Name: תיוג של תאים בודדים במערכת העצבים המרכזית של דרוזופילה melanogaster (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-03-04T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 33 s
Description: למדו שיטה לתיוג תאים עצביים בודדים במערכת העצבים המרכזית של Drosophila melanogaster באמצעות צבע ליפופילי ומיקרוסקופיית קונפוקל. השיטה מאפשרת ניתוח מורפולוגיה עצבית בהקשר של ביטוי GFP.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי מענק מDFG לGMT

<ol><li>Brand, A. H., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+gene+expression+as+a+means+of+altering+cell+fates+and+generating+dominant+phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes.</a> Development. 118, 401-415 (1993).</li>
<li>Broadie, K., Sink, H., Van Vactor, D., Fambrough, D., Whitington, P. M., Bate, M., Goodman, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+growth+cone+to+synapse%3A+the+life+history+of+the+RP3+motor+neuron%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Suppl%22%5BJournal%5D)">From growth cone to synapse: the life history of the RP3 motor neuron.</a> Dev. Suppl. , 227-238 (1993).</li>
<li>Campos-Ortega, J., Hartenstein, V. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCampos-Ortega%2C+J+%22The+Embryonic+Development+of+Drosophila+melanogaster%22">The Embryonic Development of Drosophila melanogaster</a>. , Springer. Berlin. (1985).</li>
<li>Featherstone, D. E., Chen, K., Broadie, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Harvesting+and+Preparing+Drosophila+Embryos+for+Electrophysiological+Recording+and+Other+Procedures%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Harvesting and Preparing Drosophila Embryos for Electrophysiological Recording and Other Procedures.</a> J. Vis. Exp. (27), e1347(2009).</li>
<li>Grenningloh, G., Rehm, E. J., Goodman, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+analysis+of+growth+cone+guidance+in+Drosophila%3A+fasciclin+II+functions+as+a+neuronal+recognition+molecule%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Genetic analysis of growth cone guidance in Drosophila: fasciclin II functions as a neuronal recognition molecule.</a> Cell. 67, 45-57 (1991).</li>
<li>Kunz, T., Kraft, K. F., Technau, G. M., Urbach, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Origin+of+Drosophila+mushroom+body+neuroblasts+and+generation+of+divergent+embryonic+lineages%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Origin of Drosophila mushroom body neuroblasts and generation of divergent embryonic lineages.</a> Development. 139, 2510-2522 (2012).</li>
<li>Lanciego, J. L., Wouterlood, F. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+half+century+of+experimental+neuroanatomical+tracing%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chem.+Neuroanat%22%5BJournal%5D)">A half century of experimental neuroanatomical tracing.</a> J. Chem. Neuroanat. 42, 157-183 (2011).</li>
<li>Lee, T., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mosaic+analysis+with+a+repressible+cell+marker+for+studies+of+gene+function+in+neuronal+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Mosaic analysis with a repressible cell marker for studies of gene function in neuronal morphogenesis.</a> Neuron. 22, 451-461 (1999).</li>
<li>Levick, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Another+tungsten+microelectrode%5BTitle%5D)+AND+%22Med.+Biol.+Eng%22%5BJournal%5D)">Another tungsten microelectrode.</a> Med. Biol. Eng. 10, 510-515 (1972).</li>
<li>Matthes, D. J., Sink, H., Kolodkin, A. L., Goodman, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Semaphorin+II+can+function+as+a+selective+inhibitor+of+specific+synaptic+arborizations%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Semaphorin II can function as a selective inhibitor of specific synaptic arborizations.</a> Cell. 81, 631-639 (1995).</li>
<li>Murray, M. J., Whitington, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+roundabout+on+growth+cone+dynamics%2C+filopodial+length%2C+and+growth+cone+morphology+at+the+midline+and+throughout+the+neuropile%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Effects of roundabout on growth cone dynamics, filopodial length, and growth cone morphology at the midline and throughout the neuropile.</a> Journal of Neuroscience. 19, 7901-7912 (1999).</li>
<li>Murray, M. J., Merritt, D. J., Brand, A. H., Whitington, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+dynamics+of+axon+pathfinding+in+the+Drosophilia+CNS%3A+a+time-lapse+study+of+an+identified+motorneuron%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">In vivo dynamics of axon pathfinding in the Drosophilia CNS: a time-lapse study of an identified motorneuron.</a> J. Neurobiol. 37, 607-621 (1998).</li>
<li>Patel, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+neuronal+subsets+and+other+cell+types+in+whole-mount+Drosophila+embryos+and+larvae+using+antibody+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Imaging neuronal subsets and other cell types in whole-mount Drosophila embryos and larvae using antibody probes.</a> Methods Cell Biol. 44, 445-487 (1994).</li>
<li>Rickert, C., Kunz, T., Harris, K. -L., Whitington, P. M., Technau, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphological+characterization+of+the+entire+interneuron+population+reveals+principles+of+neuromere+organization+in+the+ventral+nerve+cord+of+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Morphological characterization of the entire interneuron population reveals principles of neuromere organization in the ventral nerve cord of Drosophila.</a> Journal of Neuroscience. 31, 15870-15883 (2011).</li>
<li>Thomas, J. B., Bastiani, M. J., Bate, M., Goodman, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+grasshopper+to+Drosophila%3A+a+common+plan+for+neuronal+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">From grasshopper to Drosophila: a common plan for neuronal development.</a> Nature. 310, 203-207 (1984).</li>
<li>Whitington, P., Harris, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+axonogenesis+in+the+embryo+of+a+primitive+insect%2C+the+silverfish+Ctenolepisma+longicaudata%5BTitle%5D)+AND+%22Development+Genes+and+Evolution%22%5BJournal%5D)">Early axonogenesis in the embryo of a primitive insect, the silverfish Ctenolepisma longicaudata.</a> Development Genes and Evolution. 205 (5-6), 272-281 (1996).</li>
<li>Whitington, P., Meier, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Segmentation%2C+neurogenesis+and+formation+of+early+axonal+pathways+in+the+centipede%2C+Ethmostigmus+rubripes+%28Brandt%29%5BTitle%5D)+AND+%22Development+Genes+and+Evolution%22%5BJournal%5D)">Segmentation, neurogenesis and formation of early axonal pathways in the centipede, Ethmostigmus rubripes (Brandt).</a> Development Genes and Evolution. 199, 349-363 (1991).</li>
<li>Whitington, P. M., Seifert, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axon+growth+from+limb+motorneurons+in+the+locust+embryo%3A+the+effect+of+target+limb+removal+on+the+pattern+of+axon+branching+in+the+periphery%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Axon growth from limb motorneurons in the locust embryo: the effect of target limb removal on the pattern of axon branching in the periphery.</a> Developmental Biology. 106, 438-449 (1984).</li>
<li>Whitington, P. M., Leach, D., Sandeman, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolutionary+change+in+neural+development+within+the+arthropods%3A+axonogenesis+in+the+embryos+of+two+crustaceans%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Evolutionary change in neural development within the arthropods: axonogenesis in the embryos of two crustaceans.</a> Development. 118, 449-461 (1993).</li>
<li>Williams, D. W., Tyrer, M., Shepherd, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tau+and+tau+reporters+disrupt+central+projections+of+sensory+neurons+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Tau and tau reporters disrupt central projections of sensory neurons in Drosophila.</a> J. Comp. Neurol. 428, 630-640 (2000).</li>
</ol>

החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

אחד יתרונות עיקריים של דרוזופילה כמודל למערכת הוא שהיא מאפשרת ניתוח של התפתחות ותפקוד ברמה של תאים בודדים. זה שימושי במיוחד לגבי מערכת עצבים, שם המגוון של סוגי תאים הוא גבוה במיוחד והתפקוד והמורפולוגיה של תאי שכנים יכולים להיות שונים לחלוטין. השיטה שאנו מציגים כאן מאפשרת תיוג של נוירונים בודדים עם צבע שגם יכול להפוך לכתם קבוע, או נבחן ישירות על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי. הוא מגלה את המורפולוגיה של תהליכי...

ידע של מורפולוגיה עצבית ברמה של תאים בודדים הוא תנאי מפתח להבנת קישוריות עצבית ותפקוד מערכת עצבים מרכזיים. כך, החל מהימים הראשונים של מדעי המוח, החוקרים בקשו לפתח טכניקות תיוג תא בודדות (ראה 7 לטיפול הסטורי של בעיה זו). שיטות קלסיות כגון צביעת Golgi לספק רזולוציה מצוינת של מורפולוגיה עצבית אך אינן מתאימים אם אחד מבקש לתייג סוג מסוים של נוירון באופן מכוון, כמכתים מתרחשת באופן אקראי. הפיתוח של שיטות להכתמת תאים בודדים על ידי הזרקה תאית או juxtacellular של צבעים מmicroelectrode התייחס לדרישה של תיוג ספציפי. היישום של זריקה אחת נוירון לצבוע כדי תסיסנית הציג אתגר גדול, בגלל גודלו הקטן של שניהם האורגניזם ותאי העצב שלה. עם זאת, כתמי נוירון בודדים של עוברית דרוזופילה </emהנוירונים&gt; הושגו באמצע 1980 במעבדה של הקורים 15 גודמן. בעוד השיטה הייתה בהחלט שימושית וספקה כמה תובנה חשובות על מנגנונים להתפתחות עצבית בדרוזופילה במשך 20-30 השנים האחרונות (לדוגמה, 2, 10), עובדים רבים נרתעו ממנו, בעיקר בגלל הדרישות הטכניות שלה. הזמינה בשנים האחרונות יותר של טכניקות גנטיות לתיוג עצבי בדרוזופילה גם תרם לפופולריות של הזרקת צבע נוירון בודדה. ביטוי GAL4 ביים של מבני GFP קרום ממוקדים יכול לספק פתרון מצוין למורפולוגיה עצבית 1, 20. עם זאת, לשיטה זו יש מגבלות מסוימות: הביטוי לעתים קרובות בלתי הנמנע של ה-GFP בתאים מרובים יכול לטשטש את המבנה של תאי עצב בודד וקו נהג GAL4 לא יהיה זמין לנהוג ביטוי בתא עצב מסוים של ריבית. MARCM (ניתוח פסיפס עם ציטוטמרקר סלולרי ressible) שיטה 8 יכול לספק תיוג של מהות כל נוירון ברמת התא הבודדה, אך לא ניתן להשתמש בהצלחה בעובר והזחל מוקדם בגלל התחלופה האיטית של חלבון GAL80. בהתחשב במגבלות אלה של תיוג גנטי, אנו מאמינים כי הזרקת צבע נוירון הבודדה בעובר דרוזופילה נשארת טכניקה חשובה וראויה ליישום רחב יותר. כדי לקדם מטרה זו, אנו מספקים כאן תיאור מפורט של השיטה. המחשת כוחה מסופקת על ידי החשבון האחרון שלנו על המורפולוגיה של הסט השלם של interneurons בneuromeres בטן של העובר מאוחר תסיסנית 14. מחקר זה, שחשף גם את השונות מורפולוגית של סוגי תאים עצביים בודדים ועקרונות של ארגון neuromere במערכת העצבים המרכזיים של העובר, לא היה אפשרי עם כל שיטת תיוג זמינה אחרת.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם מגיב / חומרים </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגים </td><td> תגובות </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> ריאגנטים </td></tr><tr><td> DAB </td><td> סיגמה אולדריץ </td><td> <a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/d5905" target="_blank">D-5905</a> </td><td> 2-3 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​ב100 מ&quot;מימ TRIS-HCL, pH 7.4 </td></tr><tr><td> DiI </td><td> Invitrogen בדיקות / מולקולריות </td><td> <a href="http://products.invitrogen.com/ivgn/product/D282" target="_blank">D-282</a> </td><td> 1 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​באתנול </td></tr><tr><td> <a href="http://www.merckmillipore.com/germany/chemicals/formaldehydloesung-min-37-prozent/MDA_CHEM-104002/p_Wt6b.s1L6pAAAAEWpOEfVhTl" target="_blank">פורמלדהיד</a> </td><td> מרק Millipore </td><td></td><td> 7,4% ב PBS </td> &lt;/ P&gt; <tr><td> גליצרול </td><td> <a href="http://www.carlroth.com/catalogue/" target="_blank">רוט</a> </td><td> 3783 </td><td> 70% ב PBS </td></tr><tr><td> Heptane דבק </td><td> Beiersdorf AG </td><td> צ&#39;לו 31-39-30 * </td><td> לדלל CA. 1-1 עם n-heptane </td></tr><tr><td> PBS </td><td></td><td></td><td> 1x </td></tr><tr><td> TRIS </td><td> <a href="http://www.carlroth.com/catalogue/" target="_blank">רוט</a> </td><td> 4855 </td><td></td></tr><tr><td> Vectashield </td><td> מעבדות וקטור </td><td> <a href="http://www.vectorlabs.com/catalog.aspx?prodID=427" target="_blank">H1000</a> </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> ציוד </td></tr><tr><td> מיקרוסקופ confocal </td><td> ליקה </td><td> TCS SP2 </td><td> כדי להציג ולתעד labelings בפלואורסצנטי </td></tr><tr><td> DC -mplifier </td><td> דרגן חברה </td><td> אבן הפינה ION-100 </td><td> כדי לבצע את labelings </td></tr><tr><td> Coverslips </td><td> <a href="http://www.menzel.de/" target="_blank">מנזל</a> </td><td> BB018018A1 </td><td> 18 מ&quot;מ x 18 </td></tr><tr><td> Coverslips </td><td> <a href="http://www.menzel.de/" target="_blank">מנזל</a> </td><td> BB024060A1 </td><td> 24 מ&quot;מ x 60 </td></tr><tr><td> ביתור מיקרוסקופ </td><td> ליקה </td><td> MZ8 </td><td> להכין וdisect עוברים </td></tr><tr><td> נימים שטוחות </td><td> <a href="http://www.hilgenberg-gmbh.de/" target="_blank">Hilgenberg</a> </td><td></td><td> מ&quot;מ קוטר חיצוני 1; עובי 0.1 מ&quot;מ glas </td></tr><tr><td> הזרקת נימים </td><td> מוצרי מדע </td><td> 100 GB TF 8P </td><td></td></tr><tr><td> R micromanipulator </td><td> ליקה </td><td></td><td> כדי לבצע את labelings </td></tr><tr><td> דגם P-97 </td><td> סאטר מכשירים </td><td></td><td> למשוך נימים </td></tr><tr><td> שקופיות אובייקטים </td><td> <a href="http://www.marienfeld-superior.com/" target="_blank">Marienfeld Superior</a> </td><td> 1000000 </td><td></td></tr><tr><td> מיקרוסקופ המדעי </td><td> Zeiss </td><td> Axioskop 2 mot </td><td> כדי להציג labelings לאחר photoconversion </td></tr><tr><td> מיקרוסקופ המדעי </td><td> אולימפוס </td><td> BX50 </td><td> כדי לבצע את labelings </td></tr><tr><td> מצלמת וידאו הסוני MC3255 </td><td> סוני / AVT הורן </td><td> סוני MC3255 </td><td> כדי להקליט labelings לאחר photoconversion </td></tr></tbody></table> טבלת 1.

תיוג של תאים בודדים במערכת העצבים המרכזית של<em&gt; דרוזופילה melanogaster</em

Labeling of Single Cells in the Central Nervous System of Drosophila melanogaster

במאמר זה יתאר כיצד בנפרד לתייג תאי עצב במערכת העצבים המרכזיים העוברית של דרוזופילה melanogaster על ידי ההזרקה של juxtacellular DiI סמן lipophilic ניאון הממברנה. שיטה זו מאפשרת הדמיה של מורפולוגיה של תאים עצבית בפירוט רב. אפשר לתייג את כל תאים במערכת העצבים מרכזיים: גופי תא של הנוירונים היעד הם דמיינו תחת אופטיקה DIC או על ידי ביטוי של סמן גנטי ניאון כגון ה-GFP. לאחר תיוג, DiI יכול להפוך לחום קבוע כתם ידי photoconversion כדי לאפשר הדמיה של מורפולוגיה תא עם אור מועבר ואופטיקה DIC. לחלופין, את התאים שכותרת DiI-ניתן לצפות ישירות עם מיקרוסקופיה confocal, המאפשרים חלבוני כתב ניאון הציגו גנטי להיות colocalised. הטכניקה יכולה לשמש בכל בעל חיים, ללא קשר לגנוטיפ, כך שניתן לנתח פנוטיפים מוטציה ברזולוצית תא בודדה.

איור 4 ממחיש תוצאות טיפוסיות של הטכניקה, שאנו מתארים כאן. האיור 4A מראה דוגמה של interneuron אחת DiI מלא שphotoconverted נקי. זה יפה ממחיש את כמות הפרטים אלה הצעת הכנות. כאשר מתחת אופטיקה DIC ההקשר המרחבי של התא המסומן בתוך הרקמה הסובבת הלא מתויגת-הופך לגלוי, למשל עמדתו של גוף התא בקליפת המוח ושל השלכת הסיבים בתוך neuropile. האיור 4B הוא מקרה שבו טיפת הצ...

אנו מציגים טכניקה לסימון תאי עצב בודדים במערכת העצבים המרכזית (CNS) של<em&gt; דרוזופילה</em&gt; עוברים, המאפשר הניתוח של מורפולוגיה עצבית על ידי אור או שודר או מיקרוסקופיה confocal.

In this  article we describe how to individually label neurons in the embryonic CNS of Drosophila melanogaster by juxtacellular injection of the ...

המטרה הכוללת של הליך זה היא לסמן נוירונים בודדים במערכת העצבים המרכזית של עוברי דרוזופילה בשלב מוקדם 17. זה מושג על ידי איסוף ביצים ומתן אפשרות להן להתפתח לשלב הנכון. השלב השני של ההליך הוא כלור ידני ויישור הביצים.בעקבות דיווה זו, קולוניזציה ותיוק של העוברים הופכים את חוט העצב לנגיש. השלב האחרון הוא לתייג תאים בודדים על ידי יישום Iono retic של עין למות ליפופילית. בסופו של דבר, התוצאות מאפשרות הדמיה של מורפולוגיה של נוירון בודד אם רוצים בהקשר של דפוסי ביטוי GFP ידועים או ברקע מוטנטי.היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות תיוג תאים בודדות קיימות כמו markum הוא שהיא פועלת בעובר ומאפשרת לדמיין תאים מזוהים בכוונה. הדגמה חזותית של שיטה זו מועילה ביותר מכיוון ששלבים רבים עדינים ולכן קשים ללמידה. אפשר לזבובים בריאים להטיל עוברים על צלחות אגר.החלף את הצלחת כל שעה וחצי בחום של 25 מעלות צלזיוס ושמור על העוברים. דגרו את העוברים על הצלחות שלהם בטמפרטורה של 25 או 18 מעלות צלזיוס עד שהם מגיעים לשלב ההתפתחותי הנדרש. כשהוא מוכן, העבירו את העוברים לשקופית מכוסה בסרט דביק דו צדדי.הימנע מהעברת אגר כלשהו עם העוברים מכיוון שהוא יפריע להדבקתם לסרט. בקלטת. הניחו לעוברים להתייבש במשך חמש עד 10 דקות בזמן ההמתנה.מצפים פתק כיסוי בגודל 24 מילימטר על 60 מילימטר בדבק הפטן. הניחו טיפת דבק קטנה במרכז השקופית ופזרו אותה לסרט דק מאוד בעזרת פתק כיסוי מרובע של 18 מילימטר. לאחר שהעוברים התייבשו, גע בהם בעדינות עם מחט.הקוריון ייפתח והעובר יידבק למחט. העבירו מיד את העוברים נטולי הכלור לגוש אגר כדי למנוע את התייבשותם. יישר אותם שם 10 ברצף, צדי הגחון כלפי מעלה.חותכים את עודפי האגר מהבלוק בעזרת אזמל. לאחר מכן גע בעדינות בעוברים עם החלקת הכיסוי המצופה דבק הפטן. עליהם להיצמד להחלקת הכיסוי עם צידי הגחון כלפי מטה.מרחו מסגרת של סרט דבק סביב החלקה של הכיסוי והצמידו אותה לשקופית מיקרוסקופ. שמירה על העוברים על גבי החלקת הכיסוי. כסו את העוברים בכמויות נדיבות של PBS בצד הגבי של כל עובר ליד הקצה האחורי שלו.חודרים לקרום הוויטל בעזרת מחט זכוכית, קורעים את הממברנה לאורך קו האמצע הגבי וגוררים את העובר החוצה מהקרום. כעת כוון מחדש את הצד הגחוני של העובר כלפי מטה במקום אחר על מצע דבק הפטן. תייק את העובר עם מחט זכוכית על ידי ניקוב עדין של דופן הגוף וקריעה לאורך קו האמצע הגבי.בעזרת המחט, לחץ כלפי מטה על דופן הגוף כך שיידבק למגלשה. קרעו את המעי בקצוות הקדמיים והאחוריים שלו, והרימו את המעיים. מכיוון שמספר עוברים יהיו מתויקים באותה שקופית, כדאי להיות מדויקים מאוד עם הכיוון שלהם או לצייר את הכיוון שלהם.לאחר מכן, ניתן לקבע את העוברים קלות למשך 10 עד 15 דקות בפורמלדהיד 7.4% ב-PBS ולאחר מכן ארבע שטיפות ב-PBS תוך שימוש בזהירות רבה כדי להימנע מנגיעה בעוברים לפני השטח של התמיסה. כוחות מתח הפנים יהרסו אותם תחת מטרה של פי 10. מרכז את שדה הראייה על עובר מוכן, הגדל את ההגדלה ואתר את התא המעניין תחת אופטיקה DIC או תחת פלואורסצנטיות.אם תא המטרה מבטא GFP, ודא שדיאפרגמת השדה של המיקרוסקופ פתוחה רק לקצה שדה הראייה, ולא מעבר לתאורה צרה. קרן תסייע במיקום המיקרו פיפטה בחזרה למטרה של 10 x ותמקם את אלקטרודת האמבטיה עבור מגבר ה-DC לתוך התמיסה הרחק מהעובר ומנתיב המיקרו פיפטה. התקן את המיקרו פיפט ההזרקה המלא בתמיסת ליתיום כלוריד למחזיק והצמד אותו למניפולטור המיקרו.באמצעות בקרות הקורס מקם את המיקרופיפט מתחת למטרה והרבה מעל העובר. אם הזווית של המיקרו פפה תלולה מדי, הקצה לא ייכנס לפוקוס. אם הוא רדוד מדי, הפיר יתנגש בקיר האמבטיה במרכז הקצה בשדה הראייה.כעת הורד את המיקרו פיפטה והתמקד לסירוגין עד שהפיפטה נמצאת ב-PBS ולא רחוק מדי מעל העובר. כעת שנה למטרה בעוצמה גבוהה ומרכז את הפיפטה בתוך שדה הראייה. כאשר הפיר נמצא בפוקוס, הזז את המיקרו פיפטה בציר X עד שקצהו נמצא במרכז שדה הראייה.קצה המיקרו פיפטה צריך להיות הרבה מעל מפלס העובר. עבור לתאורת פלואורסצנטיות ובדוק את הקצה. בדוק אם יש דליפה של עין הצבע.כוונן את זרם ה-DC כך שגביש עין הצבע לא יצטבר בקצה. כעת הורד את המיקרו פיפט בציר Z לכיוון העובר. התאמת המיקוד בהדרגה כאשר העובר נכנס לפוקוס.עבור לשימוש בשליטה העדינה. מקדו את התא שיוזרק במרכז השדה ולאחר מכן התמקדו מחדש בקצה המיקרו-פיפטה. מנקודה זו ואילך, ייתכן שיהיה נוח יותר להשתמש בבקרת הבמה של המיקרוסקופ כדי להזיז את העובר ביחס למיקרו-פיפטה.הבא את קצה המיקרו פיפט למגע עם התא ועשה שקע על פני השטח שלו. העבירו מספר ננו אמפר של זרם דה-פולריזציה למשך מספר שניות. גביש קטן של עין צבע ייווצר על התא כדי לאשר שהתא סומן.פתח לזמן קצר את התריס כדי להאיר את השדה באור פלורסנט. אם גוף התא מראה סימני תיוג, הפעל זרם למשך מספר שניות נוספות. לאחר מכן כבה את הזרם ומשוך במהירות את העובר הרחק מהמיקרו פיפטה באמצעות פקדי הבמה.אם לא ניכר סימון עין D, ייתכן שהמיקרו פיפטה נסתמה ויש להחליפה. אם קצה הפיפטה נתקע ברקמות אחרות בשורש התא ומכתים את הרקמה הזו, נסה למשוך מעט את המיקרו פיפט ולהתקרב שוב לתא לפני שתפנה להחלפת המיקרו פיפטה לפי הצורך. המשך לתייג תאים אחרים באותו עובר או בעוברים אחרים באותה שקופית.הזז את הקצה לקצה שדה הראייה וחזור על ההליך. הסר את רוב התמיסה בתא ההזרקה. לאחר מכן תקן את העוברים על ידי הוספת 7.4% פורמלדהיד PBS למשך 10 דקות, ולאחר מכן ארבע שטיפות עם PBS.כעת ניתן להמיר את התכשיר או להרכיב אותו למיקרוסקופיה קונפוקלית באמצעות הפרוטוקול המתואר. נוירון בין מלא דאי הומר ללא רבב תחת אופטיקה של DIC. ההקשר המרחבי של התא המסומן בתוך הרקמה שמסביב הלא מסומנת נפתר היטב.לדוגמה, ניתן לראות את מיקומי גוף התא בתוך קליפת המוח ושל הקרנת הסיבים בתוך הגלולה הנוירולוגית בתכשיר זה. טיפת הצבע הייתה קצת גדולה מדי. מספר תאים שכנים סומנו בו זמנית, מה שמקשה על קישור הקרנות בודדות לגופי תאים נפרדים.שימו לב גם שתחת המיקרוסקופ הפלואורסצנטי, רזולוציית הרקע נמוכה בהרבה ללא המרת תמונה. ניתן גם להזריק בתכשיר זה תאים מרובים במקטעים סמוכים, נוגדן נגד שני כתמים מהירים של פאלס בגלולת הנוירו. למרות גופי התאים השקופים, התכשיר מראה תופעת לוואי אפשרית של תקופות המרת תמונות ממושכות.התאים המסומנים בעוצמה רבה יותר נוטים להיות מוכתמים ולהתחיל להתנפח בהשוואה לתיוג תא בודד באופטיקה קונפוקלית. תיוג עין צבע בעוברים הנושאים מבנים מדווחים של GFP יכול לספק הקשר מרחבי וזהות של התא המלא D בתוך אוכלוסיות ספציפיות של סוגי תאי עצב או גליה חיוביים GFP. לאחר צפייה בסרטון זה, אתם אמורים להבין היטב כיצד להכין ולבצע תיוג של נוירונים בודדים במערכת העצבים העוברית לאחר oph.אבל בזמן שאתה מנסה את ההליך הזה, אנא זכור שכל שלב הוא תובעני, אז צפה לכמה חזרות עד שכל ההליך יתנהל בצורה חלקה.

labeling-single-cells-central-nervous-system-drosophila

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

במאמר זה אנו מדגימים כיצד לנתח את מערכת העצבים המרכזית של הזחלים third תסיסנית instar.

Dissection של מערכת העצבים המרכזית הזחל ב תסיסנית melanogaster

אנו מתארים את הליך להכין...

ויזואליזציה של מערכת העצבים כולה עובריים-Mount תסיסנית עוברים

כדי להבין כיצד צורות תאים מורכבים, כגון דנדריטים עצביים, מושגות במהלך הפיתוח, חשוב להיות מסוגל הארגון במדויק microtubule assay. כאן אנו מתארים את שיטת תיוג חזקים immunohistological לבחון ארגון microtubule הדנדריטים של נוירון דנדריטים arborization חושית, קנה הנשימה, שריר,...

תיוג Immunohistological של microtubules ב דנדריטים Neuron חושי, Tracheae, והשרירים של תסיסנית גוף Larva הכותל

סרטון זה מדגים את הצביעה האימונופלואורסצנטית של מוח דרוזופילה טרנסגני להדמיה חד-תאית של תאי גליה. המוח מבטא חלבונים ממוקדי ממברנה המאוחים עם שילובים שונים של אפיטופים אנטיגניים תחת שליטת מערכת רקומבינאז ספציפית לגליה. המוחות המבודדים והקבועים מוכתמים בנוגדנים ראשוניים ספציפיים לאפיטופים האנטיגניים, ואחריהם נוגדנים משניים מצומדים פלואורופור. תיוג זה מאפשר הדמיה בו-זמנית של תת-אוכלוסיות שונות של תאי גליה על פני אזורי מוח שונים.

צביעה אימונופלואורסצנטית של מוחות דרוזופילה להדמיה חד-תאית של תאי גליה

מקור: Inal, M. A. et. al., מעקב לאחור אחר Drosophila נוירונים מוטוריים עובריים באמצעות צבעים פלואורסצנטיים ליפופיליים. J. Vis. Exp. (2020)סרטון זה מדגים את שיטת התיוג לאחור של נוירונים מוטוריים Drosophila באמצעות צבעים ליפופיליים. הצבע נכנס לאקסון, נע לאחור ומסמן את הנוירונים בירוק, מה שמאפשר הדמיה מפורטת של המורפולוגיה וההקרנות שלהם תחת מיקרוסקופ קונפוקלי.

תיוג רטרוגרדי של נוירונים מוטוריים של דרוזופילה באמצעות צבעים ליפופיליים פלואורסצנטיים

פרוטוקול זה מפרט שיטה יעילה המשמשת לביצוע הדמיה תא חי בהקשר של מוח זחל בשלמותה. גישות הדמיה תא חי הן לא יסולא בפז לחקר חלוקות תא גזע עצביים סימטריות כמו גם תהליכים עצביים והתפתחותיות אחרים, לחשוף באופן עקבי מנגנונים שהתעלמו בעבר.

הדמיה חיה של<em&gt; דרוזופילה</em&gt; הזחל Neuroblasts

פרוטוקול זה מתאר את הקרע של immunostaining של המבוגרים דרוזופילה melanogaster רקמות המוח. באופן ספציפי, פרוטוקול זה מדגיש את השימוש נוירונים הגוף, קולט אור פטריות דרוזופילה בתור דוגמה עצביים קבוצות משנה יכול לשמש באופן מדויק לחשוף את עקרונות כלליים שבבסיס היבטים רבים של ההתפתחות העצבית.

ניתוח Immunofluorescent מכתים של פטריות הגוף והנפש ומה קולט אור נוירונים במוח למבוגרים דרוזופילה melanogaster

התאים להציג מורפולוגיות שונות, ליצור מגוון רחב של אינטראקציות עם שכניהם. פרוטוקול זה מתאר איך לחשוף את המורפולוגיה של תאים בודדים כדי לחקור את תא-תא אינטראקציה באמצעות מערכת ביטוי Gal4/UAS ומבוססת.

יישום טכניקת FlpOut ססגוניות ללמוד ברזולוציה גבוהה תא בודד מורפולוגיות ו תא אינטראקציות של עכשיו, דונלד ב דרוזופילה

פרוטוקול זה מתאר שיטה כדי להקליט את הפעילות החשמלית יורד של מערכת העצבים המרכזית דרוזופילה melanogaster כדי לאפשר את עלות-יעיל ונוח בדיקה של סוכנים תרופתי, מוטציות גנטיות של חלבונים עצבית, ו/או את התפקיד של מסלולים פיזיולוגיים נחקרו.

הקלטה אלקטרופיזיולוגיות של פעילות מערכת העצבים המרכזית השלישית-לחלל דרוזופילה Melanogaster

ניתוח מחזור התא עם תיוג 5-אתניל-2'-deoxyuridine (EdU) ו פוספו-histone H3 (pH3) הוא הליך רב-שלבי שעשוי לדרוש אופטימיזציה נרחבת. כאן, אנו מציגים פרוטוקול מפורט המתאר את כל השלבים עבור הליך זה כולל ניתוח תמונה וכימות כדי להבחין בין תאים בשלבי מחזור תאים שונים.

5-אתניל-2'-Deoxyuridine/Phospho-Histone H3 פרוטוקול תיוג כפול לניתוח התקדמות מחזור התא בתאי גזע עצביים Drosophila

מאמר זה מתאר פרוטוקול יעיל לפירוק דיסק דמיוני וצביעת נוגדנים, שהוא חסכוני עם מגיבים ומקל על טיפול בדיסקים דמיוניים במספרים קטנים.

כריתה בקנה מידה קטן וצביעת נוגדנים של דיסקים דמיוניים באנטנות העיניים והכנף מ-Drosophila melanogaster

למדו שיטה לתיוג תאים עצביים בודדים במערכת העצבים המרכזית של Drosophila melanogaster באמצעות צבע ליפופילי ומיקרוסקופיית קונפוקל. השיטה מאפשרת ניתוח מורפולוגיה עצבית בהקשר של ביטוי GFP.

תיוג של תאים בודדים במערכת העצבים המרכזית של

גלה סרטונים נוספים