A Lógica, etapas experimentais, e potencial de Biossíntese produto heteróloga Natural Apresentando o complexo antibiótico eritromicina Um produzido através

A biossíntese heteróloga é um método que envolve a reprodução de uma via biossintética de um organismo por meio da expressão coordenada de genes em outro organismo hospedeiro. Neste experimento, a via biossintética para a eritromicina A é transferida para um sistema hospedeiro de e coli com o objetivo final de produzir grandes quantidades deste antibiótico. Primeiro, o agrupamento gênico responsável pela formação da eritromicina é isolado do hospedeiro bacteriano original.

O material genético estranho é então redesenhado no formato opera para permitir a expressão coordenada de toda a via enzimática em *E. coli*. Conforme a linhagem de *E. coli* que carrega a via heteróloga de eritromicina se replica em cultura, o composto final de eritromicina é produzido. A atividade antibiótica do composto pode então ser testada utilizando um ensaio funcional com *Bacillus subtilis*. Em contraste com a produção de produtos naturais complexos por meio de seus organismos originais.

A biossíntese heteróloga por meio de E. coli oferece a oportunidade de velocidade de processo e potencial de engenharia. Essa ideia começou há cerca de 10 a 15 anos, mas somente recentemente, com diversos avanços técnicos e melhorias em nossa tecnologia, temos conseguido observar histórias reais de sucesso na produção complexa de produtos naturais utilizando E. coli. Primeiro, projete e solicite primers de PCR para amplificar todos os genes associados ao agrupamento no interior do cromossomo. Para a reação em cadeia da polimerase, utilize DNA genômico recém-preparado como molde.

Se os genes-alvo apresentarem alto teor de GC, como o agrupamento da eritromicina A em S. erythri, adicione quatro microlitros de DMSO em uma reação de 50 microlitros. Confirme a identidade dos produtos de PCR por sequenciamento. Em seguida, clone os produtos gênicos de PCR em um sistema de expressão em E. coli. Enquanto cin, utilizamos o padrão oito como vetor de expressão para certos genes, já que a inclusão da sequência líder terminal aumentou a superexpressão proteica.

Em seguida, confirme a expressão de uma preparação funcional de proteína. Utilizando análise por eletroforese em gel de R-T-P-C-R-S-D-S ou ensaios fenotípicos convenientes, construa agora óperas com base em genes expressos com sucesso a partir de plasmídeos individuais de expressão. Se possível, projete combinações de enzimas de restrição coesivas compatíveis para converter sequencialmente os genes em tos.

Durante o processo de construções abertas, precisamos garantir que a enzima de restrição utilizada não corte a sequência individual. Caso isso ocorra, é necessário considerar a síntese gênica para prosseguir com a consolidação dos 20 genes da eritromicina A em plasmídeos de expressão, levando em consideração os fatores detalhados no manuscrito suplementar.

Agora, transforme a linhagem de E. coli BAP1 com os plasmídeos biossintéticos recém-projetados, sequencialmente ou em combinação, e plaque as células em meio sólido LB contendo uma combinação de antibióticos para seleção de manutenção dos plasmídeos. É altamente incomum utilizarmos seis seleções diferentes com antibióticos em transformações de E. coli, mas isso se deve simplesmente à necessidade de seis plasmídeos para a síntese total da eritromicina A em coli. Esta seção estabelece as condições de cultivo para a atividade coordenada de toda a via de produção da eritromicina A.

O Gen BP um foi projetado para fornecer o substrato necessário para a cin, uma biossíntese, e para modificar pós-traducionalmente a mega-síntese de IDE. Escolha colônias separadas do BAP um recém-transformado e inocule três culturas de 1,5 mililitro em meio alb contendo o antibiótico de seleção do plasmídeo necessário, 100 micromolar de IPTG, dois miligramas por mililitro de arabinose para induzir a expressão gênica e 20 milimolar de propionato de sódio.

Para apoiar a formação de precursores biossintéticos intracelulares, cultive as células a 22 graus Celsius e 250 RPM por 24 a 48 horas. Amostre periodicamente a cultura para análise da estabilidade do plasmídeo durante o crescimento. Clarifique as culturas por centrifugação a 10.000 RPM.

Remova o sobrenadante e armazene o pellet a quatro graus Celsius para análise. Para confirmar e quantificar a formação de eritromicina A, injete o sobrenadante do cultivo em um sistema de CL-EM. Execute também amostras padrão de eritromicina A comercialmente disponível. Para os casos sem os padrões comercialmente disponíveis.

O composto precisará de caracterizações químicas adicionais por RM e espectrometria de massas de alta resolução. Compare a produção entre os três preparos e identifique o produtor mais alto. Prepare um estoque glicerinado a partir da fonte da colônia e armazene a menos 80 graus Celsius com o estoque produtor mais alto de eritromicina A.

Inicie um cultivo separado de produção de E. coli, extraia o sobrenatante final com dois volumes de acetato de etila. Em seguida, seque o extrato em um speed vac e ressuspenda o pellet em 100 microlitros de metanol. Depois, transfira o extrato para um disco de filtro estéril e seque ao ar separadamente.

Cultive B subtles em caldo LB durante a noite, adicione 20 microlitros da cultura de B subtles a 20 mililitros de ágar LB líquido a 45 graus Celsius e prepare uma placa. Em seguida, coloque o disco de filtro contendo eritromicina A sobre a placa sólida contendo ágar e incube a 37 graus Celsius. Neste exemplo, o agrupamento gênico da eritromicina de S urethra é transferido para E coli após a produção da eritromicina A pelo hospedeiro heterólogo E coli.

O produto bioativo é analisado no cromossomo nativo S ETH três A. O agrupamento gênico da eritromicina está organizado em 55 KB de DNA total após a expressão; uma via biossintética complexa, que requer precursores intracelulares e enzimas biossintéticas e de modificação poli-hei, gera eritromicina A para a transferência gênica. Os genes individuais são primeiramente isolados por meio de PCR.

Em seguida, os genes necessários para a formação da eritromicina A são, primeiro, clonados individualmente em vetores de expressão para confirmar a produção e atividade das proteínas por meio de eletroforese em gel de poliacrilamida com SDS e ensaios fenotípicos, e, segundo, consolidados como operons para a eventual transferência completa da via para *E. coli*. Certos genes exigiam expressão com uma sequência líder no extremo cinco primo, resultante do vetor de expressão PET 28, enquanto outros não. A expressão dos genes individuais foi inicialmente analisada por eletroforese em gel de poliacrilamida com SDS. Esse resultado mostra a avaliação fenotípica do gene ERME para resistência à eritromicina A; a eritromicina A no meio sólido é utilizada para ensaiar cepas de *E. coli* que carregam plasmídeos com ou sem o gene de resistência à eritromicina A, ERME.

É evidente que o crescimento celular é recuperado com a expressão de ERME. Em seguida, a via completa de eritromicina A é introduzida em *E. coli*, incluindo um plasmídeo para o chaperona grow EL e um plasmídeo contendo uma cópia extra de URI K. A eletrotransformação é utilizada para introduzir os plasmídeos em *E. coli*. A estabilidade dos plasmídeos é então avaliada na linhagem final.

Os resultados de CLAE confirmam e quantificam a produção de eritromicina. Uma funcionalidade importante é confirmada por bioensaios antibacterianos que produzem zonas de inibição em linhas de bactérias B subtis, ou limitam o crescimento da cultura de B subtis em diluições seriadas de eritromicina A. Assim, com esta demonstração em vídeo da biossíntese heteróloga complexa de produtos naturais, você agora tem a capacidade de projetar, implementar e analisar as etapas experimentais individuais necessárias para produzir um produto natural heterólogo completo. Ao aplicar engenharia metabólica à célula de E. coli para otimizar vários precursores e a via introduzida, é possível maximizar a produção de, por exemplo, eritromicina, que foi o que discutimos hoje, ou de qualquer outro composto que possa ter valor medicinai ou seja difícil de produzir.