טיפול במומי Osteochondral במפרק הברך של הארנב על ידי השתלה של תאי גזע mesenchymal אלוגנאית בקרישי הפיברין

המטרה הכוללת של הליך זה היא להדגים שיטה סטנדרטית למחקר ניסיוני בתאי גזע בתחום תיקון אוסטאוכונדרל. זה מושג על ידי בידוד תאי גזע מזנכימליים ממח עצם הארנב. בשלב השני, תאי הגזע המבודדים עוברים תרבית כדי להקל על ההתפשטות.

לאחר מכן, קרישי תאי הפיברין מיוצרים במבחנה. לבסוף, קרישי תאי הפיברין שנקבעו מראש מושתלים בפגמים אוסטאוכונדרליים מלאכותיים במפרק ברך הארנב. בסופו של דבר, לאחר 12 שבועות in vivo, ניתן לבצע ניתוח מקרוסקופי של הברך כאשר רקמת התיקון מראה משטח הומוגני ושלם עם מרקם מוצק.

ההשלכות של טכניקה זו משתרעות על טיפול בנגעי סחוס בסביבה של חיות ניסוי מכיוון שהיא מאפשרת ניתוח in vivo של יכולת האינטגרציה וההתחדשות של תאי גזע מזנכימליים אלוגניים לטיפול בנזק לסחוס. בחדר הניתוח, השתמש בזוג קוצץ חשמלי כדי לגלח את הפרווה מהגפיים האחוריות מהגב והבטן של ארנב שהורדם, ובמקביל לשאוב את הפרווה לאחר חיטוי יסודי של האזור המגולח באתנול 70%. בצע חתך לאורך פני הגולגולת של הרגל והשוק, ולאחר מכן שיקף את העור והרקמה התת עורית על ידי דיסקציה חדה.

לאחר מכן, הפרד את השרירים והרצועות מהשוקה ועצם הירך, תוך שמירה על החתכים קרוב ככל האפשר לעצם לדיסקציה נקייה. לאחר מכן חתוך את מפרק הירך כדי להפריד את ראש עצם הירך מהאצטבולום ולהעלות את קומפלקס הירך הטיביאלי. כעת השתמש בלהב האזמל כדי לגרד את כל הרקמות הרכות שנותרו מהעצמות.

לאחר מכן חתכו את הפיקה ואת רצועות מפרק הברך כדי להפריד סוף סוף את עצמות הרגליים. רססו את העצמות המופרדות באתנול 70% לאחר שהתייבשו באוויר. הנח כל עצם בצינורות צנטריפוגות נפרדים של 50 מיליליטר המכילים מצע תרבית תאים כדי לשמור על לחותם בתרבית תאים סטרילית.

מכסה המנוע הזרימה הלמינרית. השתמש במלקחיים סטריליים כדי להעביר את העצמות שנקטפו מצינורות הצנטריפוגה לכלים של 150 מילימטר. לאחר מכן השתמש במסור סטרילי כדי להסיר את שני קצוות העצם ולהעביר את החלקים לכלים חדשים של 150 מילימטר.

לאחר מכן, מלאו מזרק של 10 מיליליטר במדיום. חבר אליו מחט בגודל 18 והכנס את קצה המחט לקצה אחד של העצם לתוך המח. כעת שטפו את חלל המח במדיום כדי לשטוף את מח העצם לתבשיל.

לאחר מכן יש לשאוב את תרחיף התאים לתוך המזרק ולשטוף את מח העצם שוב ושוב עד שהתרחיף חופשי, צף דרך חלל מח העצם ולא מופיעים קרישי מח עצם נוספים. לאחר איסוף מח העצם מכל העצמות, מלאו את המזרק בתרחיף מח העצם דרך המחט והכריחו את תרחיף מח העצם החוצה לתווך כדי לשבש את גושי מח העצם. לאחר מכן, העבירו את התרחיף דרך מסנן תאים לתוך צינור של 50 מיליליטר כדי למנוע אובדן תאים.

שוטפים את צלחת התרבות פעמיים עם 10 מיליליטר בינוני, ושופכים את הכביסה דרך המסנן בכל פעם. צנטריפוגה את המתלים למשך חמש דקות ב-500 פעמים GE וטמפרטורת החדר. לאחר מכן הסר את הסופרנטנט והשהה מחדש את כדור התא ב -10 מיליליטר של מדיום.

לאחר מכן, הוסף חמישה מיליליטר של תמיסת הפרדת שיחות ביולוגיות לתוך צינור של 15 מיליליטר, ולאחר מכן שכב בזהירות חמישה מיליליטר של תרחיף תאים מעל. לאחר צנטריפוגה של תמיסת השכבות, תאי הדם האדומים ישקעו לקרקעית בעוד תאי הגזע PBMC והמזנכימליים יישארו בממשק. העבירו את התאים בממשק לצינור חרוטי של 15 מיליליטר והשתמשו בחמישה מיליליטר PBS כדי לשטוף את תאי הגזע PBMC והמזנכימליים שנאספו פעמיים עד שלוש.

ואז סובב את התאים פעם נוספת והשהה מחדש את הגלולה ב -10 מיליליטר מדיום. לבסוף, ספרו את התאים בעזרת ציטומטר המו ולאחר מכן צלחו אותם בצפיפות זריעה ראשונית של כחמש פעמים 10 עד השישית בכלים של 150 מילימטר. לאחר יומיים-שלושה, שמרו על התרביות על ידי הסרת התאים שאינם נדבקים.

שטיפת הצלחת עם PBS להסרת פסולת התאים והזנת התאים במדיום טרי ושלם ביום ההשתלה. התחל בחשיפת התאים הדבקים ל-0.25% טריפסין EDTA למשך שלוש דקות. עצור את הטריפסין על ידי הוספת מדיום שלם.

לאחר מכן העבירו את תאי הגזע המזנכימליים המנותקים לצינור חרוטי של 50 מיליליטר ושטפו אותם פעמיים עם PBS. לאחר קביעת ספירת התאים והכדאיות על ידי צביעה כחולה טריאן, הכינו תערובת מאסטר של לפחות קריש אחד נוסף לפי הצורך עבור n שווה ארבעה. סובב 200,000 תאים בצינור מיקרו צנטריפוגה ולאחר מכן השהה מחדש את הגלולה ב-68 מיקרוליטר של PBS ו-100 מיקרוליטר של רכיב הפיברינוגן של ערכת פחם רקמות.

לאחר מכן, חסנו ארבעה מיקרוליטר של תמיסת תרומבין לתוך חור אחד של צלחת סטרילית שנקדחה מראש. הוסף מיד את כל 42 המיקרוליטרים של תרחיף תא פיברינוגן אחד, ולאחר מכן מעל תרחיף התא עם ארבעה מיקרוליטרים נוספים של תמיסת תרומבין. בתחילה, נפח 50 מיקרוליטר של תרחיף תאי הפיברינוגן המצומצם, נבלוט מעל שפת החור שנקדח מראש עקב מתח הפנים.

עם זאת, לאחר שעה, התערובת תיקרש לחלוטין ותתכווץ כך שתתאים לחור שנקדח מראש. כעת, השתמש במלקחיים קהים כדי להסיר בזהירות את הקריש ולאחר מכן הנח אותו בצינור מיקרו צנטריפוגה המכיל PBS. לאחר חיטוי הברך המגולחת, יש למשש היטב את הפיקה ולבצע חתך עור מדיאלי לפיקה.

לאחר מכן, פתח את מפרק הברך על ידי ארתרוטומיה מדיאלית של הפיקה בתנאים סטריליים, ולאחר מכן עקור את הפיקה לרוחב. כעת השתמש במקדחה חשמלית סטרילית להפעלת אוויר עם מקדח בקוטר 3.6 מילימטר והתקן עצירה כדי ליצור שני פגמים אוסטאוכונדרליים בצורת שמונה בעומק שלושה מילימטר בחריץ הטרוכלאה. לאחר מכן, לאחר שטיפת הפגמים במי מלח סטריליים, יש להוציא 20 מיקרוליטר דבק פיברין באופן שווה לתחתית הפגמים במהירות לפני שהדבק מתייבש.

השתל את הקרישים המותאמים לתוך הפגם בצורת הספרה שמונה. לאחר הקרישה, העבר את הפיקה לתוך החריץ הטרוכלארי וכופף ומתח את הברך מספר פעמים. לאחר מכן עקור שוב את הפיקה לרוחב ובדוק אם קרישי תאי הפיברינוגן עדיין במקומם.

לאחר החלפת הפיקה שוב, סגור את הפצע בשכבות עם כפתור יחיד ארבעה תפרי אוט ויקריל וארבעה עורי אוט מונוקריל רציף. לבסוף אטמו את הפצע בעזרת חבישת תרסיס חדירה לאדי מים. בניסוי זה, הפגם התמלא ברקמת תיקון בעלת תכונות ביומכניות דומות ועמידות דומה לסחוס שמסביב.

קריש תאי פיברין זה הוכן במבחנה על צלחת סטרילית עם חורים שנקדחו מראש, שגודלם זהה לפגם האוסטיאוקונדרלי. כתוצאה מכך, לא היו סדקים בין קריש הפיברין המושתל לסחוס שמסביב, מה שיהווה גורם סיכון לניוון מוקדם או דלמינציה. הובטח קרינה בזאלית של רקמת התיקון מכיוון שעצם הכונדרל התת-קרקעית חדרה וכך פעלה כנגד גזירה.

היבט חשוב נוסף היה נוקשות רקמת התיקון, שאמורה להתאים לרקמת הסחוס הבריאה שמסביב כדי למנוע עומס מוגבר על המפרק וניוון מוקדם אפשרי. יתרה מכך, נמצא משטח שלם והומוגני של ההשתלה, שהפחית את הלחץ המוחלט ואת הנזק האפשרי לשתל לאחר פיתוחו. טכניקה זו יכולה לסלול את הדרך לחוקרים בתחום מחקר תאי גזע אורטופדיים לחקור אפשרויות טיפול למומים אוסטאוכונדרליים ומודל ניסיוני של בעלי חיים.

להדגמה מפורשת יותר בחלק מהטכניקות להכנת בעלי חיים וניתוחי ברכיים, הקפד לצפות במאמר הנלווה שלנו Jovi מטריקס השתלת כונדרוציטים אוטולוגיים בסיוע שיפוץ ותיקון פגמים כונדרליים. במודל ארנב.