Quantitative Analyse von Chromatin Proteome in Disease

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, Chromatin-gebundene Proteine aus dem Mausherz zu isolieren. Dies wird erreicht, indem zuerst das Herz homogenisiert und dann das Herzkernvirus Saccharose isoliert wird, Dichtegradient. Als nächstes wird das Kernplasma von der Chromatinfraktion getrennt.

Dann werden Proteine aus dem Chromatin-Pellet extrahiert, um sie für Proteine anzureichern, die lose an die DNA gebunden sind. Schließlich werden Proteine aus einem anderen Chromatin-Pellet extrahiert, um sie für Proteine anzureichern, die eng an die DNA gebunden sind. Letztendlich können durch quantitative markierungsfreie massenspektrometrische Analyse Ergebnisse erzielt werden, die die Eigenschaften des nukleären Proteoms unter verschiedenen physiologischen Bedingungen zeigen.

Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen im kardiologischen Bereich zu beantworten, z. B. wie der Chromatin-Umbau zu Herzhypertrophie und -versagen beiträgt. Nachdem Sie eine erwachsene Maus geopfert und das Herz herausgeschnitten haben, spülen Sie es in eiskaltem PBS aus. Geben Sie es dann in ein Glas mit zwei Millilitern Lysepuffer, der eine Mischung aus Protease und Phosphatasehemmer enthält, und homogenisieren Sie es.

Gießen Sie die Lysate durch ein 100-Mikron-Sieb und sammeln Sie das Filtrat in einem 1,5-Milliliter-Röhrchen. Von diesem Zeitpunkt an halten Sie, sofern nicht anders angegeben, die Probe auf Eis. Zentrifugieren Sie die Probe fünf Minuten lang bei 4.000 U/min bei vier Grad Celsius. Sammeln Sie das Supinat, das das Cytosol enthält, und lagern Sie es bei minus 80 Grad Celsius.

Reeses biegen das Pellet in 200 Mikrolitern Lysepuffer. Geben Sie einen Milliliter Saccharosepuffer in ein neues Röhrchen und schichten Sie das resuspendierte Pellet vorsichtig mit einer Transferpipettenzentrifuge bei 5.000 U/min für 10 Minuten bei vier Grad Celsius auf das Saccharosepad. Entfernen Sie den dünnen Film auf der Oberseite sowie das Saccharose-Pad, das die Membran enthält.

Das verbleibende Pellet mit den Zellkernen wird mit 200 Mikrolitern eiskaltem P-B-S-E-D-T-A und die Kerne mit dem Pellet mit 200 Mikrolitern Detergenzextraktionspuffer gespült und die Probe zweimal jeweils 10 Sekunden lang vortext. Legen Sie die Probe 10 Minuten lang auf Eis und zentrifugieren Sie sie dann fünf Minuten lang bei 13.000 U/min bei vier Grad Celsius. Entfernen Sie das Supinat, das Nukleoplasmaproteine enthält, und lagern Sie es bei minus 80 Grad Celsius.

Spülen Sie die Pellets mit eiskaltem P-B-S-E-D-T-A ab und resuspendieren Sie es in 300 Mikrolitern Tris, S-D-S-E-D-T-A Puffer. Beschallen Sie die Probe drei- bis sechsmal für jeweils 10 Sekunden. Um die DNA aufzubrechen, halten Sie die Probe zwischen den Syndizierungen auf Eis, zentrifugieren Sie 13.000 U/min für fünf Minuten bei vier Grad Celsius.

Bewahren Sie das Supinat mit dem isolierten Protein auf und lagern Sie es bei minus 80 Grad Celsius, um es für Proteine wie Histone anzureichern, die fest an die DNA gebunden sind. Führen Sie eine separate Fraktionierung durch, um das Chromosom zu isolieren, beginnend mit einem isolierten adulten Herzen oder Kardiomyozyten aus PARPs der Ratte. Zerrieren Sie das Chromatin-Pellet in 400 Mikrolitern 0,4 N Schwefelsäure und wirbeln Sie es auf. Um Klumpen zu entfernen, drehen Sie die Probe 30 Minuten lang um vier Grad Celsius oder entfernen Sie nach der Inkubation über Nacht die nuklearen Trümmer, indem Sie sie 10 Minuten lang bei 16.000 g und vier Grad Celsius drehen.

Übertragen Sie das Supinat in ein frisches Röhrchen und geben Sie 132 Mikroliter Trichloressigsäure tropfenweise in die Probe. Drehen Sie das Röhrchen mehrmals um und inkubieren Sie es 30 Minuten lang auf Eis. Nach dem Schleudern das Supinat entsorgen und mit eiskaltem Aceton das Histon, das das Pellet enthält, vorsichtig abspülen und schleudern.

Wiederholen Sie erneut das Aceton, waschen und trocknen Sie das Pellet an der Luft, bevor Sie es wieder aufhängen. In 100 Mikrolitern Triss S-D-S-E-D-T-A Puffer. Verwenden Sie eine molare Triss, um den pH-Wert auf acht einzustellen.

Beschallen Sie die Probe 15 Minuten lang in einem Wasserbad. Lagern Sie die Probe bei minus 80 Grad Celsius. Nutzen Sie die Massenspektrometrie, um Analysen zur Bestimmung der Reinheit und zur Identifizierung der hier gezeigten Proteine durchzuführen.

Die überlagerten extrahierten Ionenchromatogramme für ein einzelnes Peptid, das auf das HMGB-Ein-Protein abgebildet wurde. Jedes Chromatogramm stammt aus einer anderen Chromatinprobe und wurde farbcodiert, um den physiologischen Zustand der Maus darzustellen, von der die Probe entnommen wurde. Für jeden der physiologischen Zustände, basale Herzhypertrophie und Herzinsuffizienz, wurden drei biologische Replikate analysiert, wobei jede Probe zweimal analysiert wurde, was insgesamt 18 Chromatogramme ergab.

Durch die Integration der Fläche unter der Kurve kann die relative Häufigkeit für jedes Replikat bestimmt werden. In diesem Panel wurden die sechs Replikate für jede der drei physiologischen Bedingungen gemittelt, um Gesamtabundanzwerte zu erhalten. Aus dieser Analyse wird deutlich, dass sich die Häufigkeit von HGB eins im Verlauf der Erkrankung verändert, wie hier zu sehen ist.

Das Fragmentierungsspektrum für dieses Peptid bestätigt seine Aminosäuresequenz und ermöglicht es, es auf das H MG B eins Protein zu kartieren. Im Gegensatz dazu zeigt die Quantifizierung eines anderen Peptids als das Protein Histon H vier, dass sich seine Häufigkeit mit der Krankheit nicht ändert. Wir können die Reproduzierbarkeit der Veränderungen in der Peptidhäufigkeit, die wir zwischen den verschiedenen physiologischen Zuständen beobachten, mit statistischer Analyse analysieren.

Zuerst wird die Häufigkeit aller in jedem Replikat identifizierten Peptide einer Anova unterzogen, gefolgt von einer Hauptkomponentenanalyse oder PCA. Die Clusterung sowohl technischer als auch biologischer Replikate in dieser Grafik bestätigt, dass die durch die Massenspektrometrie erfassten Abundanzänderungen zwischen den verschiedenen Krankheitszuständen konsistent und reproduzierbar sind. Basal in blauer Hypertrophie, rotes Versagen in grün Ebenso wichtig wie die Quantifizierung und Reproduzierbarkeit der Ergebnisse ist die erhöhte Abdeckung des nukleären Proteoms, die durch die nukleare Subfraktionierung ermöglicht wird.

Diese Abbildung zeigt, dass die Analyse des gesamten Kerns allein nicht einmal einen Großteil der identifizierten Kernproteine aufdeckt, wenn man einzelne Analysen aus den einzelnen Kompartimenten kombiniert. Darüber hinaus zeigt die moderate Überlappung zwischen den verschiedenen Fraktionen die biologische Relevanz, diese Kompartimente einzeln zu betrachten, um zusätzliche Einblicke in die Kernfunktion und die Genregulation zu erhalten. Schließlich ermöglicht die Möglichkeit, säureextrahierte oder mit Detergens extrahierte Chromosomen spezifisch zu fraktionieren, wichtige Chromatinstrukturproteine wie Histone, wodurch eine gezieltere massenspektrometrische Analyse einer Gruppe von Proteinen ermöglicht wird, ohne dass für jede Variante und Isoform spezifische Antikörper erforderlich sind. Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, alle Proben, die auf dem Massenspektrometer analysiert werden, frei von Keratinkontaminationen zu halten.

Dies ist besonders wichtig in den nachfolgenden Schritten nach der Proteinisolierung.