Cella di misura Kinetics progressione del ciclo con la marcatura metabolica e citometria a flusso

L'obiettivo generale della seguente procedura è misurare la cinetica e la progressione del ciclo cellulare. Le prime cellule sono pulse chase marcate con romo, deossi, uridina o BRDU, che viene incorporato nel DNA della cellula al posto della timidina. Le cellule vengono quindi immunocolorate con anticorpi contro BRDU e analizzate mediante citometria a flusso immediatamente dopo la colorazione.

Solo le cellule in fase S vengono marcate man mano che le cellule marcate progrediscono attraverso il ciclo cellulare fino a G due. Vengono rilevati come aventi quattro contenuti di NDNA dopo la mitosi. Il contenuto di DNA è ridotto a due N. Pertanto, l'analisi dei profili di fluorescenza generati dalla citometria a flusso può essere utilizzata per determinare la cinetica della progressione del ciclo cellulare.

Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ad altri protocolli che utilizzano sostanze chimiche per la sincronizzazione cellulare è che non ci sono perturbazioni fisiologiche che potrebbero influenzare inavvertitamente il meccanismo di divisione cellulare. Abbiamo usato questo metodo per la prima volta quando i nostri tentativi di studiare il tasso di progressione del ciclo cellulare utilizzando la sincronizzazione chimica ci hanno dato risultati inaspettati che hanno interferito con la nostra analisi. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della biologia cellulare.

Ad esempio, qual è la base per i tassi di crescita differenziali tra i diversi tipi di cellule? Inizia questo protocollo con l'impulso Chase etichettando le celle con BRDU per fare ciò. Inizia etichettando una targa di 10 centimetri per ogni punto temporale più una per ciascuno dei controlli successivi.

BRDU solo PI solo BRDU negativo PI negativo testa di serie ogni piatto con cinque volte 10 al quinto. MCF: sette cellule in DMEM integrato, incubano le piastre per 24-48 ore per consentire alle cellule di riprendersi e attaccarsi. Una volta che le cellule raggiungono il 60% di fluenza, sostituire il terreno con DMEM fresco contenente 10 micromolari.

BRDU incuba le cellule per un'ora a 37 gradi Celsius 5% CO2 per consentire l'incorporazione di BRDU nel DNA. Assicurati di lasciare una piastra non trattata per fungere da controllo negativo o punto di tempo zero dopo un'ora. Rimuovere il mezzo di marcatura a impulsi e sciacquare brevemente le celle con PBS fino ai punti temporali da due a otto ore.

Aggiungere il terreno di coltura fresco e rimetterli nell'incubatrice. Quindi raccogliere immediatamente le targhe dei punti temporali zero e un'ora come descritto nella sezione successiva. Per raccogliere le cellule, aspirare il terreno e sciacquare la piastra.

Una volta con PBS, quindi la tripsina guarda le cellule per staccarle dalla piastra e raccoglierle nella centrifuga DMEM a tre 90 volte G per cinque minuti. Scartare il surnatante. Quindi sciacquare le cellule in una centrifuga PBS ghiacciata da uno a cinque millilitri a tre 90 volte G per cinque minuti dopo la centrifuga, scartare il surnatante e risospendere le cellule in cento microlitri di ghiaccio.

PBS freddo contenente l'1% di FBS. L'FBS aiuta a prevenire l'aggregazione cellulare. Uno degli aspetti più importanti di questa procedura è assicurarsi di avere una sospensione di una singola cellula dalle cellule raccolte.

Per i fatti. Per raggiungere questo obiettivo, puoi aggiungere le tue cellule direttamente all'etanolo goccia a goccia. Questo è fondamentale Successivamente, per fissare le cellule, utilizzare la pipetta per aggiungere le cellule a cinque millilitri di codice ghiaccio.

70% di etanolo in un tubo conico da 15 millilitri. Incubare le cellule su ghiaccio per 30 minuti o conservarle a quattro gradi Celsius durante la notte. Questo è un passaggio ideale in cui interrompere la raccolta dei campioni dai vari punti temporali, i campioni possono essere lasciati in etanolo per diversi giorni, consentendo loro di essere elaborati contemporaneamente attraverso il resto del protocollo per eseguire la colorazione BRDU e ioduro di propidio.

Togliete le celle da quattro gradi Celsius e centrifugatele a tre 90 volte G per cinque minuti. Dopo la centrifuga aspirare la maggior parte del fissativo lasciando circa 50 microlitri. Poi vortice.

Allentare il pellet per denaturare il DNA durante il vortice. Aggiungere lentamente un millilitro di due HCL Triton X 100 normali goccia per goccia, quindi incubare i campioni a temperatura ambiente per 30 minuti. Le celle a pellet centrifugando i campioni per cinque minuti a tre 90 volte G aspirano e scartano il surnatante.

Quindi risospendere il pellet cellulare in un millilitro di tetraborato di sodio 0,1 molare. Dopo la centrifugazione, le cellule aspirano nuovamente e scartano il surnatante. Quindi risospendere il pellet cellulare in 75 microlitri di colorazione BRDU.

Mescolare incubare a temperatura ambiente per 45 minuti, al riparo dalla luce dopo l'incubazione. Pellettare le cellule per centrifugazione come prima e risospendere il pellet cellulare in un millilitro di PBS contenente cinque microgrammi per millilitro per ioduro di perdio. Quando si esegue il campione PI positivo attraverso il citometro a flusso, creare un grafico di dispersione diretta rispetto a quello laterale per garantire la corretta distribuzione dimensionale delle cellule.

Entrambi questi parametri devono essere tracciati su una scala lineare. Visualizzare contemporaneamente un grafico di FL tre H rispetto a FL due W per visualizzare la colorazione PI rispetto all'ampiezza dell'impulso di fluorescenza. Questo grafico viene utilizzato per creare un'andatura per isolare la frazione di cellule che si ritiene rientrino nel normale modello di distribuzione del ciclo cellulare.

In generale, questo modello di distribuzione è caratterizzato da due cluster di cellule del contenuto di due N e quattro NDNA della colorazione PI che rappresentano rispettivamente le due fasi G e G del ciclo cellulare. Una stringa di cellule situate tra questi due cluster è rappresentativa della replicazione del DNA in corso che si verifica nella fase S del ciclo cellulare. Crea un grafico che mostri le celle gate con FL uno, H o FITC su una scala logaritmica sull'asse Y e PI su una scala lineare sull'asse X.

Questo grafico verrà utilizzato per impostare i parametri rimanenti utilizzando i vari controlli e per raccogliere i dati. Per l'analisi, posizionare il campione di colorazione solo PI nella porta di carico del citometro a flusso, regolare il guadagno per posizionare G uno a circa 200 sull'asse x. Questo sarà più facile da visualizzare in un grafico a istogramma della colorazione PI.

Quindi, posizionare il campione solo BRDU nella porta di caricamento ed eseguirlo. Regolare il guadagno in modo che le due popolazioni di cellule, BRDU positivo e BRDU negativo, appaiano sul grafico. Idealmente, le celle negative BRDU sono posizionate appena a 10 o meno rispetto a uno.

Il controllo finale è il campione negativo di PI slash BDU. Esegui questo controllo negativo per assicurarti che le celle non appaiano in nessuno dei quadranti superiore o destro. Una volta impostati i parametri dei vari grafici, il citometro a flusso viene calibrato e pronto per l'elaborazione di BRDU e PI. Le cellule colorate raccolgono dati da un minimo di 10.000 cellule PI gate per ogni campione.

Quindi, utilizzando software come FlowJo o fax diva, crea un grafico di FITC rispetto a PI con celle controllate come PI positivo dal grafico PI rispetto a FL a due W. Per distinguere la popolazione ciclistica. Quindi, genera un secondo cancello per isolare la popolazione positiva al BRDU.

Quindi, per tracciare l'andamento temporale della progressione del ciclo cellulare, tracciare il numero di cellule BRDU positive con contenuto G uno o G due in funzione del tempo per confrontare il ciclo cellulare di progressione. Cinetica tra due linee cellulari colorettali HT 29 e LS 180. Le cellule sono state raccolte ogni ora per otto ore dopo la rimozione del polso A-B-R-D-U.

Confrontando la cinetica dei due profili, l'emergere di un picco G one è evidente a t uguale a quattro ore dopo BRDU nelle celle LS 180 rispetto al punto temporale corrispondente per la linea cellulare HT 29, che manca di questo picco. Ciò indica una progressione accelerata del ciclo cellulare attraverso la fase G due del ciclo cellulare. Nella linea cellulare colorettale LS 180 per generare un profilo ciclico della linea cellulare di cancro al seno.

MC sono state raccolte sette cellule ogni ora per otto ore. A seguito della rimozione dell'impulso BRDU. Le cellule immunomarcate e le cellule di controcolorazione del DNA sono state quindi ordinate in base ai loro segnali fluorescenti.

Come si può vedere qui, sette cellule di FC hanno avuto un ciclo a un ritmo significativamente più lento rispetto a una delle due linee cellulari colorettali testate. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come la marcatura metabolica del DNA in combinazione con la raccolta del punto temporale ti consenta di monitorare la cinetica del ciclo cellulare.