解剖大脳皮質植で使用するための齧歯類の胚から脳脊髄液の分離

次の実験の全体的な目標は、胚性CSFの分泌シグナルが大脳皮質の発達に果たす役割を観察することです。これは、まず胚性CSFを分離して培地として使用することで達成されます。次のステップでは、発達中の大脳皮質壁を解剖し、ポリカーボネート膜上に配置し、CSF上に浮かべます。

その結果、免疫染色による外植片の解析に基づき、胚性CSFが発生中の大脳皮質に有益なシグナルを送っていることが示された。この方法は、CSFフィールドの主要な質問に答えるのに役立ちます。例えば、CSFの構成要素は何か、さまざまな発生時点での機能は何か、そして願わくば、いつの日か神経変性疾患の治療手段としてどのように使用されるかを決定するのに役立つことを願っています。

CSFが汚染されずに収集され、皮質のexplanへの損傷が最小限に抑えられることが重要です。これらの手順は、非常に細かい解剖ツールで小さな組織を操作する必要があるため、かなりの練習が必要になる場合があります。マイクロピペット針を準備することから始めます。

例えば、オリカPC 10縦型マイクロピペットプーラーでは、次の設定で10〜20マイクロリットルのマイクロキャピラリーピペットを引っ張り、ワンステッププルヒーター番号2を58に設定し、100グラムのプルウェイトを設定します。マイクロピペットの細い先端を細い番号55の鉗子でスナップします。得られた針の平均内径は85マイクロメートルになります。

次に、アスピレーターアセンブリを準備します。CSF吸引には、マイクロキャピラリーピペットに付属のマイクロプランジャーをキャピラリーニードルに挿入します。または、マイクロキャピラリーピペットに接続されているアスピレーターチューブアセンブリの端にプラスチック製の使い捨てフィルターを取り付けます。

次に、アスピレーターアセンブリの反対側の端で、針をガスケットに通して所定の位置に押し込みます。次に、単離されたマウスまたはラットの胚を、シルガードで調製したマイクロダイセクションディッシュに移します。滅菌HBSSで胚を洗浄し、吸引と吸収紙のパディングによって胚を取り巻く液体を取り除きます。

解剖顕微鏡で胚を視覚化します。これがマウスの胚である場合、それは矢状図を提供して、その側に横たわっているべきです。次に、マイクロキャピラリーピペットを側脳室または橈側脳室、中頭脳室、またはCI胸骨にしっかりと挿入します。

マグナは神経上皮細胞に接触しないように試みています。ピペットを挿入したら、組織が穿刺されるまで針を挿入するだけです。次に、マイクロプランジャーまたは口内吸引によって生じる穏やかな陰圧を使用して、CSFをピペットに慎重に穏やかに吸引し始めます。

CSFは、ゆっくりと制御された方法でマイクロキャピラリーピペットに穏やかに流れ始めるはずです。収集が完了するまで、負圧をかけ続けます。コレクションが透明で透明な流体を生成することが重要です。

溶液に赤や黄色などの血液による汚染の証拠がある場合は、マウスとラットの両方の胚のコレクションを廃棄します。E 16.5からE 17の段階では、マイクロキャピラリーピペットが配置されている場所で、心室がわずかに崩壊する様子を観察することができます。このイベントでCSFの流れは停止します 流れが終了すると、マイクロキャピラリーピペットを静かに取り外します。

次に、収集したCSFサンプルを、E 14.5マウスリターから氷で冷やしたマイクロ遠心チューブに静かに排出します。すべての収集が完了したら、10〜15マイクロリットルのCSFを収集することが期待されます。チューブを10, 000G、摂氏4度で10分間遠心分離します。

汚染細胞を除去するには、透明なCSFを新しいチューブに移します。汚染物質の顕微鏡検査は、純粋であると判断された場合に実施できるようになりました。サンプルは、分析に使用したり、他のサンプルと一緒にプールしたり、液体窒素でスナップ凍結して摂氏マイナス80度で保存したりして、CSFを添加した培地での実験のために皮質外植片を収集することができます。

葉巻でコーティングされた皿で、E 14.5胚の皮質を露出させます。発達中の頭蓋骨でデュロを取り除きますが、メスを使用して皮質に付着したピアとくも膜を残します。中矢状面の正中線に沿って脳を二等分し、左右の皮質半球を分離します。

各皮質半球を別々に準備します。半球の内側を上にして置き、神経節の差し迫りと発達中の皮質が見えるようにします。メスを使用して、皮質神経上皮コドルを通じて発育中の嗅球まで冠状切開を行います。

この切開は、外側および内側の神経節隆起の前方境界から始まり、発達中の皮質原始の前帯状領域を通って伸びる必要があります。外側神経節隆起の後方境界にちょうど甘やかされた別の冠状切開を行います。この切開は、神経節隆起の横方向の境界から発達中の皮質原始の内側壁まで伸びている必要があります。

メスを使って、2つの切開によって作られた皮質フラップを引っ込めます。これにより、皮質を損傷するリスクが制限されます。次に、内側頭蓋の発達中の海馬と皮質の裾を解剖します。

これは、外側の皮質表面が半球間壁と出会う新皮質の頂点から行います。次に、外側神経節隆起を発達中の皮質から分離する境界に沿って横切開を行います。プレートから余分な解剖された組織をすべて取り除きます。

解剖された皮質は、髄膜側を下に向けて準備されます。皮質を移すには、バンズを使用してガラスピペットに接続されたプラチナワイヤーループを準備し、バーナーでピペットの端をプラチナワイヤーに溶かします。組み立てたら、プラチナワイヤーループを滅菌して冷まします。

X explanの周りから余分なメディアを穏やかな吸引で取り除きます。ワイヤーループで使用するための少量の溶液を残します。次に、直径4cmのイメージングディッシュに1cmのポリカーボネートメンブレンを置きます。

次に、プラチナワイヤーループの側面を使用して、髄膜側が上を向くように皮質をゆっくりと反転させます。次に、X explanをループの中央に置き、固有の静水圧を使用して、皮質X explanを皿から持ち上げます。次に、エクスプランをポリカーボネートメンブレンにそっと置き、プラチナワイヤーループを持ち上げて離します。

次に、ピペットに50マイクロリットルのCSFまたは他の媒体をロードします。メンブレンをそっと持ち上げて、下の媒体を検出します。こんにちは、イメージング皿を覆います。

加湿した二次容器に入れ、摂氏37度で5%の二酸化炭素と24時間インキュベートします。継続的な増殖とexplanの成長をサポートするために、さまざまな胚年齢のマウスとラットの両方について、平均同腹仔サイズからのCSF収集量が計算されています。純粋なCSFサンプルが収集された場合、数マイクログラムの銀染色など、さまざまな手法を使用してCSFを分析できます。

このCSFはE 14.5マウスに由来します。100%CSFで増殖した24時間齢の外植片は、免疫染色で示されるのと同じ在胎週数でげっ歯類の胚と同様の組織組織型を持っています。 pH 3。

細胞分裂のマーカーは、心室表面に沿って発現します。DNA合成のB-R-D-U-Aマーカーも、心室ゾーンに沿った取り込みを示しています。そして、発達中の皮質板にはニューロンマーカーが発現しています。

これらの手順を試みる前に、私たちが示した技術に関する機関の方針を確認することが重要です。この技術は、研究者がin vitroでの発生中の大脳皮質の役割を指示する際に、CSF内の分泌シグナルを研究する道を開きました。