脂質ラフトの決定は、蛍光相関分光法（FCS）による生細胞の蛍光タグ付きプローブの分割

脂質ラフトは、細胞膜内のマイクロドメインであり、シグナル伝達や輸送などの細胞プロセスの組織化センターとして機能します。ここでは、生細胞の原形質膜における脂質ラフト分配を蛍光相関分光法を用いて定量化し、ガングリオシドGMの脂質ラフト分配について検討します。哺乳類細胞は、Alexa 4 88で標識された胆汁毒素のBサブユニットでプローブされます。

蛍光タンパク質はガングリオシドGMに結合し、ガングリオシドGMは共焦点顕微鏡を用いて脂質ラフトに優先的に分配されます。原形質膜での微小な蛍光変動を測定します。自己相関曲線が生成され、適切な数学的拡散モデルが適合して、Fluorの拡散時間を決定します。

プローブは高密度脂質ラフトの内側よりもはるかに速く外側に拡散するため、得られた結果は分配のレベルを示しています。この手法の主な利点は、界面活性剤耐性膜の単離や抗体との共パッチなど、既存の方法のこの手法の主な利点は、FCSにより、ターゲットの関連する脂質グラフトパターンではなく絶対パターンを決定できることです。さらに、脂質とタンパク質の両方に蛍光タグが付けられている限り、それらに使用できます。

この方法は、アミロイドベータ産生における脂質の重要性など、アルツハイマー病分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。これは、脂質グラフト成分に特異的に結合する新しい阻害剤などの重要な発見につながるでしょう。この手順は、蛍光相関分光法またはFCSシステムのキャリブレーションから開始します。

このFCSセットアップは、検出フィルターとアバランシェフォトダイオードを備えた外部検出ユニットに接続された共焦点顕微鏡と、時間相関のある単一光子計数システムで構成されています。共焦点顕微鏡レーザー、共焦点イメージングコンピュータ、FCS取得コンピュータを起動します。次に、インキュベーターの電源を入れ、摂氏37度と二酸化炭素5%に設定します。

単一光子アバランシェダイオードまたはスパッドのスイッチがオンになっており、スパッド内の蛍光フィルターがサンプルに適していることを確認してください。スパッドが時間的に同期していることを確認します。スパッド設定を取得する準備ができたら、FCS PICOクオンツソフトウェアを起動します。

コレラ毒素Alexa 4 88をPBSで希釈し、最終濃度1ミリリットルあたり1マイクログラムの新鮮な溶液を調製します。溶液をカバースリップにピペットで移します。次に、顕微鏡のZ設定を調整して、蛍光が最も強い平面を見つけます。

ポイントスキャンモードに切り替えるには、漂白ポイントボタンをクリックし、画像画面をクリックして、溶液サンプルのポイント関心領域を選択します。ソフトウェアを使用して、露光時間を5分以上に設定します。これにより、レーザー照明がFCS取得を実行するのに十分な長さになります。

次に、FCSソフトウェアを使用して、スパッドによる外部検出に切り替えます。蛍光信号が毎秒10、000〜50、000カウントの範囲にあることを確認します。目標は、良好なシグナルを取得することですが、飽和状態は発生しません。

同じフィールドで 32 番目の測定値を 10 セット取得します。取得時間は、光退色なしで高品質のサンプリングが達成されるように、サンプルに対して最適化する必要があります。最適化サンプルデータを取得したら、それを使用して自己相関曲線を生成し、蛍光種の拡散時間を決定します。まずは。

FCSソフトウェアを使用して、相関間隔を設定し、溶液中に拡散する蛍光種に対応する自己相関曲線を生成します。32回目の測定ごとに、ソフトウェアは各32回目のサンプルを個別に分析し、観測間の時間間隔の関数として観測間の類似性を報告する古典的な数学関数を使用して、蛍光強度から自己相関曲線を生成します。相関間隔は、通常、解決可能な最短の LAC 時間から可能な限り長い時間までの範囲です。

ここでわかるように、最大相関時間が近づくにつれて測定の精度が低下します ここでは、最大遅延時間は取得時間の80%に制限されています。次に、各サンプルについて、蛍光変動と自己相関を時間の関数として対応するファイルをエクスポートします。次に、ファイルをOrigin Proなどのデータ分析およびフィッティングソフトウェアにインポートして、取得中に写真の漂白が発生しなかったことを確認します。

蛍光揺らぎファイルを調べます。蛍光は30秒間安定している必要があり、平らな線で表する必要があります。蛍光測定を行うと、光の退色が見られます。

対応するFCS曲線をさらなる分析に使用しないでください。これにより、残りのFCS曲線との拡散時間が人為的に長くなる可能性があります。各時点の自己相関値を平均化して、平均 FCS 曲線を決定します。最後に、適切な数学モデルで曲線をフィットするには、Origin Proのフィッティングモジュールを適切な方程式とともに使用します。

この適合により、分子と溶液の拡散時間が得られます。この場合、拡散して自由に拡散する集団は1つだけです。得られた拡散時間が正しければ、約0.2ミリ秒です。

セットアップは十分に校正されており、さらなる実験に使用できます。セットアップのキャリブレーションがチェックされたので、このシステムを使用して、フローラの脂質RAFの分配を測定できます。関心のある4つの生細胞は、インキュベーターからHEC 2 93細胞を除去します。

細胞は、フェノールを含まない培地を接着する時間を確保するために、前日にポリLリジンでコーティングされた8輪のラボテックコーティングスライドに播種されているはずです。蛍光シグナルの摂動がないように、赤を使用する必要があります。ピペットを使用して、ウェルからほとんどの培地を静かに取り出し、細胞が乾燥しないようにします。

次に、HBSSをそっと加えます。この洗浄をそれぞれ1回ずつ繰り返します。500マイクロリットルの希釈したコレラ毒素、Alexa 4 88を細胞に30分間よく加えます。

摂氏37度では、コレラ毒素は、インキュベーション後に脂質ラフトに優先的に分配されることが知られているガングリオシドGMに結合します。細胞がFCSデータ取得の準備ができる前と同様に、HBSSで細胞を2回洗浄します。染色した細胞を顕微鏡ステージに置き、温度と二酸化炭素の設定を確認します。

顕微鏡の内部検出を使用して、目的の細胞の共焦点イメージングを最適化します。よく染色された膜を持つ細胞を見つけます。以前と同様にポイントスキャンモードに切り替えて、目的の細胞の原形質膜内のポイントを選択します。

セルのスナップショットを 1 つから 2 つ取得して、取得中にセルが動いていないことを確認します。スパッドによる外部検出とFCSソフトウェアへの切り替えを以前と同様に行い、適切な信号10、000〜50、000を確保します。Z 位置ゲインやレーザー出力を変更します。

ほとんどの細胞が自家蛍光性であるため、32回目の測定値の10サンプルを取得します。自家蛍光の退色により、最初の取得中に蛍光が減少する可能性があります。前回と同様に蛍光変動を解析し、平均FCS曲線を決定します。

次に、多相平均FCS曲線を適切な数学的モデルに適合させます。Origin Proのフィッティングモジュールを適切な式で使用します。この適合により、拡散時間と、これらの拡散時間で拡散する分子の割合が得られます。

この図は、Alexa 4 88 のコレラ溶液を使用した FCS キャリブレーションの例を示しています。時間の関数としての蛍光の個々の測定値を確認した後、個々の光漂白は示されず、平均FCS曲線が計算されました。平均FCS曲線には、さまざまな拡散モデルに対応する方程式が適合されました。

近似の品質を決定するために古典的に考えられているパラメータは、決定係数 R の 2 乗です。Rの2乗が1に近いほど、この場合の適合度が高くなり、最も正確なモデルが適合します。平均FCS曲線は、3次元で自由に拡散する蛍光分子の集団を表す曲線です。

近似から導出される拡散時間は 0.32 ミリ秒です。曲線近似とR二乗因子からの残差は、ここでの近似の品質の推定値を示します。r の 2 乗値は 0.99906 で、適合度が高いことを示しています。

ここには、コレラ毒素Alexa 4 88で染色されたHC2 93細胞のFCS分析の例が示されています。この例では、拡散を評価するための小さな細胞内蛍光ドットの存在によって示されるように、毒素はエンドサイトースになり始めています。原形質膜でのコレラtoinアレクサ4 88の時間。

データは、このビデオで説明されているように収集および分析されました。多相平均FCS曲線の形状は、拡散時間が異なる蛍光分子の集団の存在を明らかにしています。この曲線に最も適合するのは、蛍光プローブの3つの集団(2つは拡散が阻害されている)を持つモデルに対応します。

膜面と同様に2次元での拡散、および3次元で自由に拡散する1次元の拡散。この後者の集団は、膜面の外側に移動する蛍光分子に対応します。言い換えれば、蛍光分子は、分泌経路またはリサイクル経路を通じて膜に到達する膜標的に結合するか、または結合解除するか、またはエンドサイトーシスによって膜を離れます。

膜では2回の拡散時間が見られ、25%の分子が脂質ラフトの外部拡散に対応する2ミリ秒の拡散速度を示し、50%の分子が脂質ラフトの拡散に対応する75ミリ秒の拡散時間を示しました。

この手順に続いて、代替光学配置を結合し、次いで、単一分子検出を屈折限界以下で行うことができ、これにより、その開発後、より広い範囲の拡散時間にアクセスすることができる。この技術は、脂質ドラフトの分野の研究者が、細胞株および初代培養における薬物版膜脂質組成変化後の脂質ドラフト分配の疾患関連ダイナミクスを研究する道を開きました。