臨床抗体サンプルの貪食活性を決定する

次の実験の目的は、臨床サンプル中の抗原特異的抗体の食作用活性をハイスループットで決定することです。これは、まず蛍光ビーズに任意の抗原をコーティングすることで達成され、複雑な臨床抗体サンプル中に存在する抗体の抗原特異的画分を捕捉することができます。第2段階の食作用として、TP 1細胞をイオン化蛍光ビーズとインキュベートし、結合した抗体の数とFCドメイン特性によってビーズを貪食します。

次に、サンプル中に存在する抗体の食作用活性を定量するために、THP one細胞の蛍光強度をハイスループットプレートベースのフローサイトメトリーによって決定します。最終的には、抗体価の変動または食細胞に発現する抗体受容体による認識の変動によるオプソナイズ蛍光ビーズの取り込みの違いに基づいて、サンプル中の抗原特異的抗体が食作用を誘導する能力を評価することができます。この手法は、初代食細胞を使用する方法などの既存の方法と比較した場合の主な利点として、スループットが向上し、標準化が向上することです。

この方法は、適応免疫応答の基本的な免疫学に関する重要な疑問、例えば、異なるワクチン接種レジメン、異なる活性を持つ抗体を誘導したかどうかなど、答えるのに役立ちます。この技術の意味は、抗体が効果的な防御免疫応答の増強に大きく貢献するため、感染症の治療にまで及びます。この手法は、進行性のHIV感染やワクチン接種における抗体の活性に関する知見を得るために使用されてきましたが、インフルエンザ、自己免疫、デング熱など、フラゴ抗体が防御を提供するのではなく、D疾患を悪化させる可能性のある他の疾患状態にも適用できます。

まず、第一級アミンを含まないバッファーで抗原を希釈します。次に、スルファNHS lc、ビオチン試薬を水に溶解します。次に、すぐに水和試薬を抗原に加え、室温で1時間混合しながら反応を進めます。

反応が完了したら、遠心濃縮ユニットの上部チャンバーにサンプルを添加して、バッファー交換によって余分な未結合ビオチンを除去することがあります。次に、PBSを追加して、総容量を15ミリリットルの充填ラインまで上げます。最後に、サンプルをGの4,000倍で摂氏4度で5分間遠心分離し、体積が約1.5ミリリットルに下がるまで遠心分離します。

このステップを3回繰り返して、遊離ビオチンをほぼ定量的に除去します。1ミクロンの蛍光ユートトラジンビーズの100マイクロリットルをマイクロ遠心分離機で13,000回Gで5分間スピンダウンした後、同じ遠心分離手順に従って、0.1%P-B-S-B-S-Aの1ミリリットルでビーズを再懸濁して洗浄します。次に、Resusが洗浄したビーズを100マイクロリットルのP-B-S-B-S-Aに懸濁した後、再びビーズを10マイクロフュードチューブに雄弁

次に、洗浄したビーズ懸濁液10マイクロリットルを、さまざまな濃度のビオチン化抗原と組み合わせ、フォールドステップにします。次に、ビーズと抗原懸濁液をローテーター上のマイクロ遠心チューブで摂氏4度で一晩インキュベートします。翌日。

懸濁液を1ミリリットルのP-B-S-B-S-Aで2回洗浄して未結合の抗原を除去し、ビーズがペレット化されるまでサンプルを前と同じように高速で遠心分離します。最後に、リースは、メロンゲルIgG精製キットを使用して血漿から臨床抗体サンプルを精製した後、抗原被覆ビーズを最終容量のP-B-S-B-S-Aの最終容量1ミリリットルに懸濁します。製造元の指示に従って、精製された抗体の濃度を2 80の吸光度で測定します。

次に、抗体をPBSで1ミリグラム/ミリグラムに希釈し、陽性および陰性のモノクローナルコントロール抗体のサンプルも確保します。次に、斬合して抗原飽和ビーズ溶液をボルテックスして懸濁し、次いで溶液の10マイクロリットルを丸底96ウェルプレートの各ウェルに移し、ビーズ懸濁液を連続的に攪拌して、蛍光ビーズが各ウェルに同数添加されることを確保するように注意する。各コントロール抗体に20マイクロリットル以下の容量でさまざまな濃度の目的の抗体を添加することにより、各コントロール抗体の用量反応曲線を作成します。

次に、ビーズと抗体サンプルを摂氏37度で2時間インキュベートし、ビーズが完成する直前に抗体がビーズに結合できるようにします。インキュベートしながら、THP 1細胞のサンプルを培地中の1ミリリットルあたり5細胞に10の2.5倍で希釈します。次に、それぞれに200マイクロリットルの細胞を追加します。

最後に、抗体でコーティングされたビーズを使用して、定置型インキュベーター内で摂氏37度、二酸化炭素5%で細胞を一晩インキュベートし、細胞とビーズが重力によって沈殿するのを待ちます。翌日、細胞ペレットを乱さないように注意しながら、各ウェルから100マイクロリットルのスピネートを取り出します。細胞を4%パラホルムアルデヒドの100個に固定し、ピペットで再懸濁して細胞を混合します。

次に、プレートをハイスループットフローサイトメーターのHTSプレートリーダーにロードし、自動データ収集を可能にします。HTHP1細胞の蛍光強度を捕捉し、記録します。次に、この蛍光強度を使用して、各細胞によるビーズ食作用の数を決定し、試験対象の抗体サンプルの食作用活性を定義します。

抗体サンプルは、罹患した被験者と罹患していない被験者と明確に区別する必要があります。この図では。Black Traceで表されるHIV陰性被験者と灰色のTraceで表されるHIV陽性被験者の抗体サンプルのファクトヒストグラムは、抗原特異的抗体の存在によって引き起こされる食作用の増加を示しています。

このアッセイの最適な感度は、ここに見られるように、ビオチン化抗原によるビーズの飽和に依存します。ビーズ1マイクロリットルあたり2マイクログラムの抗原が、この抗原の飽和濃度であると決定されました。この用量反応曲線は、0.05〜5マイクログラム/ミリリットルの抗体濃度範囲で食作用を誘発する被験者の抗体サンプルの異なる能力を示しています。

この分別的な食作用は、力価の違い、またはIgGサブクラスやグリコシル化状態などのFCドメイン特性の違いによって引き起こされる可能性があります。TP one細胞を蛍光顕微鏡で画像化すると、ビーズ食作用の明確な証拠があります。この静止画は、抗体オプソナイズビーズを緑色で、非opイン化ビーズを赤色でインキュベートした後のTP One細胞の静止画は、緑色のビーズのみがTP One細胞によって細胞化されたため、抗体がない場合の食作用の取り込みの欠如を示しています。

タイムラプス顕微鏡検査を行うと、蛍光ビーズの抗体特異的な食作用の取り込みがさらに顕著になります。ここに見られる緑色の蛍光ビーズは抗体がイオン化されています。赤色蛍光ビーズはネガティブコントロールを提供します この手順に続いて、感染またはワクチン接種に対する抗体応答の特性に関する追加の質問に答えるために、抗体機能の他のテストを行うことができます。

このビデオを見れば、アイスループットフローサイトメトリーを使用して抗体サンプルの食作用活性を測定する方法について十分に理解できるはずです。臨床血液および血漿サンプルの取り扱いは非常に危険である可能性があり、この手順を実行する際には、適切な個人用保護具の着用や安全な取り扱い手順に従うなどの予防措置を常に講じる必要があることを忘れないでください。