التصوير من HIV-1 مغلف من صنع المشبك الفيروسية، واشارة على طبقات ثنائية الدهون الاصطناعية

تخلق هذه الطريقة طبقات ثنائية الدهون تحاكي سطح الخلية المصابة. من أجل دراسة المشبك الفيروسي لفيروس نقص المناعة البشرية المكونة من أربع خلايا تائية بشرية أولية لبروتينات التسمية الأولى ذات الأهمية مع الأصباغ الفلورية ، ثم إنشاء طبقات ثنائية الدهون والسماح للخلايا بتكوين نقاط الاشتباك العصبي ، وإصلاح الخلايا وتلطيخها بالأجسام المضادة الفلورية لتصور جزيئات الإشارات. ثم باستخدام الانعكاس الداخلي الكلي ، يكتسب المجهر الفلوري أو العشب صورا لجزيئات الإشارات داخل الخلايا المكونة للمشبك العصبي.

قم بتحليل صور العشب لتحديد توطين جزيئات الإشارات النشطة فيما يتعلق ببنية المشبك الفيروسي. يمكن أن يشير هذا النهج التجريبي إلى ما إذا كانت البروتينات الخلوية مثل بروتين كيناز LCK الخاص بالخلايا الليمفاوية ، يتم تجنيدها في المشبك الفيروسي لفيروس نقص المناعة البشرية. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في معالجة السؤال الرئيسي في علم الفيروسات والمناعة لفيروس نقص المناعة البشرية ، مثل مكونات الخلية المشاركة في المشبك الفيروسي.

ما هو الدور في تكوين المشبك وكيف يمكن أن يؤثر على انتقال فيروس نقص المناعة البشرية من خلية إلى أخرى. يوفر نظام البيير هذا عرضا نهائيا للمشبك مع ميزة تصور المشبك بدقة خاصة عالية في مستوى واحد. النتائج تصور بوضوح الهيكل المشبكي ، وتشكيل النعش وتجميع خلية التدفق هو شكل من أشكال الفن.

نوضح هنا التحضير الصفراوي على خلية التدفق البصري الحيوي للدراسات التي تستخدم الفيروسات المعدية أو الخلايا المصابة أو عندما يكون من الضروري استخدام كميات صغيرة بسبب الكواشف المحدودة. يمكن استخدام خلايا تدفق OB التي يمكن التخلص منها مع نفس إجراء التحضير الصفراوي. سأعرض أنا ومايكل كرامر إجراء لوضع علامات على البروتينات.

اختيار: الأصباغ الفلورية مثل LOR 4 88 الفعالة في الارتباط بالبروتينات تكون مستقرة بدرجة كافية للصور للتصوير المجهري وتتطابق مع الأطوال الموجية للإثارة لليزر المتاح على معدات المجهر. ابدأ بتنقية له الموسومة GP واحد 20 درهم 12 بروتين. استبدل المخزن المؤقت للبروتين ب PBS المعقم باستخدام وحدة مرشح الطرد المركزي مع قطع الوزن الجزيئي يبلغ 50 كيلودالتون.

بعد ذلك ، تحقق من الرقم الهيدروجيني وأضف درجة حموضة بيكربونات الصوديوم 9.0 للحصول على تركيز نهائي 50 مليمولار من بيكربونات الصوديوم مع درجة حموضة تبلغ حوالي 8.5. ثم أضف صبغة فلورية متوسطة تفاعلية LOR 4 88 بزيادة عشرة أضعاف. احتضن هذا الخليط في الظلام لمدة 45 دقيقة إلى ساعة واحدة.

تابع إزالة الصبغة الزائدة باستخدام وحدة مرشح الطرد المركزي. أضف PBS معقما جديدا إلى العمود واستمر في غسل البروتين من الصبغة الحرة. ثم ركز GP واحد 20 بروتين إلى حوالي ملليغرام واحد لكل مليلتر.

قياس تركيز صبغة الفلورسنت عند 488 نانومتر. حدد أيضا تركيز البروتين باستخدام مقياس الطيف الضوئي NanoDrop. باستخدام إعداد البروتينات والملصقات.

اقسم الرقمين لتحديد شدة التألق لكل جزيء من البروتين. تحضير محلول سمكة المفترسة من 45 مل ، حمض الكبريتيك ، و 15 مليلتر ، 30٪ بيروكسيد الهيدروجين مع المشابك البلاستيكية. انزلاق الغطاء لمدة 15 دقيقة.

انقل زلات الغطاء إلى دورق مملوء بالماء النقي PIKA اغسل كل زلة غطاء تحت الماء الجاري لمدة دقيقتين في الدقيقة على كل جانب وضعها على رف حتى يجف. تابع تجميع غرفتين بواسطة البصريات F CS كما هو موضح سابقا بواسطة varona etal 2008. بجانب التقاط وتقديم همسة GP one 20 على سطح الطبقة الثنائية دون لمس طرف الزجاج.

ماصة خمس قطرات ميكرولتر واحد من خليط الجسيمات الشحمية على شريحة قناة صغيرة لتحضير خمس طبقات ثنائية لكل خلية تدفق. الآن ضع زلة غطاء فوق الدهون. بعد ذلك ، قم بتغطية حلقة التثبيت البيضاء بوحدة قاعدة مشبك من الفولاذ المقاوم للصدأ.

اقلب الجهاز بالكامل وختم. ثم حدد موقع الطبقات الثنائية واحتضن لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك ، قم بإرفاق الأنابيب مع قضيب إيقاف ثنائي الاتجاه بأنبوب التروية الأيسر.

املأ الأنبوب المرفق بقضيب توقف ثلاثي الاتجاهات مع 1٪ من ألبومين المصل البشري في محلول ملحي مخزن وتحقق من أن الإعداد خال من الفقاعات. الآن قم بتوصيل هذا الأنبوب بأنبوب التروية الأيمن وقم بتوليد الغضروف المفصلي الإيجابي. ادفع المخزن المؤقت برفق عبر خلية التدفق لمنع الطبقة الثنائية.

قم بإرفاق حقنة ملليلتر واحدة تحتوي على 300 ميكرولتر من 100 ميكرومولار من كلوريد النيكل ENC إلى قضيب التوقف ثلاثي الاتجاهات ، وادفع العازلة برفق من خلال الإغلاق. كلاهما يوقف الديوك قبل فك الارتباط. تحتضن المحقنة لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.

الآن قم بتحميل 250 جزيئا من الهسهسة الموسومة LOR 4 88 المسمى GP واحد 20 لكل ميكرون لتقليد الكثافة المحلية للعناقيد الطرفية الموجودة على سطح واحد لفيروس نقص المناعة البشرية V. احتضن لمدة 30 دقيقة في الظلام في درجة حرارة الغرفة ، واغسلها بطبقات بخمسة ملليلتر من المخزن المؤقت H-B-S-H-S-A. موازنة خلية التدفق إلى 37 درجة مئوية.

باستخدام حقنة ملليلتر واحد ، أضف القرص المضغوط البشري المنشط أربع خلايا تائية موجبة في 400 ميكرولتر من محلول ألبومين مصل 1٪ يحتضن لمدة 45 دقيقة في حاضنة 37 درجة مئوية للسماح للخلايا بالارتباط بالدهون بطبقة. بعد ذلك لإصلاح الخلايا حقن 2٪ بارالديهايد ، ثم احتضانها لمدة 10 دقائق عند 37 درجة مئوية. يغسل ثلاث مرات بملليلتر واحد.

ثم يقوم PBS بإجراء الخلايا عن طريق حقن 0.1٪ Triton X 100 لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة بعد ثلاث غسلات ملليلتر واحد بكتلة PBS مع الكازين الذي يحتوي على 5٪ مصل الماعز لمدة 25 دقيقة. في درجة حرارة الغرفة يغسل ثلاث مرات باستخدام PBS. ثم أضف الجسم المضاد الأساسي و 300 ميكرولتر مخزن مؤقت لكل خلية تدفق لمدة 20 دقيقة إلى ساعة واحدة.

في درجة حرارة الغرفة بعد ثلاث غسلات PBS ، أضف الجسم المضاد الثانوي المناسب المسمى بالفلورسنت في المخزن المؤقت. في التجربة ، يتم التعامل مع عينة التحكم حسب الطبقة بجسم مضاد ثانوي فقط لتحديد مستوى الإشارة غير المحددة من هذا الكاشف. احتضن لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة ، ثم اغسلها ثلاث مرات بمليلتر واحد.

تحصل PBS على صور لجميع العينات من خلال الانعكاس الداخلي الكلي. الفحص المجهري الفلوري. قم بإجراء تحليل كمي للصور باستخدام حزمة تطبيق تحليل الصور، مثل الصورة J في علامة تبويب تحليل مجموعة القياسات.

حدد المربعات للمساحة ومتوسط القيمة الرمادية. حدد منطقة اهتمام على الصورة التي تكون عبارة عن مضلع أو شكل مغلق يتم تتبعه يدويا. ثم حدد علامة التبويب تحليل القياس للبرنامج لتسجيل البيانات من هذا القياس.

في جدول النتائج ، قم بتعيين القياسات على المتوسط والمساحة ثم افتح الصور لحالة تجريبية واحدة لكل تتبع خلية وقم بقياس منطقة الاهتمام والتتبع وكذلك قياس منطقة الخلفية لكل حالة تجريبية. انسخ القياسات والصقه في Excel. عند جمع جميع البيانات ، احسب متوسط الكثافة بالوحدات التعسفية.

اطرح شدة الخلفية من المتوسط ، ثم اضرب في المساحة للحصول على الكثافة المتكاملة للبروتين في وحدات تعسفية لقياس تنشيط وتوظيف جزيئات الإشارات القريبة من الغشاء الأولي. نتيجة للتفاعل مع GP one 20 في المشبك الفيروسي ، تم إدخال أربع خلايا تائية موجبة على طبقات ثنائية تحمل G واحد 20 و ICAM واحدة ، تم إدخال الخلايا إلى الطبقات الثنائية مع ICAM واحد فقط ، حيث كان ICAM واحدا بمثابة عنصر تحكم لتحديد المستويات القاعدية للإشارات. بعد تفاعل الخلايا مع الطبقات الثنائية التي تحتوي على GP واحد 20 و ICAM ، تم تجنيد بروتين LCK واحد في واجهة المشبك الفيروسي وقم بتوطين كول مع GP واحد 20.

كان متوسط شدة LCK الكلي أعلى على الطبقة الثنائية التي تحتوي على كل من GP واحد 20 و ICAM واحد من ICAM واحد وحده. ومن المثير للاهتمام أن مستويات الشدة المتكاملة كانت متشابهة. مجتمعة.

تشير هذه البيانات إلى إعادة توزيع LCK في مجموعة مركزية. على القرص المضغوط أربعة إيجابية [ت-خل] يلتبط إلى GP واحد 20. هنا تم تصوير متوسط ومتكامل فوسفو LCK تيروزين 3 94 شدة تم اكتشافها بواسطة المجهر العشبي وتحديدها كميا.

تشير النتائج إلى أن ربط GP one 20 زاد من فسفرة بقايا التيروزين 3 94 في حلقة تنشيط LCK. في المقابل ، كان هناك المزيد من الزعنفة الموجودة في منطقة التلامس للخلايا الموجودة على طبقات ثنائية ICAM واحدة فقط من الطبقات الثنائية التي تحتوي على كل من GP واحد 20 و ICAM واحد. وبالتالي ، لم يتم تجنيد الفنلندي في المشبك الفيروسي.

وبالتالي ، نستنتج أن LCK وليس Finn هو الكيناز النشط في HIV واحد GP واحد 20 المشبك الفيروسي المستحث. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تفضيل البيئر المحملة ببروتينات معينة ، وإجراء تلطيخ الفلورسنت المناعي على التفاعلات الصفراوية لخلية صورة خلية التدفق باستخدام الفحص المجهري للانعكاس الداخلي الكلي ، وإجراء التحليل الأساسي. هذا النظام الصفراوي مفيد أيضا لتصوير الخلايا الحية حيث يمكنك مراقبة ديناميكيات تكوين الاشتراكات الفيروسية.

علاوة على ذلك ، يمكن نقل الخلايا ببروتينات ذات علامات فلورية مثل GFPs Z 70. يتيح ذلك تتبع التغييرات في توزيع وتوظيف جزيئات الإشارات إلى المشبك في الوقت الفعلي.