldığından emin olmak ve orta diseksiyon 3 üncü Petri transfer. </li><li> Sonraki hücre kültürlerinde meningeal doku büyümesi önlemek için omurilikten mümkün olduğunca menenjlerin kadar çıkarmaya çalışın. Doğmakta olan çıkıntılı periferik sinirleri nedeniyle bu ayıklanır serebrum gelen meningeal dokusunun çıkartılması daha zordur. </li><li> Bir kez meninksler kaldırılmış, 20 mm petri için omurilik aktarmak </li><li> Iyice% 70-90 etanol ile alana püskürterek temizleyin. </li><li> Ayrışma için aşağıdaki adımları korumak için hızlı bir şekilde yapılmalıdırspinal kord türetilmiş bir doku yüksek yaşayabilirliği. </li></ol> 5.. Kültür Kuruluşu <ol><li> Tripsin, bir 37 ° CH2, O-banyosu içinde, en azından 30 dakika süreyle ön ısıtılmış edilmelidir. Uygun bir kısım sıcaklık dalgalanmalarına stokunun maruz azaltmak için stok çıkarılmalıdır. </li><li> 10ml önceden ısıtılmış tripsin (% 0.05; Kalite Biologicals) içeren 50 ml'lik bir santrifüj tüpüne hasat omurilik aktarılır ve 100 ul DNAz (10 mg / ml) ve kısa bir süre için öğütmek. </li><li> 37 inkübe ° 10 dakika CH 2 O-banyo. </li><li> Ezip toz haline getirmek ve başka bir 10 dakika süreyle inkübe edilir. </li><li> 5 ml CTP ortamı (yukarıda tanımlandığı gibi) ve 1000 rpm'de 5 dakika boyunca santrifüj ekleyin. </li><li> 10 ml CTP orta süpernatan ve Pastör pipetiyle pelet aspire ve DNAz-1 (10 mg / ml; Sigma) ekleyin. </li><li> 37 inkübe ° 10 dakika CH 2 O-banyo. </li><li> 1000 RPM az 5 dakika santrifüjleyin ve supernatant aspire. </li><li> Fre ile Pastör pipetiyle pelet40 ile sh CTP orta ardından filtre enkaz - 70 mikron hücre süzgecinden. </li><li> PLL / laminin kaplı 25 cm 2 şişe (T25) ve 37 inkübe ° C,% 95 nem ve% 5 CO 2 Plate. </li><li> % 100 medya gününü takip eden on değiştirin. </li><li> Bu noktada, GRP bağlı ve süreçleri uzanan başladı. </li></ol> 6. CTP Nüfus Immunopanning <ol><li> Matara kadar PLL / laminin kaplı şişelerde Plaka spinal kord dokusunda% 85-90 konfluent ya da bir hafta ilgili. </li><li> Lastik bir polis memuru ile veya% 0.05 tripsin ile şişesi sıyırarak Hasat hücreleri iyice çiğnemek fakat nazikçe, 3 ml CTP orta ile 5 dakika iyice Pastör pipetiyle pelet için 1000 RPM hızında santrifüj. </li><li> 3 T25 matara veya 3 ml 1 T75 şişeyi tamamen hücreleri kapak ve şişeler% 80-90 izdiham ulaşmasını sağlayacak orta uygun hacim eklemek için 1 ml her aktarın. </li><li> Her gün medya değiştirin, er orta çabuk bitmesine neden varsa. </li><li> Coat Bakteriyolojik Pe4 'de bir gece tri tabaklar (75 mm) °, bir anti-fare IgG antikoru ile birlikte C (Southern Biotech), 10 ug / ml PBS içerisinde. </li><li> Aşırı tampon aspire ve PBS ile 3x Petri yıkayın. </li><li> 5 ug / oda sıcaklığında (RT), 1 saat boyunca inkübe ve PBS ile seyreltilerek ml 'lik bir konsantrasyonda A2B5 antikoru (Millipore) eklenir. </li><li> Daha sonra plakası kurumasını önlemek için CTP orta 8 ml eklemek PBS ile tekrar 3x plakaları yıkayın. </li><li> Tüm hücreleri ayırmak için kauçuk bir polis memuru ile matara sıyırarak Petri ve hasat CTP hücrelerinden CTP orta 5 ml transfer </li><li> Kümeleri parçalamak ve A2B5 kaplı bakteriyolojik Petri için 5ml hücre süspansiyonu aktarmak için kısaca hücre süspansiyonu öğütmek. </li><li> Çalkalama olmadan, oda sıcaklığında 1 saat inkübe. </li><li> 1 saat aspirat medya ve PBS ile 8x tabaklarını yıkıyorum sonra. </li><li> Yavaşça sonra CTP orta uygun hacmi ile PLL / laminin kaplamalı plakalar veya balonları aktarmak 2 ml CTP medyada bir lastik polis memuru ile hücreleri kazıyın. </li> 7. Türetilmiş Hücre Dondurma ve Depolama <ol><li> Hücreler 2 ml% 0.05 tripsin ile% 85-90 konfluent T25 veya T75 şişesi hasat edilir. </li><li> Tripsin seyreltilmiş ve inaktive 8ml CTP stoku orta ve 5 dk için 1000 RPM santrifüj edilir. </li><li> T25 şişeler gelen pelet 1 ml CTP donma ortamı, (CTP stoku orta 10% (v / v) DMSO ve isteğe bağlı olarak,% 20 FBS ile desteklenmiş) içinde tekrar süspanse edilir. T75 şişelerinden alınmış daha büyük peletler iki misli seyreltilir. </li><li> 1.5 hücre süspansiyonları - 3 x 10 10,11,12,13 hücre kriyojenik flakon (Nalgene) aktarılır ve ° C gece boyunca yavaş yavaş dondurma -80 az izopropanol içeren bir kriyojenik konteyner (Nalgene) geceleme saklanır. </li><li> Gece donma hücreleri ardından dondurucu kutuları aktarılarak -80 az 6 ay ile 1 yıl saklanır N ° C veya daha uzun süreli (l). Çözülmüş hücreleri, genellikle PLL / laminin kaplama kalitesine bağlı olarak büyük ölçüde uygun bir% 60-80 vardır. </li></ol> 8. Temsilcisi Sonuçlar CO 2, çünkü cenin ve sonuçta elde edilen hücre canlılığı üzerindeki olası aşağı etkisi hayvan anestezi için kullanılmaz. Ayrıca, tamamen türev işlem sırasında omurilikten meninksler çıkarmak çok zor olacak ama CTP orta ve immunopanning kombinasyonu bu hızlı büyüyen hücreleri ortadan kaldıracaktır. Aynı şekilde, tüm spinal kord onun ventral spinal kord menşeli ve dorsal 20 geçiş nedeniyle CTP nüfusun daha büyük bir ventral konsantrasyonu rağmen hasat edilir. Ancak CTP orta CTP fenotip için seçer ve bu nüfusun A2B5 immunopanning en üst seviyeye ulaşır. Spinal kord dokular kaplama sonra, in vitro kültürler, iki ya da bölümler için bir hafta inkübe edilir. Kültüründe 2 gün sonra, farklı morfolojiye hücreleri hetero gösteren doku kültür şişeleri görülebilirnüfusun ancak CTP orta geneity CTP fenotip için seçer. Bu hücreler A2B5 bir kombinasyonu + CTP, E-NCAM + nöronal kısıtlı öncüleri (NRP) ve nestin +, A2B5-nöroepitelyal hücreleri ve muhtemelen fibronektin + meningeal hücrelerdir. Buna ek olarak, daha olgun fenotipleri başlangıç ​​heterojen havuzu (Şekil 1A) bir çok CTP zenginleştirilmiş nüfusu arttırmak için doublekortin ve nöronal soyu için Tuj1, astrositler için GFAP ve oligo soyu için PDGFaR ve GALC dahil olmak üzere mevcut ifade göstergeleri olabilir, hücreleri olabilir hücre yoğunluğu T75 şişelerde konfluense 85-90 yaklaşık% artmıştır kez A2B5 için seçim ardından E-NCAM + hücreleri + CTP nüfus seçin ve ortadan kaldırmak için çift immunopanned olabilir. Bunlar, CTP hücreleri daha sonra A2B5 immunopanning bir zenginleştirilmiş CTP nüfusu korumak için gerekli olabilir böylece oligodendrosit fenotip için seçer bir ortamda olmasına rağmen astrositler olma yetenekleri korur. Immunopanning homomüttefiki verimleri% 95 A2B5 + hücrelerine çok daha fazla verim için A2B5 konjuge manyetik bilye (Miltenyi Biotec A.Ş.) kadar% 97 bir verim sağlamak için kullanılabilir. Böyle düzenli ortam değişiklikleri gibi bakım CTP kültürlerde Teyakkuz olmayan CTP hücre tipinin çoğalması en aza indirecektir. Hatta yokluğunda BMP-4 astrositler hala bulunamadı ve boşalmış olabilir, özellikle medyanın bir astrositik fenotipi farklılaşma yol gibi görünüyor. B27 takviyesi tri-iodothyronine hormonu (T3) içerse de, bu olay meydana gelmez T3 yüksek düzeyde orta eklenir sadece, CTP nüfus oligodendrosit içine ayırt etmek için hiçbir gözlenen eğilim oldu. Olgun oligodendrosit (Şekil 1B) ile kontaminasyon için bir endişe varsa Ancak, serbest T3 B27 takviyesi ikame edilebilir. Bu CTP hücreleri kolayca 2 veya 3 kısa süreçler küçük soma kendi morfolojisi ile ancak diğer hücre tipleri mevcut olabilir, im için ekrana tespit edilebilirmunocytochemistry önceden adlı ortak gelişim ve hücre tipi özel belirteçler için yapılabilir. Yaygın nöroepitelyal (NEP) ve CTP veya NRP ya haline yeteneğine sahiptirler A2B5-hücrelerinin, küçük bir kalıcı nüfusu olacaktır. Neyse ki, artık hücreleri orta CTP fenotip için seçecektir olasılığı daha düşüktür CTP ortamda tutulur. <img alt="Şekil 1." src="/files/ftp_upload/3462/3462fig1.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Şekil 1."> Şekil 1. A) heterojen morfoloji Kaplama omurilikte hücreler kültürde 2 gün sonra görülür. B) Immunopanning başlangıç ​​heterojen havuzundan çok GRP zenginleştirilmiş nüfus en üst düzeye çıkarır. </ol>

<ol><li>Kalyani, A., Hobson, K., Rao, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroepithelial+stem+cells+from+the+embryonic+spinal+cord%3A+isolation%2C+characterization%2C+and+clonal+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+biology%22%5BJournal%5D)">Neuroepithelial stem cells from the embryonic spinal cord: isolation, characterization, and clonal analysis.</a> Developmental biology. 186, 202-202 (1997).</li>
<li>Rao, M. S., Mayer-Proschel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glial-restricted+precursors+are+derived+from+multipotent+neuroepithelial+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+biology%22%5BJournal%5D)">Glial-restricted precursors are derived from multipotent neuroepithelial stem cells.</a> Developmental biology. 188, 48-48 (1997).</li>
<li>Goldman, S. A., Lang, J., Roy, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progenitor+cell-based+myelination+as+a+model+for+cell-based+therapy+of+the+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Ernst+Schering+Research+Foundation+workshop%22%5BJournal%5D)">Progenitor cell-based myelination as a model for cell-based therapy of the central nervous system.</a> Ernst Schering Research Foundation workshop. (60), 195-195 (2006).</li>
<li>Goldman, S. A., Schanz, S., Windrem, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cell-based+strategies+for+treating+pediatric+disorders+of+myelin%5BTitle%5D)+AND+%22Human+molecular+genetics%22%5BJournal%5D)">Stem cell-based strategies for treating pediatric disorders of myelin.</a> Human molecular genetics. 17, 76-76 (2008).</li>
<li>Goldman, S. A., Windrem, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+replacement+therapy+in+neurological+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Philosophical+transactions+of+the+Royal+Society+of+London%22%5BJournal%5D)">Cell replacement therapy in neurological disease.</a> Philosophical transactions of the Royal Society of London. 361, 1463-1463 (2006).</li>
<li>Walczak, P., All, A. H., Rumpal, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+glial-restricted+progenitors+survive%2C+proliferate%2C+and+preserve+electrophysiological+function+in+rats+with+focal+inflammatory+spinal+cord+demyelination%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Human glial-restricted progenitors survive, proliferate, and preserve electrophysiological function in rats with focal inflammatory spinal cord demyelination.</a> Glia. 59, 499-499 (2011).</li>
<li>Liu, S., Qu, Y., Stewart, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+stem+cells+differentiate+into+oligodendrocytes+and+myelinate+in+culture+and+after+spinal+cord+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Embryonic stem cells differentiate into oligodendrocytes and myelinate in culture and after spinal cord transplantation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97, 6126-6126 (2000).</li>
<li>Windrem, M. S., Schanz, S. J., Guo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neonatal+chimerization+with+human+glial+progenitor+cells+can+both+remyelinate+and+rescue+the+otherwise+lethally+hypomyelinated+shiverer+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+stem+cell%22%5BJournal%5D)">Neonatal chimerization with human glial progenitor cells can both remyelinate and rescue the otherwise lethally hypomyelinated shiverer mouse.</a> Cell stem cell. 2, 553-553 (2008).</li>
<li>Groves, A. K., Barnett, S. C., Franklin, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repair+of+demyelinated+lesions+by+transplantation+of+purified+O-2A+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Repair of demyelinated lesions by transplantation of purified O-2A progenitor cells.</a> Nature. 362, 453-453 (1993).</li>
<li>Back, S. A., Han, B. H., Luo, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+vulnerability+of+late+oligodendrocyte+progenitors+to+hypoxia-ischemia%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Selective vulnerability of late oligodendrocyte progenitors to hypoxia-ischemia.</a> J. Neurosci. 22, 455-45 (2002).</li>
<li>Johnston, M. V., Trescher, W. H., Ishida, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurobiology+of+hypoxic-ischemic+injury+in+the+developing+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatric+research%22%5BJournal%5D)">Neurobiology of hypoxic-ischemic injury in the developing brain.</a> Pediatric research. 49, 735-735 (2001).</li>
<li>Lepore, A. C., Han, S. S., Tyler-Polsz, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+fate+of+multipotent+and+lineage-restricted+neural+precursors+following+transplantation+into+the+adult+CNS%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron+glia+biology%22%5BJournal%5D)">Differential fate of multipotent and lineage-restricted neural precursors following transplantation into the adult CNS.</a> Neuron glia biology. 1, 113-113 (2004).</li>
<li>Rothstein, J. D., Dykes-Hoberg, M., Pardo, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Knockout+of+glutamate+transporters+reveals+a+major+role+for+astroglial+transport+in+excitotoxicity+and+clearance+of+glutamate%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Knockout of glutamate transporters reveals a major role for astroglial transport in excitotoxicity and clearance of glutamate.</a> Neuron. 16, 675-675 (1996).</li>
<li>Johnston, M. V., Ferriero, D. M., Vannucci, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Models+of+cerebral+palsy%3A+which+ones+are+best%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+child+neurology%22%5BJournal%5D)">Models of cerebral palsy: which ones are best.</a> Journal of child neurology. 20, 984-98 (2005).</li>
<li>Comi, A. M., Johnston, M. V., Wilson, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strain+variability%2C+injury+distribution%2C+and+seizure+onset+in+a+mouse+model+of+stroke+in+the+immature+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+neuroscience%22%5BJournal%5D)">Strain variability, injury distribution, and seizure onset in a mouse model of stroke in the immature brain.</a> Developmental neuroscience. 27, 127-127 (2005).</li>
<li>Comi, A. M., Weisz, C. J., Highet, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+model+of+stroke+and+ischemic+seizures+in+the+immature+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatric+neurology%22%5BJournal%5D)">A new model of stroke and ischemic seizures in the immature mouse.</a> Pediatric neurology. 31, 254-254 (2004).</li>
<li>Dietrich, J., Noble, M., Mayer-Proschel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+A2B5%2B+glial+precursor+cells+from+cryopreserved+human+fetal+brain+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Characterization of A2B5+ glial precursor cells from cryopreserved human fetal brain progenitor cells.</a> Glia. 40, (2002).</li>
<li>Alberdi, E., Sanchez-Gomez, M. V., Marino, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ca%282%2B%29+influx+through+AMPA+or+kainate+receptors+alone+is+sufficient+to+initiate+excitotoxicity+in+cultured+oligodendrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiology+of+disease%22%5BJournal%5D)">Ca(2+) influx through AMPA or kainate receptors alone is sufficient to initiate excitotoxicity in cultured oligodendrocytes.</a> Neurobiology of disease. 9, 234-234 (2002).</li>
<li>Volpe, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain+injury+in+premature+infants%3A+a+complex+amalgam+of+destructive+and+developmental+disturbances%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+neurology%22%5BJournal%5D)">Brain injury in premature infants: a complex amalgam of destructive and developmental disturbances.</a> Lancet neurology. 8, 110-110 (2009).</li>
<li>Warf, B. C., Fok-Seang, J., Miller, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+the+ventral+origin+of+oligodendrocyte+precursors+in+the+rat+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Evidence for the ventral origin of oligodendrocyte precursors in the rat spinal cord.</a> J. Neurosci. 11, 2477-2477 (1991).</li>
<li>Deng, W., Poretz, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oligodendroglia+in+developmental+neurotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Neurotoxicology%22%5BJournal%5D)">Oligodendroglia in developmental neurotoxicity.</a> Neurotoxicology. 24, 161-161 (2003).</li>
<li>Deng, W., Rosenberg, P. A., Volpe, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium-permeable+AMPA%2Fkainate+receptors+mediate+toxicity+and+preconditioning+by+oxygen-glucose+deprivation+in+oligodendrocyte+precursors%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Calcium-permeable AMPA/kainate receptors mediate toxicity and preconditioning by oxygen-glucose deprivation in oligodendrocyte precursors.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100, 6801-6801 (2003).</li>
<li>Karadottir, R., Cavelier, P., Bergersen, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NMDA+receptors+are+expressed+in+oligodendrocytes+and+activated+in+ischaemia%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">NMDA receptors are expressed in oligodendrocytes and activated in ischaemia.</a> Nature. 438, 1162-1162 (2005).</li>
<li>Pleasure, D., Soulika, A., Singh, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammation+in+white+matter%3A+clinical+and+pathophysiological+aspects%5BTitle%5D)+AND+%22Mental+retardation+and+developmental+disabilities+research+reviews%22%5BJournal%5D)">Inflammation in white matter: clinical and pathophysiological aspects.</a> Mental retardation and developmental disabilities research reviews. 12, 141-141 (2006).</li>
<li>Gregori, N., Proschel, C., Noble, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+tripotential+glial-restricted+precursor+%28GRP%29+cell+and+glial+development+in+the+spinal+cord%3A+generation+of+bipotential+oligodendrocyte-type-2+astrocyte+progenitor+cells+and+dorsal-ventral+differences+in+GRP+cell+function%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The tripotential glial-restricted precursor (GRP) cell and glial development in the spinal cord: generation of bipotential oligodendrocyte-type-2 astrocyte progenitor cells and dorsal-ventral differences in GRP cell function.</a> J. Neurosci. 22, 248-248 (2002).</li>
<li>Rao, M. S., Noble, M., Mayer-Proschel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+tripotential+glial+precursor+cell+is+present+in+the+developing+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">A tripotential glial precursor cell is present in the developing spinal cord.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95, 3996-3996 (1998).</li>
<li>Raff, M. C., Miller, R. H., Noble, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+glial+progenitor+cell+that+develops+in+vitro+into+an+astrocyte+or+an+oligodendrocyte+depending+on+culture+medium%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A glial progenitor cell that develops in vitro into an astrocyte or an oligodendrocyte depending on culture medium.</a> Nature. 303, 390-390 (1983).</li>
<li>Strathmann, F. G., Wang, X., Mayer-Proschel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+two+novel+glial-restricted+cell+populations+in+the+embryonic+telencephalon+arising+from+unique+origins%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+developmental+biology%22%5BJournal%5D)">Identification of two novel glial-restricted cell populations in the embryonic telencephalon arising from unique origins.</a> BMC developmental biology. 7, 33-33 (2007).</li>
<li>Nunes, M. C., Roy, N. S., Keyoung, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+isolation+of+multipotential+neural+progenitor+cells+from+the+subcortical+white+matter+of+the+adult+human+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Identification and isolation of multipotential neural progenitor cells from the subcortical white matter of the adult human brain.</a> Nature. 9, 439-439 (2003).</li>
<li>Roy, N. S., Wang, S., Harrison-Restelli, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification%2C+isolation%2C+and+promoter-defined+separation+of+mitotic+oligodendrocyte+progenitor+cells+from+the+adult+human+subcortical+white+matter%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Identification, isolation, and promoter-defined separation of mitotic oligodendrocyte progenitor cells from the adult human subcortical white matter.</a> J. Neurosci. 19, 9986-9986 (1999).</li>
<li>Chen, Y., Balasubramaniyan, V., Peng, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+of+rat+and+mouse+oligodendrocyte+precursor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+protocols%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture of rat and mouse oligodendrocyte precursor cells.</a> Nature protocols. 2, 1044-1044 (2007).</li>
</ol>

Bu çalışma Ulusal Sağlık Enstitüsü [NICHD P30HD024061 (AWP), NINDS K08NS063956 (AF) ve R01NS028208 (MVJ)] ve Çocuk Nörolojisi Vakfı tarafından finanse edildi. Bu raporun içeriği sadece yazarların sorumluluğundadır ve mutlaka Ulusal Sağlık Enstitüsü, DHHS resmi görüşlerini temsil etmemektedir. Yazarlar bu çalışma ile ilgili Çıkar çatışması var.

<p class="jove_content"Merkezi sinir sistemi beyaz bir madde&gt; Bozuklukların genetik, enflamatuar iskemik ve toksik nedenler de dahil olmak üzere nedenlere bağlı olarak çok sayıda içerir<sup&gt; 19,21,22,23,24</sup&gt;. Multipl skleroz ve damar hastalığı erişkinlerde beyaz cevher hastalığı önde gelen nedeni iken, prematüre ile ilişkili periventriküler lökomalazi çocukluk nüfus beyaz cevher hasarı en sık nedenidir. Daha da büyük ölçüde hastalığın mekanizmaları perinatal hakarettir etkilenen hücreler ofoligodendrocytic soyu, daha da çalışma tasvir amacıyla gereklidir. GRP kemirgen embriyonik omurilik izole ve oligodendrosit ve iki ayrı astrosit nüfus sebebiyet veren, doğada tripotential olduğu gösterilmiştir, ancak nöron içine ayırmayız edildi<sup&gt; 2,25,26</sup&gt;. Aynı şekilde, sıçan optik sinir ve geç embriyonik veya erken postnatal sıçan beyin türetilen oligodendrosit öncül hücrelerin (OPC) uygun ortam koşullarında işleyen oligodendrosit içine olgun bulunduğu gösterilmiştir<sup&gt; 27,28</sup&gt;. Ayrıca, fetal veya yetişkin alınan insan OPC daha daha olgun oligodendrosit fenotipleri içine manipüle edilmiş<sup&gt; 29,30</sup&gt;.</p&gt;<p class="jove_content"&gt; CTP hücreleri spinal E13.5 sıçanların kablosu ve farelerde E12-13.5 hem de izole edilmiştir. Sıçan farklılıkları ventral kaynaklı GRP daha olgun fenotipleri içine ayırt etmek için daha büyük bir eğilim sergileyen oligodendrosit veya astrositlerin nesil teşvik koşullarına tepki olarak dorsal ve ventral kökenli CTP hücreleri arasında bildirilmiştir<sup&gt; 25,26,28</sup&gt;. Bu farklılaşma ipuçlarını daha az alıcı olabilir doğmakta olan CTP hücreleri, dorsal göç ventral bağlı olabilir olduğunu. Immunopanning izole ve kültür bakım için alınacak A2B5 ifade subpopülasyonu sağlar.</p&gt;<p class="jove_content"&gt; Bizim fare CTP kültürleri CTP hücrelerin kimyasal (orta) ve antikor bazlı teknikler seçilir hangi hücrelerin heterojen, toplanmış nüfus verir total spinal kord dokusu elde edilir. Çalışmalarımız omurilik edilen fare CTP hücreleri yararlanmakta iken, daha yakın zamanda olgun oligodendrosit dönüşme yeteneğine sahip beyin kaynaklı fare oligodendrosit progenitör hücrelerin derivasyon bildirilmiştir<sup&gt; 31</sup&gt;. Burada elde edilen hücreler başlangıçta uygun kültür ortamı kullanılarak zenginleştirilmiş PDGFαR +, OPC nüfusu içine manipüle olduğunu oligospheres olarak kültürlenmiştir<sup&gt; 31</sup&gt;. Çalışmalarımız A2B5 gelen +, PDGFαR-CTP öncüleri miyelin bazik protein (MBP +) olgun oligodendrosit ifade etmek oligodendrosit soy spektrum hücreleri üzerinde hipoksik iskemik hasara bizim modelinin etkisi üzerine yoğunlaşmıştır. Nitekim bizim<em&gt; In vitro</em&gt; Karakterizasyonu monokültürler veya kortikal nöronlar ile eş-kültürlerinde ya MBP Salgılayan hücrelerin içine bu olgunlaşmamış CTP hücreleri olgun göstermiştir. Bu hücreler perinatal beyaz cevher hasarı ile ilgili mekanizmalar eğitim için belirli bir farklılaşma yolları içine kültüründe manipüle edilebilir. Oligodendrosit soy ve bu nüfusun durumu hücreleri içeren beyaz cevher hastalıkların çeşitli fare modelleri yaralanma yanı sıra olası hücre tedavi seçeneklerinin yararlılığını keşfetmek için neden mekanizmalarına ayrıntılı bir soruşturma için izin vardır.</p

<table border="1"><tbody><tr><th> Reaktif Adı </th><th> Şirket </th><th> Katalog numarası </th></tr><tr><td> DMEM / F12 01:01 </td><td> Invitrogen </td><td> 11320033 </td></tr><tr><td> B27 </td><td> Invitrogen </td><td> 17504044 </td></tr><tr><td> N2 </td><td> Invitrogen </td><td> 17502048 </td></tr><tr><td> rH-FGF-temel </td><td> Invitrogen </td><td> PHG0026 </td></tr><tr><td> Tripsin (% 0.05) EDTA </td><td> Kalite Biyolojik, Inc </td><td> 118-087-721 </td></tr><tr><td> Poli-L-Lizin HBr </td><td> Sigma </td><td> P1274-25mg </td></tr><tr><td> Laminin </td><td> Sigma </td><td> L2020-1MG </td></tr><tr><td> Dnaz 1 </td><td> Sigma </td><td> DN25 </td></tr></tbody></table>

e13 farelerin glial yasak Öncüleri türetilmesi

Derivation of Glial Restricted Precursors from E13 mice

Bu E13 fare fetusların omurilikten glial kısıtlı öncüsü (CTP) hücreleri türetilmesi için bir protokoldür. Bu hücreler oligodendrocytic hücre soyu içinde erken öncüleri vardır. Son zamanlarda, bu hücreler beyaz cevher hastalıklarında restoratif tedaviler için potansiyel kaynak olarak ele alınmıştır. Periventriküler lökomalazi (PVL), çocukluk çağında olmayan genetik beyaz cevher hastalığı önde gelen nedenidir ve çok erken doğan bebeklerin% 50 etkiler. Veri hipoksi-iskemi gelişen beyin, oksidatif stres ve seçici doğmakta olan beyaz cevher hedefleyen eksitotoksisite yükseltilmiş bir duyarlılık göstermektedir. Glial kısıtlı öncüleri (CTP), oligodendrosit progenitör hücrelerin (OPC) ve olgunlaşmamış oligodendrosit (preOL) PVL gelişiminde anahtar oyuncular olacak gibi görünüyor ve sürekli çalışmalar tabidir. Ayrıca, önceki çalışmalar gibi eksitotoksisite Glutamat duyarlılık artmıştır MSS dokusu bir alt belirledikBu duyarlılık için gelişimsel bir desen de. Laboratuvarımız şu anda gelişim aşamasında CTP PVL ve kullanım hücrelerinde oligodendrosit progenitörlerin rolünü araştırıyor. Biz PVL ile tutarlı gerilmelerin seçmek için tepkilerini test etmek için bir çok deneysel paradigmalar bu elde edilen CTP hücreleri kullanır. CTP hücreleri fare modelleri ile PVL ve hipoksi-iskemi dahil olmak üzere PVL gibi hakaretlerle vitro model nakli deneyler için OPC ve preOL içine in vitro manipüle edilebilir. Kültür hücreleri kullanılarak ve in vitro çalışmalar verilerin yorumlanması kolaylaştırır deneyler arasında değişkenlik azalacaktır By. Olmayan CTP fenotip hücreleri kirletici etkisini en aza indirirken Kültür hücreleri de CTP nüfusun zenginleşmesine olanak sağlar.

Bu protokol, fetal spinal kablolarından Glial Yasak Öncüleri derivasyon özetliyor ve transplantasyon için veya oligodendrocytic soyunun çalışma için ya in vitro korunmuştur.

E13 farelerin Glial Yasak Öncüleri türetilmesi

Bu protokol, E13 fare fetüslerinin spinal kordundan glial kısıtlı öncül (GRP) hücrelerin türetilmesine yöneliktir. Bu hücreler, erken öncül...

Bu prosedürün genel amacı, fötal omuriliklerden glial kısıtlı öncül hücreler veya GRP hücreleri türetmektir. Bu işlem, E 13 fötüslerinden omuriliklerin çıkarılması ve GRP Selektif Medyuma sahip kültür plaklarına aktarılmasıyla gerçekleştirilir. Ardından, GRP popülasyonunu zenginleştirmek ve GRP dışı soy hatlarını elemek için immünopanning yöntemi kullanılır.Saflaştırılmış GRP hücreleri dondurulabilir ve uzun süreli saklamaya alınabilir. Saflaştırılmış GRP hücreleri, nakledilen GRP hücrelerinin tek hücre genişliğindeki bir geçitten geçerek göç etmelerini göstermek gibi gelecek deneyler için çözdürülebilir ve kullanılabilir. Cerrahi adımların öğrenilmesinin, özellikle deneyimsiz kişiler için zor olabilmesi nedeniyle, bu yöntemin görsel olarak gösterilmesi kritik önem taşımaktadır.Bugünkü gösterimi gerçekleştirecek olanlar, laboratuvarımızdaki öğrenciler Roche De Silva ve Joel Marx'tır. Ticari bir kaynaktan veya kurum içinde hazırlanan, fetal gelişimin embriyonik E 12 veya E 13. günündeki gebe fare annelerini temin edin. E 1. gün, vajinal bölgede bir mukus tıkaçının varlığı ile tanımlanır.Kısırlaştırılmış bir dişinin bir erkekle birlikte konulduğu günün ertesinde, tüm aletler ve doku kültürü kabini sterilize edildikten sonra; 20 mililitre soğuk diseksiyon medyumu içeren temiz bir Petri kabı hazırlayın. Ardından, fareyi kloral hidrat ile anestezi enjeksiyonu yaparak hazırlayın.Örneğin, fare ayak parmağı sıkıştırmasına karşı ağrı refleksi göstermediğinde, servikal dislokasyon veyadekapitasyon yoluyla ötanazi uygulayın. Fetüslerin canlılığı ve nihayetinde türetilen hücreler üzerindeki olası etkileri nedeniyle, hayvanı anestezilemek için CO2 kullanmamayı tercih ediyoruz. Karın bölgesini dezenfekte ettikten sonra, uterusu çıkarmak için büyük makas ve forseps kullanarak karnı açın. Fare suşuna bağlı olarak uterus sekiz ila 14 fetüs içerecektir.Fetüsleri izole etmek için uterusu temiz bir Petri kabı içindeki taze soğuk diseksiyon ortamına yerleştirin. İlk olarak, kanı ve fazla dokuları yıkayarak temizleyin. Ardından her bir fetüsü uterin korna'dan çıkarın ve onları embriyonik keseden ve plasentadan ayırın.Küçük makaslar kullanarak fetüsleri taze, soğuk diseksiyon ortamı içeren bir kaba aktarın. Soğuk ortam, metabolik aktiviteyi düşürecek ve türetilen hücrelerin canlılığını koruyacaktır. Bir diseksiyon mikroskobu altında, pens ve yaylı makas kullanarak deriyi omurilik boyunca kesin, geriye doğru soyun ve omuriliğe ulaşın.Omuriliği yaklaşık C1 seviyesinden ve kuyruğun başlangıcından kesin. Ardından, omuriliği tüm kemik ve kıkırdak yapılarıyla birlikte dikkatlice çıkarın ve hazırlanan her bir omuriliği tek bir petri kabına toplayın. Taze diseksiyon ortamı kullanarak, GRP hücrelerinin daha yoğun bulunduğu bölgeler de dahil olmak üzere omuriliğin tamamını topluyoruz.Ancak sonuç olarak, GRP besiyeri GRP fenotipine göre seçim yapar ve meningeal dokunun aşırı büyümesini önlemek için bu popülasyon H two B five immünoseleksiyon ile daha da maksimize edilir. Sonraki hücre kültürlerinde, yeni oluşan ve dışarı uzanan periferik sinirler nedeniyle, spinal korddan meningeslerin mümkün olduğunca fazlasını uzaklaştırın. Bu işlem, çıkarılmış serebral dokudan meningeal dokuyu uzaklaştırmaktan daha zordur.Meninges mümkün olduğunca temizlendikten sonra, spinal kordları 20 milimetrelik bir Petri kabına aktarın ve dissosiyasyon işlemine geçin. Hazırlık aşamasındaki hücreler için, bir alikvot tripsini 37 derece Celsius'lik bir su banyosunda en az yarım saat önceden ısıtın.Elde edilen omurilik dokusunun canlılığını artırmak için aşağıdaki adımlar hızlıca uygulanmalıdır. Omurilikleri, tripsin ve DNAs içeren 50 mililitrelik bir santrifüj tüpüne aktarın. Ardından, karışımı bir pipetleyici ile kısa sürede triture edin.Karışımı 37 °C'de 10 dakika boyunca inkübe edin. Karışımı tekrar döndürün ve ardından inkübasyona 10 dakika daha devam edin. Sonrasında beş mililitre GRP ortamı ekleyin ve beş dakika boyunca santrifüjleyin.1000 RPM'de süpernatantı aspire edin ve resüspande edin. Peleti, DNAs one içeren 10 mililitre GRP medyumunda süspande edin. Ardından 10 dakika daha inkübe edin ve hücreleri 1000 RPM'de beş dakika boyunca pelletleyin.Süpernatantı aspire edin ve peleti taze GRP medyumunda yeniden süspande edin. Hücreleri 40 ila 70 mikronluk bir hücre süzgecinden geçirin ve PLL laminin kaplı T 25 flasklara ekleyin.Hücreleri inkübe edin, ertesi gün besiyerinin %100'ünü değiştirin ve ardından gün aşırı veya besinler tükendiğinde daha sık olarak değiştirme işlemini tekrarlayın. Bu aşamada, GRP'ler yapışmış ve uzantılar çıkarmaya başlamıştır; bunlar immuno panning kullanılarak optimize edilebilir. Hücreler %85 ila %90 konfluans düzeyine ulaşana veya bir hafta geçene kadar büyütmeye devam edin.Ardından, kauçuk bir hücre kazıyıcı (rubber policeman) veya tripsin kullanarak hücreleri hasat edin. Hücreleri taze besiyerinde yeniden süspanse edin ve besiyerini en az her 48 saatte bir değiştirerek üç adet T 25 flaskında çoğaltın. Flasklar konfluense ulaştığında, hücreleri daha önce yaptığınız gibi beş mililitre GRP besiyerine hasat edin. Hücre kümelerini parçalamak için hücre süspansiyonunu trite edin ve bunları kaplamalı bir 2B5 bakteriyolojik kaba aktarın.Hücreler, A iki B plaklarında, oda sıcaklığında, çalkalamadan bir saat boyunca inkübe edilir. Ardından, hücrelerin plağa spesifik olmayan bağlanması için yüksek stringens sağlamak amacıyla ortam aspire edilir ve plaklar PBS ile dört ila sekiz kez yıkanır. Bir kauçuk polisman kullanılır.Yıkanmış hücreleri iki mililitre GRP medyumunda toplayın ve ardından süspansiyonu PLL lamina kaplı plakalara veya GRP medyumlu flasklara aktarın. Hücreler %85 ila %90 konfluense ulaştığında, tripsin kullanarak hasatlayın, ardından tripsini sekiz mililitre GRP stok medyumu ile seyrelterek inaktive edin ve hücreleri pelet olarak toplayın. T 25 flasktan elde edilen hücre hacmini bir mililitre GRP dondurma medyumunda veya T 75 flasktan elde edilen hücreleri iki mililitre GRP dondurma medyumunda yeniden süspande edin.Gerekirse hücre süspansiyon konsantrasyonunu ayarlayın ve hücreleri kriyojenik tüplere aktarın; hücreleri, -80 °C'de izopropanol içeren bir kriyojenik kap içerisinde gece boyunca yavaşça dondurun. Ertesi gün hücreleri uzun süreli saklama alanına aktarın. Hücreler, altı ay ila bir yıl sonra çözüldüğünde %60 ila %80 oranında canlı kalacaktır.Canlılık, büyük ölçüde PLL laminin kaplamasının kalitesine bağlıdır. Kültürde iki gün geçtikten sonra, ekilen farklı morfolojilerdeki spinal kord hücrelerinin maksimum düzeyde zenginleştiği gözlemlenmiştir. GRP popülasyonu hücreleri, A iki B beş popülasyonunu seçmek için immüno pan işlemine tabi tutulur.Nöroepitelyal hücre kontaminasyonu ile ilgili bir sorun varsa, önce NCA pozitif popülasyonu elemek için çift immünopanning, ardından A two B five seçimi uygulanabilir. Olgun oligodendrosit kontaminasyonunu azaltmak için A T three free B 27 supplementi eklenmiştir. Saflaştırılmış GRP hücreleri, küçük somaları ve iki veya üç kısa uzantıları ile tanımlanabilmiştir.Sıklıkla, nöroepitelyal olan ve hem GRP hem de N rp hücrelerine dönüşebilen, A iki B beş negatif hücrelerden oluşan küçük ve kalıcı bir popülasyon da mevcuttu. Neyse ki, hücreler GRP ortamında ne kadar uzun süre tutulursa, GRP fenotipini benimseme olasılıkları o kadar arttı. Bu prosedürün temel teknikleri, hangi hücrenin hücre replasman tedavisi için daha uygun olduğu veya korteksten türetilen nöronların in vitro miyelinizasyon için iyi modeller olup olamayacağı gibi ek soruları yanıtlayabilecek diğer hücre tiplerini türetmek için kullanılabilir.

derivation-of-glial-restricted-precursors-from-e13-mice

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Bu video embriyonik farelerin gelişmekte olan korteks neuroprecursors izolasyonu için kullanılan yöntem açıklanır. , Embriyoların rahim kaldırarak, kortikal doku diseksiyon, ve sindirerek izole serebral korteks prosedür gösterilmiştir.

Fare Nöral Kök Hücre Öncüleri Kültür

Video, yenidoğan bir fare beyninden hücreleri izole etme ve kültürleme yöntemini gösterdi. Beynin enzimatik ve mekanik ayrışmasını ve ardından karışık bir glial popülasyon elde etmek için nöronal büyüme faktörü olmayan büyüme ortamında kültürlemeyi içeriyordu.

Yenidoğan Fare Beyninden Karışık Glial Hücre Kültürü Elde Edilmesi

Nöral kök / progenitör hücreler (NPC) nakli rejeneratif nöroloji büyük vaatlerde tutar. NPC sistemik teslimi, beyin ve merkezi sinir sistemi hasarı deney kronik enflamatuar etkilenen kemirgen ve insan olmayan primatların omurilikteki kök hücrelerini sunmak için etkili invazif düşük, ve terapötik açıdan etkili, çok protokol dönüşmüştür.

Kronik EAE ile Fare nöral kök / progenitör hücrelerinin sistemik enjeksiyonundan

Bu prosedür, in utero elektroporasyon yoluyla gelişmekte olan fare ön beynindeki internöronların nasıl hedefleneceğini gösterir. Bu teknik, korteksin yüzeysel katmanlarına yönelik internöron alt tiplerinde seçici gen ekspresyonu elde etmek için özellikle etkiliydi.

Kortikal internöronlar alt tip-selektif Elektroporasyon

Uyarılmış pluripotent kök hücrelerin üretilmesi otolog nakli türetilmesi için ilginç umutları sağlar. Ancak, pluripotent devlet ve zahmetli yeniden farklılaşma yoluyla ilerleme hala klinik çeviri engellemektedir. Burada erişkin insan fibroblast türetme ve uyarılmış nöral progenitör hücrelerin içine doğrudan dönüşüm ve nöral soy içine sonradan farklılaşmayı açıklar.

Yetişkin İnsan Fibroblastları türetilmesi ve Genişletilebilir Sinir Progenitör Hücreler içine Doğrudan Dönüşüm

Bu iletişim kuralı kortikal interneuron ataları ve sonrası Mitotik interneuron öncüleri fare embriyonik kök değiştirilmiş bir embryoid vücut monolayer yöntemi kullanarak hücre oluşturmak için bir yöntem açıklanır. Bu ataları/hareketlenme öncesi ilk belirtiler kullanılan vitro olabilir fluorescently sıralanmış ve kader tayini çalışmak için yenidoğan yeni korteksimiz içine nakledilen veya tedavi uygulamalarında kullanılan.

Fare embriyonik kök hücre farklılaşma içine kortikal Interneuron Kara filmin tarih öncesi

Burada, bağırsak submukoza divalent katyonlar ve enzimatik olmayan hücre kurtarma çözümü kuluçka şelasyon yapın için sıralı EDTA incubations kullanarak gliyal enterik hücre izolasyon açıklayın. Sonuç hücre süspansiyon poli-D-lizin ve laminin kaplama submucosal Gliyal hücreler fonksiyonel analiz için zenginleştirilmiş bir kültür sonuçlanır.

Submukoza ve Lamina Propria yetişkin fare enterik gliyal hücrelerini izolasyon

Burada, E13 fare embriyo ganglionic itibar bir roman mikrocerrahi teknik nöral kök hücrelerin izolasyonu için tanıtmak.

Yalıtım ve kültür embriyonik fare nöral kök hücrelerin

Burada, bir fare CNS'sinden çoklu glial hücre popülasyonlarının in vitro izolasyonu için bir protokol sunuyoruz. Bu yöntem, bölgesel mikroglia, oligodendrosit öncü hücreleri ve astrositlerin çeşitli kültür sistemlerinde her birinin fenotiplerini incelemek için ayrılmasına izin verir.

Murine glia'nın Multipl Merkezi Sinir Sistemi Bölgelerinden Diseksiyonu ve İzolasyonu

Fare embriyonik kök hücrelerinin asma damlası yöntemini kullanarak nöronal hücrelere in vitro farklılaşması prosedürünü açıklıyoruz. Ayrıca RT-qPCR, immünofluoresans, RNA-seq ve akış sitometrisi ile kapsamlı bir fenotipik analiz gerçekleştiriyoruz.

Nöral Progenitörlerin ve Nöronların Fare Embriyonik Kök Hücrelerinden Farklılaşması ve Karakterizasyonu

Serebral korteksin gelişimi sırasında, nöronlar ve glial hücreler ventrikülü kaplayan ventriküler bölgeden kaynaklanır ve beyin yüzeyine doğru göç eder. Bu süreçte birçok gen yer alır. Bu protokol, göç eden nöronların ve glial progenitörlerin hızlandırılmış görüntüleme tekniğini tanıtır.

Embriyonik Fare Beyin Dilimlerinde Göç Eden Nöronların ve Glial Progenitörlerin Hızlandırılmış Görüntülenmesi

Öğrenin, E13 fetüslerinden glial yasak öncüleri (GRP) türetme ve immuno panning ile zenginleştirme yöntemini. Bu protokol, oligodendrosit gelişimi ve demiyelinizan hastalıklar için hücre nakli araştırmalarında kullanılabilir.

E13 farelerin Glial Yasak Öncüleri türetilmesi

Daha fazla video keşfet