Name: In vivo Neuronale Calcium Imaging in C. elegans (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-04-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 6 s
Description: Lernen Sie die Messung neuronaler Calciumdynamik in C. elegans mittels genetisch kodierter Fluorophore. Diese Methode ermöglicht die Analyse neuronaler Aktivität und zellulärer Reaktionen auf Schäden in vivo.

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Mehrere Personen trugen zu der Arbeit in diesem Papier beschrieben. CVG baute den Versuchsaufbau und LS, SHC und CVG führten die Experimente. CVG und SHC schrieb das Manuskript. Alle Autoren anschließend nahmen an der Überarbeitung und genehmigt die endgültige Kopie des Manuskripts. Wir danken Paul Sternberg für die GCaMP Belastung. Einige Nematoden Stämme in dieser Arbeit verwendet wurden vom Caenorhabditis Genetics Center (CGC), die durch die NIH National Center for Research Resources (NCRR) finanziert ist. Die MATLAB Bildanalyse-Programm wurde von dem in 18 abgestimmt sind. Die Autoren wurden von der Boston University und dem Massachusetts Life Sciences Center unterstützt.

Ein. Optischer Aufbau <ol><li> Verwenden Sie eine Standard-Verbindung Mikroskop mit Epifluoreszenz Imaging-Funktionen. Wir verwenden eine Nikon Eclipse Ti-U inverse Mikroskop mit einem Intensilight HG Illuminator. </li><li> Für optimale Bild-und Signal-Qualität mit einem hohen Vergrößerung, mit hoher numerischer Apertur Ziel. Wir verwenden in der Regel eine Nikon X60 1,4 NA Ölimmersionsobjektiv. In einigen Fällen ist es möglich, geringere Vergrößerung verwenden (X40, X20), je nach Expressionsniveau des Fluorophors und Signalstärke. </li><li> Verwenden eine hohe Empfindlichkeit gekühlte CCD-Kamera, wie beispielsweise eine Kamera, um Andor Clara Bildempfindlichkeit maximieren und Hintergrundrauschen. </li><li> Für einfarbige Fluorophore die Standard-Mikroskop-Fluoreszenz-Filter gesetzt konzipiert für die jeweilige Wellenlänge des Fluorophors. Für GCaMP verwenden eine Standard-GFP Filter gesetzt optimiert für Anregung bei 488 nm und Emission bei 525 nm. Keine weiteren optischen Modifikationen erforderlich sind. </li><li&gt; Für ratiometrisch Fluorophore, wie cameleon, verwenden Sie ein Dual Imaging System, so dass identische Bilder können gleichzeitig an zwei verschiedenen Wellenlängen erfasst werden. Dies wird durch Projizieren der dualen Bildern Seite an Seite auf die Kamera erreicht. Ein einfaches Setup, dies zu erreichen, mit einfachen optischen Komponenten auf einer optischen Qualität Steckbrett, ist in Abbildung 1 dargestellt. Es besteht aus: <ol class="ualpha"><li> Ein Mikroskop Filter mit 440 ± 20 nm Anregungsfilter und 455 nm eingestellt langen Pass dichroitischen Spiegel. </li><li> Ein Bild Maske an der ersten Bildebene unmittelbar außerhalb des Mikroskopabbildanordnung Hafens (wo die Kamera CCD-Sensor würde in der Regel sitzen) platziert. Dies schränkt das Sichtfeld derart, dass sie nur die Hälfte des Kamerasensors füllen. Anordnen diese Maske an der ersten Bildebene führt scharfes Bild Grenzen und ohne Überlappung, wenn die zwei Bildern Seite an Seite projiziert werden. </li><li> Das erste Relais Objektiv eingestellt einer Brennweite von ter erste Bildebene derart, daß sie das Licht kollimiert. </li><li> Ein dichroitischer Spiegel, der das Licht teilt sich in die beiden separaten bildgebenden Wellenlängen oder Kanälen Reflektieren einer Farbe (&gt; 515 nm, gelb) während der Übertragung des anderen (&lt;515 nm, cyan). </li><li> Emissionsfilter (Bandpassfilter) weiteren Einschränkung des übertragenen Lichts auf die spezifischen Wellenlängen Bildgebung (Cyan bei 485 ± 40 nm und gelb bei 535 ± 30 nm), </li><li> Die zweiten Relaislinsen (eine für jeden Kanal) in den Strahlengängen, daß sie das Licht refokussiert einer zweiten Bildebene an der CCD-Kamera angeordnet. </li><li> Ein Paar von Spiegeln und einen zweiten dichroitischen Spiegel lenkt die Strahlengänge derart, dass die zwei Bilder projiziert werden rekombiniert und Seite-an-Seite auf die Kamera CCD-Sensor. 4A zeigt ein Beispiel des resultierenden Bildes. </li></ol></li><li> Initial Optische Ausrichtung: Initiieren Setup und Ausrichtung der Optik mit einem hohen Kontrast image mit einem niedrigen Vergrößerungslinse und übertragen Weitfeld-Licht-Beleuchtungssystem (ein schwarzer sharpie auf einem Objektträger gezogen gut funktioniert). Bringen des Bildes, um durch die Okulare Mikroskop konzentrieren und dann an das Mikroskop zu verwendenden Port geschaltet. Mit hoher Beleuchtung sehen Sie das Bild auf eine Karteikarte in der Anfangsphase Brennebene (wenige cm außerhalb des Mikroskops Port). Platzieren des ersten Relais-Linse (C) im Strahlengang, so daß es zu einem fokalen Abstand von dem ersten Brennebene liegt und kollimiert das Licht zwar nicht Ablenken des Strahlengangs (dh direkt im Strahlengang zentriert). Legen der Maske auf der ersten Brennebene, eingestellt auf die Hälfte des Sichtfeldes zu beschränken und erzeugen eine scharfe Grenze in dem Bild. Positionieren der Spiegel und Filter (D, E, G) derart, daß der Strahlengang parallel zur Tischoberfläche bleibt und läuft in zwei parallelen Bahnen Seite an Seite, wie in 1B gezeigt. Zentrieren der zweiten Relais-Linsen (F) in ihrer jeweiligen Strahlengänge undbewegt sie hin und her entlang der Wege, um die Bilder zu einem Fokus auf eine Karteikarte platziert waren die Kamera CCD-Sensor wird zu bringen. Wenn es richtig gemacht die beiden Bilder sollten parfokal mit dem Mikroskop Okulare und andere Kamera-Ports. Schließlich stellen Sie die Kamera in Position und Feinabstimmung der Ausrichtung. </li><li> Fine Tuning Optische Ausrichtung: Verwenden Sie den Dual-Bild durch die CCD-Kamera betrachtet die Feineinstellung der optischen Ausrichtung. Verwenden eines Bild mit hohem Kontrast und beginnen mit geringer Vergrößerung, die Umstellung auf eine stärkere Vergrößerung zur endgültigen Ausrichtung. Positionieren Sie die übertragene Bild (cyan Kanal in Abbildung 1B) auf die Hälfte der Kamera Sichtfeld durch Bewegen der Kamera in X und Y. Position das reflektierte Bild (gelber Kanal in Abbildung 1B), die andere Hälfte des Feldes cover cover anzuzeigen, indem die beiden letzten Spiegel (G) in seinem Strahlengang. Optimieren, indem das zweite Relais-Linse für jeden Kanal vor und zurück entlang dem Strahlengang zu konzentrieren. Bleibtunverändert der optische Aufbau sollte stabil und erfordern nur selten eine Feinabstimmung Einstellung. </li></ol> 2. Probenvorbereitung und Datenkommunikation. <ol><li> Erwerben Tieren Ausdruck einer Kalzium-sensitives Fluorophor im Neuron von Zinsen aus dem Caenorhabditis Genetics Center (CGC) oder anderen Quellen. Alternativ können transgene Tiere hergestellt werden unter Verwendung von Standard C. elegans Techniken. Einzelzelle Expression ist nicht erforderlich (und manchmal auch nicht wünschenswert, wenn mehrere Neuronen untersucht werden sollen, siehe 12), solange Bilder und Messungen von mehreren Zellen können leicht abgetrennt werden. Wenn das Fluorophor Transgen nicht in das Genom integriert ist, können erhebliche Unterschiede in der Expression von Tier zu Tier auftreten. In diesem Fall Vorauswählen Tiere mit höheren Expressionsniveaus unter Verwendung eines fluoreszierenden Präpariermikroskop erhöht das Signal-Rausch-Verhältnis verbessert und die Messungen. Fluorophor Expression need ausreichend sein, um ohne weiteres mit der Kamera unter den Erfassungsparameter durch das Experiment erforderlich abgebildet. </li><li> Nehmen Sie die Agarose-Pads für die gewünschte Immobilisierung Technik (siehe Abschnitt 2.3), indem Sie einen kleinen Tropfen geschmolzenen Agarose zwischen zwei Glasplatten durch zwei Stücke von Labor-Band Abstand erforderlich. Falls erforderlich, kann Agarose Pads einem Deckglas vor der Montage die Tiere übertragen werden. Siehe Abbildung 2. </li><li> Immobilisieren C. elegans zur Bildgebung unter Verwendung einer der folgenden Techniken: <ol class="ualpha"><li> Pharmakologische Erstarrung: In 0,05% Levamisole bis 2% Agarose-Pads (Mischen in das geschmolzene Agarose, bevor Sie die Pads in 2,2). Wählen 5-10 Tiere auf dem Pad und decken mit einem Deckglas. Anwenden geringe Mengen von heißem Wachs-Gemisch (50% Paraffinwachs und 50% Vaseline) zu den Ecken des Deckglases zu in Position halten. Lassen 5-10 min für die Levamisol zur Wirkung und die Tiere b nehmenecome komplett still. </li><li> Stiff Agarose Immobilisierung: C. elegans kann physikalisch immobilisiert werden mit steifen 10% igen Pads und 0,05 Mikrometer Durchmesser Polystyrol-Nanopartikeln. Machen Sie 10% igen Pads (10% Agarose in NGM-Puffer nach Gewicht) wie in 2.2. Hinzufügen ~ 3 ul Bead-Lösung (1:10 Polystyrol Mikrokügelchen in NGM Vol.) an die Oberseite des Pads. Schnell, holen 5-10 C. elegans in den Pool der Bead-Lösung auf dem Pad und vorsichtig mit einem Deckglas abdecken. Verwenden geschmolzenes Wachs aufgebracht zu den Ecken des Deckglases um in Position halten. (Für weitere Details zu dieser Technik finden Sie 7 sowie einer früheren JoVE Artikel 8) </li><li> Kleben: C. elegans kann anstelle mit geringen Mengen an veterinärmedizinischen Gradkleber die auf eine Seite des Tieres verklebt werden. </li><li> Mikrofluidiksysteme: Zahlreiche Mikrofluidik-Geräte wurden entwickelt, um physisch zu halten C. elegans an Ort und Stelle für die Bildgebung. </li></ol> &lt;/ Li&gt; <li> Legen Sie die vorbereitete Folie auf dem Mikroskop und konzentrieren sich auf die gewünschte Neurons. Es ist oft am einfachsten, die C. finden elegans mit Hellfeldbeleuchtung und geringe Vergrößerung. Dann Wechsel zu hoher Vergrößerung und Fluoreszenz-Imaging zu finden und sich auf die spezifischen Neurons. </li><li> Stimulus: Wenn eine neuronale Antwort auf einen bestimmten Stimulus erwünscht ist (Licht, elektrischem Feld, Geschmacks-und Geruchssinn, Temperatur etc.), muß die Vorrichtung in den Stimulus Mikroskopaufbau, so daß es den Tieren kann die verabreichte ausgebildet sein Probenvorbereitung, während Bildgebung. </li><li> Erwerben Sie Bilder mit dem Mikroskop CCD-Kamera. Belichtungszeiten und Anregungslicht Ebene auf der Grundlinie Signal und Expressionsniveau des Fluorophors ab, wobei schwächere Signale erfordern längere Belichtungszeiten mit konkordant weniger Zeitauflösung. Wir verwenden in der Regel ~ 300 msec Belichtungszeiten. </li><li> Bilder aufzunehmen, entweder einzeln oder als time-Videovorlauf. Weil C. elegans Neuronen in der Regel angezeigt langsame Aktivierung Dynamik (dh es fehlt Natrium-basierte Aktionspotentiale), sind relativ langsam Bildraten von ~ 1 sec reicht oft zu Neuron Dynamik zu messen. Abtastraten bis zu ~ 90 Frames pro Sekunde verwendet wurden, obwohl diese durch die Integration notwendige Zeit für schwache Fluoreszenz begrenzt werden kann. Einzelne Filme eines einzelnen Neurons kann leicht für mehrere Minuten (~ 5-10 min) oder mehr erstrecken, wenn die Immobilisierung Zubereitung ist stabil und die Bildrate relativ langsam. </li></ol> 3. Data Analysis <ol><li> Es gibt eine Reihe von verschiedenen Fluoreszenz-Imaging-Software-Pakete mit dynamischen und ratiometrische Analyse-Funktionen einschließlich ImageJ und NIS-Elements. Wir verwenden ein einfaches Programm, das individuelle MATLAB die durchschnittliche Fluoreszenzsignal über einen ausgewählten Bereich von Interesse misst. </li><li> Für einzelne Bilder (oder Zeitraffer-Filme, die bleibenabsolut still) Auswählen einer interessierenden Region (ROI) innerhalb des abgebildeten Neuron und einem separaten Nähe Region für die Hintergrundmessung. Für ratiometrisch Bilder auszuwählen ähnlichen ROI und Hintergrund Regionen für jedes der zwei Bilder. </li><li> Leichte Bewegung des abgebildeten Neuronen innerhalb einer Zeitraffer-Film erfordert eine zusätzliche Analyse, um automatisch die ROI in jedem Frame, die unter Verwendung von zahlreichen Objektverfolgung Systeme werden können. Unser Programm zeigt ein komprimiertes Bild aller Bilder in dem Film, von dem eine grobe Grenze (umfasst das Objekt des Interesses in allen Frames) manuell ausgewählt wird und eine unabhängige Hintergrund Region ausgewählt. Für den ersten Rahmen, wird ein ROI manuell aus dem Grenzbereich ausgewählt. Für jeden nachfolgenden Rahmen, wählt das Programm den hellsten Pixel innerhalb des Randbereiches einen ROI von der richtigen Größe (dh die gleiche Anzahl von Pixeln wie die manuelle ersten Rahmen ROI) zu erzeugen. Bei Bildern, wo die Zielet der Interessen ausreichend heller als die umgebenden Hintergrund im Randbereich dieses Protokoll wählt einen vernünftigen ROI für jeden Frame. </li><li> Das Fluoreszenzsignal, F, für jeden Rahmen wird als die durchschnittliche Pixelintensität in dem ROI minus der mittleren Intensität in dem Hintergrundbereich berechnet. Ratiometrische Werte als das Verhältnis der beiden Signale (YFP-YFP Hintergrund) / (GFP GFP-Hintergrund) -0,65 berechnet. Der Faktor von 0,65 kompensiert Durchscheinen des GFP YFP Kanal in den Kanal, die abhängig von den Fluorophoren sowie insbesondere Filtersatz verwendet werden (dieser Wert typischerweise ~ 0,6 für cameleon Setups) sein wird. </li><li> Die relative Calciumspiegel für jeden Rahmen wird als die prozentuale Änderung in der Intensität zu einer anfänglichen normalisierten Ausgangswert von dem ersten Rahmen (oder eine Serie von Frames) gemessen wird, berechnet: &amp;Dgr; F / F = (F (t)-F o) / F o, wobei F (t) ist die Fluoreszenz zum Zeitpunkt t und F oist die erste Ausgangswert. </li><li> Ein Auswählen des ROI Zellkörper erzeugt die stärksten Signale robustesten aber es ist auch möglich, auszuwählen und zu messen Signale von einem ROI entlang der Nervenprozesse. </li></ol> 4. Problemlösung <ol><li> Bleaching: Exposition gegenüber Anregungslicht kann Bleichen des Fluorophors und wird von einer stetigen Abnahme des Signals, die abhängig von Exposition ist markiert. Ratiometrische Messungen helfen, dies zu kompensieren. Allerdings selektive Bleichen von einer Wellenlänge können immer noch auftreten (typischerweise CFP Bleichmittel schneller als YFP). Wenn Bleichmittel reduzieren Lichtexpositions-Niveau durch Reduzieren Belichtungszeiten und / oder Anregungsintensität (mit Neutralfilter im Beleuchtungs-Weg) auftritt. Falls erforderlich, kann ein zum Bleichen indem Schauprozesse (mit der gleichen Anregung Exposition aber keine neuronalen Reiz) und Quantifizierung der Zeitkonstante Signalabfall kompensieren. </li><li><strong&gt; Immobilisierung: Für die einfache Bildanalyse hier beschriebenen ist es wichtig, das Tier bleibt relativ ruhig in der gesamten Aufzeichnungsdauer C.. elegans der Belichtung und experimentelle Reize reagieren, so dass sie am wahrscheinlichsten zum Zeitpunkt der Aufnahme zu bewegen. Leichte Bewegung kann erhebliche Rauschen in der Messung führen vor allem bei der Messung von Axon Prozesse. Ratiometrische Analyse hilft, diese Folgen zu einem gewissen Grad und Messungen vom Zellkörper sind robuster zu mildern. Sorgfältige Ausführung und Verfeinerung der Immobilisierung Verfahren werden in ganz still Tieren führen. </li><li> Hintergrundauswahl: Eine sorgfältige Auswahl eines Hintergrundes Region ist für erfolgreiche Bildanalyse. Hintergrund Regionen sollten einigermaßen einheitliche und dunkler als das abgebildete Neuron. Es muss ausreichend entfernt werden, um Streulicht (und somit ein Signal Pickup) aus dem abgebildeten Neuron vermeiden. Wir finden eine einheitliche Region 20-50 um aus dem ROI funktioniert in den meisten Fällen. </li><li> Ratiometric Optik: Die korrekte Ausrichtung der Abbildungsoptik ist entscheidend für die Erzeugung eine klare duale Bild. Kommerzielle Mikroskop Anhänge für ratiometrische Bildgebung zur Verfügung. Eine alternative Technik ist es, eine schnelle sequentielle Bildgebung unter Verwendung einer schnellen Filterrad rasch zwischen Emissionswellenlängen zu schalten, während der Aufnahme getrennten Bildern für jeden einzusetzen. </li><li> Ratiometrische Analyse: Die hier beschriebene Analyse ist eine relativ einfache Technik, robuste Signale generiert durch Mittelung über eine ROI. Es erfordert eine erkennbar helles Objekt, um den ROI zu wählen. Weitere anspruchsvolle ratiometrische Analyse ist durch präzise Ausrichten und Kartierung der dualen Bildern, so dass das fluoreszierende Verhältnis Pixel kann durch Pixel berechnet werden kann. </li></ol>

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</ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen haben.

Genetisch kodierte Kalzium-Indikatoren wurden weitgehend in C genutzt elegans Neurobiologie. Zahlreiche Gruppen haben diese Techniken verwendet werden, um Reaktion der primären sensorischen Neuronen auf äußere Reize zu studieren, wie hier mit dem ASJ Reaktion auf ein elektrisches Feld demonstriert. Prominente Beispiele umfassen Empfindung mechanische Berührung, bestimmte Chemikalien, die Temperatur und ein elektrisches Feld 12, 16-19. Aktivität von Interneuronen und Muskelzellen haben auch b...

Hier präsentieren wir Ihnen praktische Methoden zur in vivo Calcium Imaging in C. elegans Neuronen. Die Entwicklung von genetisch kodierte Calcium-sensitiven Fluorophore mit hohem Signal-Rausch-Verhältnis macht C. elegans eine vergleichsweise einfache und kostengünstige System zur Messung von neurophysiologischen und Aktivität. Unsere Bildgebung ist mit einem Standardsubstanzsampler Mikroskop unter Verwendung Weitfeld-Fluoreszenzabbildung allgemein verfügbarer Fluorophore getan. Wir präsentieren verschiedene Techniken unter Verwendung verschiedener Fluorophore und verschiedenen Probenvorbereitung, diskutieren die Stärken und Schwächen der einzelnen. Daten werden dann aus zwei Experimenten Beispiel vorgestellt. Eine ausgezeichnete zusätzliche Ressource auf den hier beschriebenen Techniken können in WormBook, &quot;Imaging die Aktivität der Nervenzellen und Muskeln&quot; von R. Kerr, (gefunden werden <a href="http://www.wormbook.org" target="_blank">http://www.wormbook.org</a> ) 3. Zwei Hauptklassen von gentechnischtisch kodierte fluoreszierende Kalzium-Reporter sind häufig in C eingesetzt elegans: Einkanal GCaMP und FRET-basierten cameleon. Wir beschreiben Methoden und zeigen Beispiele für Daten, die von jedem erzeugt. GCaMP basiert auf einer modifizierten Green Fluorescent Protein (GFP), die empfindlich auf die umgebende Calciumkonzentration basiert. Dies wird durch Fusion von GFP und dem hohen Calcium-Calmodulin Protein Affinität, so dass die Bindung von Calcium durch Calmodulin das GFP-Molekül bringt in einen effizienten fluoreszierenden Bestätigung 2 bewerkstelligt. Die jüngsten Fortschritte in dieser Fluorophore erzeugen außergewöhnlich gutes Signal Größe mit bis zu 500% Anstieg der Fluoreszenzintensität über einen physiologischen Bereich von Kalzium und einigermaßen schnell Kinetik ~ 95 ms Anstiegszeit und ~ 650 ms Abklingzeit 4. Über relativ kurze Zeiträume (Minuten), können diese großen Signale für niedrigere Auflösung Bildgebung ermöglichen (untere Vergrößerung) und bei einem wohlerzogenen initial Baseline-Messung, negieren die Notwendigkeit ständiger Grundlinie oder Vergleichsmessungen. Cameleon hat den Vorteil, eine FRET-Fluorophor, das eine Quotientenmeßschaltung Vergleichens zwei unabhängige Kanäle oder Wellenlängen 1 erzeugt. Es besteht aus zwei separaten Fluorophore (Cyan-und Gelb-emittierende fluoreszierende Proteine, CFP und YFP) durch eine Calmodulin Protein verknüpft ist. Der Komplex wird mit blauem Licht (440 nm), die die GFP regt beleuchtet. Bindung von Calcium bringt die Fluorophore näher zusammen, wodurch Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer (FRET) von dem GFP (Donor) zum YFP (Akzeptor) und Veranlassen des GFP-Emission (480 nm) zu verringern und das YFP-Emission (535 nm) bis zu erhöhen . Relative Kalziumspiegel werden als das Verhältnis des YFP / GFP Intensität gemessen. Cameleon Kinetik langsamer als die GCaMP, in vivo gemessen werden, um eine Anstiegszeit von ~ 1 sec und eine Abfallzeit von ~ 3 sec 5 haben. Jedochdas Verhältnis der gegenläufigen Signale erhöht die Signalgröße und kompensiert einer Anzahl möglicher Artefakte aufgrund veränderter Fluorophorkonzentration, Bewegung oder Fokusdrift und Bleichen. Genetisch codierte fluoreszierende Reporter zu negieren viel von der Probenvorbereitung mit exogen verabreichtem Sonden und C geforderten elegans kleinen transparenten Körper ermöglicht die Abbildung innerhalb des intakten Tier mit einfachen weites Feld Fluoreszenz. Die wichtigste technische Herausforderung in der Probenvorbereitung ist daher sicher fixieren die Tiere. Es gibt eine Anzahl von unterschiedlichen häufigsten verwendeten Techniken mit jeweils Vorteile und Nachteile. Verwendung eines pharmakologischen Agens, um die Tiere zu lähmen ist einfach zu implementieren und ermöglicht die Montage mehrerer Tiere an einer Zubereitung (Levamisol, ein cholinerger Agonist, Muskelgewebe führt zu ergreifen ist typischerweise 6 verwendet). C. elegans kann auch physisch durch die Montage ihnen immobilisiert werdenauf steifen 10% igen 7, 8. Dies minimiert Auswirkungen auf die Physiologie von Tieren, ermöglicht langfristige Bildgebung (Stunden) und Rückgewinnung von mehreren Tieren ist aber technisch schwierig. Beide Techniken den physischen Zugriff auf die Tiere (die unter einem Deckglas) und kann daher nur mit bestimmten experimentellen Stimuli (wie Licht, Temperatur, elektrisches Feld oder Laser-Schaden) verwendet werden. Für Impulse in der physischer Zugriff erforderlich ist, wie Touch-oder die Verabreichung von Chemikalien, haben viele Studien erfolgreich C. geklebt elegans in Ort (mit Veterinär-Grade-Kleber) 9. Dies ist technisch anspruchsvoller, ist nur ein einziges Tier Vorbereitung und erlaubt keine tierischen Erholung. Schließlich haben zahlreiche mikrofluidischen Bauteilen eingesetzt, dass körperlich zurückzuhalten C. elegans, kann die Erhaltung Tierphysiologie, so dass die Exposition gegenüber den meisten Arten von Stimuli (je nach Geräteausführung) und ermöglichen einen schnellen Austausch und Erholung der Tiere <sup&gt; 10, 11. Allerdings Mikrofluidik erfordern zusätzliche technische Kenntnisse und Fähigkeiten in Design, Herstellung und Implementierung. In immobilisierten Tieren Aktivität und Stimulus-Antwort kann in der Regel in den sensorischen und Interneuronen gemessen werden. Aktivität von Motoneuronen erfordert ausgefeiltere Techniken zur Bildgebung in bewegenden Tieren. Hier präsentieren wir Ihnen detaillierte Methoden unter Verwendung der beiden am einfachsten Techniken der pharmakologischen Lähmung und Immobilisierung mit steifen Agarose. Die hier vorgestellten Methoden können verwendet werden, um neuronale Aktivität und Zellphysiologie in C messen elegans. Wir geben jeweils ein Beispiel: Verwendung GCaMP die sensorische Reaktion des ASJ Neuron zu einem äußeren elektrischen Feld zu messen, und Verwenden cameleon die physiologische Reaktion auf Calcium Laserschaden eines Neurons zu messen. Diese Beispiele zeigen die Vorteile und Nachteile der beiden Arten von Fluorophoren und zeigen, was möglich ist mit dem System.

<table><tbody><tr><td>Eclipse Ti-U invers Mikroskop</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Intensilight HG Illuminator</td><td>Nikon</td><td>C-HGFI</td><td>Leuchtstoffröhre</td></tr><tr><td>CFI Plan Apo VC 60X Öl</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Optischer Tisch oder 3'X3" optisches Breadboard</td><td>Thor Labs</td><td></td><td>Wenn kein optischer Tisch verwendet wird, sollte ein optisches Steckbrett auf einem soliden Labortisch ausreichen .</td></tr><tr><td>Clara Interline Kamera</td><td>Andor Technologie</td><td></td><td>Hochempfindliche CCD-Kamera</td></tr><tr><td>wtGFP Longpass Emission</td><td>Chroma Technology Corp.</td><td>41015</td><td>GFP Filterset für die Bildgebung GCaMP</td></tr><tr><td>Filter 440 +/- 10 nm</td><td>Chroma</td><td>D440/20x EX</td><td>Anregungsfilter für Kameleon</td></tr><tr><td>Dichroitischer Spiegel > 455 nm Langpass</td><td>Chroma</td><td>455DCLP BS</td><td>Mikroskop dichroitisch für Cameleon Bildgebung</td></tr><tr><td>Dichroitischer Spiegel > 515 nm Langpass</td><td>Chroma</td><td>515DCLP BS</td><td>dichroitischer Spiegel für Kameleon </td></tr><tr><td>Imaging Filter 535 +/- 15 nm</td><td>Chroma</td><td>D535/30m EM</td><td>YFP Emissionsfilter</td></tr><tr><td>Filter 480 +/- 20 nm</td><td>Chroma</td><td>D485/40m EM</td><td>CFP Emissionsfilter</td></tr><tr><td>Objektiv, 200 mm, Achromat</td><td>Thor Labs</td><td>AC508-200-A1</td><td>Relaislinse für FRET-Optiken (3)</td></tr><tr><td>Silberner Breitbandspiegel</td><td>Thor Labs</td><td>ME2S-P01</td><td>FRET-Optik (2)</td></tr><tr><td>NGM-Puffer</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Levamisol</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Polybead Mikrosphären</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>08691-10, 2,5 Vol.<% μmbr/>, Polystyrol-Nanopartikel mit einem Durchmesser von 50 nm </td><td>für C. elegans Immobilisierung</td></tr><tr><td>Transgener Stamm, Strain gpa-9::GCaMP3(in pha-1; him-5 bkg) </td><td>Sternberg Lab</td><td>Stamm PS6388</td><td></td></tr><tr><td>Transgener Stamm, mec- 4::YC3.60Gabel</td> <td>Lab</td><td>Stamm CG1B</td><td></td></tr></tbody></table>

in vivo neuronale calcium imaging in c. elegans

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

Der Fadenwurm C. elegans ist ein idealer Modellorganismus für relativ einfache, kostengünstige neuronalen Bildgebung in vivo. Seine kleinen transparenten Körper und einfache, ermöglicht gut charakterisierten Nervensystems Identifikation und Fluoreszenz-Imaging von jedem Neuron im intakten Tier. Einfache Immobilisierungstechniken mit minimalen Auswirkungen auf die Tier-Physiologie ermöglichen erweiterte Zeitraffer-Aufnahmen. Die Entwicklung von genetisch-kodierten Kalzium Fluorophore wie cameleon 1 und GCaMP 2 ermöglichen in-vivo-Bildgebung neuronaler Calcium Zusammenhang sowohl Zellphysiologie und neuronaler Aktivität. Zahlreiche transgenen Stämme exprimieren diese Fluorophore in spezifischen Neuronen sind leicht erhältlich oder können unter Verwendung gut etablierter Techniken hergestellt werden. Hier beschreiben wir detaillierte Verfahren zur Messung Kalzium Dynamik innerhalb eines einzelnen Neurons in vivo sowohl mit GCaMP und cameleon. Wir diskutieren Vor-und disadvantAlter beider sowie verschiedene Verfahren zur Probenvorbereitung (tierische Immobilisierung) und Bildanalyse. Schließlich stellen wir die Ergebnisse von zwei Experimenten: 1) Verwenden GCaMP die sensorische Reaktion eines bestimmten Neurons mit einer externen elektrischen Feldes und 2) Verwenden cameleon die physiologische Calciumreaktion eines Neurons auf traumatische Laserschaden zu messen. Calcium bildgebenden Verfahren wie diese werden ausführlich in C eingesetzt elegans und sind Messungen in sich frei bewegenden Tieren, mehrere Neuronen gleichzeitig und Vergleich erstreckte sich über genetischen Hintergründen. C. elegans stellt eine robuste und flexible Anlage zur in vivo Bildgebung mit neuronalen Vorteile gegenüber anderen Modellsystemen in technische Einfachheit und Wirtschaftlichkeit.

Hier präsentieren wir die Ergebnisse von zwei getrennten Experimenten. Der erste beschäftigt GCaMP um die Reaktion eines bestimmten sensorischen Neurons zu einer definierten äußeren Reiz zu messen, die einen guten Beispiel, wie fluoreszierenden Calcium Reporter verwendet werden, um optisch zu überwachen neuronale Aktivität in intakten C werden elegans. Die zweite setzt cameleon zur Messung der intrazellulären Calcium transienten ausgelöst innerhalb eines Neurons in Reaktion auf spezifische Laserschaden...

Mit seinem kleinen transparenten Körper, gut dokumentierte Neuroanatomie und einer Vielzahl von zugänglicher genetischen Techniken und Reagenzien<em&gt; C. elegans</em&gt; Ist ein idealer Modellorganismus für<em&gt; In vivo</em&gt; Neuronalen Bildgebung mit relativ einfachen, kostengünstigen Verfahren. Hier beschreiben wir einzelnes Neuron Bildgebung in intakten erwachsenen Tieren mit genetisch kodierten fluoreszierenden Kalzium-Indikatoren.

In vivo Neuronale Calcium Imaging in C. elegans

The nematode worm C. elegans is an ideal model organism  for relatively simple, low cost neuronal imaging in vivo. Its small transparent body and simple, ...

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments ist es, genetisch kodierte Fluor-Vierer zu verwenden, um die Kalziumdynamik einzelner Neuronen im Nematodenwurm zu messen. Sehen Sie Eleganz, dies wird erreicht, indem zunächst intakte C-Eleganz, die ein kalziumempfindliches Fluorophor in den interessierenden Neuronen exprimiert, auf einem Standard-Objektträger montiert und demobilisiert wird. Anschließend werden einzelne Neuronen in vivo mit Hilfe von Videomikroskopie und Standard-Epi-Fluoreszenz-Bildgebungsverfahren abgebildet.Dann wird das Video analysiert, um die Fluoreszenzintensität an bestimmten Stellen im Neuron für zwei häufig verwendete Fluor-Vier-G-Lager zu messen, das ein robustes Einkanalsignal mit großer Amplitude liefert, und ein bundbasiertes Chamäleon, das ein Zweikanalverhältnis erzeugt. Metrische Messergebnisse sind die gezeigte neuronale Aktivität als Reaktion auf einen bestimmten sensorischen Reiz sowie die zelluläre Kalziumphysiologie als Reaktion auf zelluläre Schädigung, die beide auf der optischen Messung des relativen Kalziumspiegels innerhalb des abgebildeten Neurons basieren. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber ähnlichen Methoden in Wirbeltiersysteme

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Dieses Video stellt die Konzepte hinter der Kalziumbildgebung vor und enthält ein Beispielprotokoll für die Zeitrafferbildgebung von Würmern, die in geformten Agarose-Vertiefungen enthalten sind.

Calcium Imaging: Eine Methode zur Visualisierung der neuronalen Aktivität in lebenden C. elegans

Dieses Video demonstriert eine Technik zur Kalzium-Bildgebung in einzelnen Neuronen von sich benehmenden Caenorhabditis elegans unter Verwendung genetisch kodierter fluoreszierender Reporterproteine. Es werden die Schritte beschrieben, die bei der Abbildung der Wurmbewegung und der Messung der Reporterfluoreszenzverhältnisse von Neuronen erforderlich sind, um den intrazellulären Kalziumspiegel mit der neuronalen Aktivität und Verhaltensänderungen während der Eiablage zu korrelieren.

Calcium-Bildgebung in einzelnen Neuronen zur Regulierung des Eiablageverhaltens bei Caenorhabditis elegans

Quelle: Doser, R., et al. Subzelluläre Bildgebung des neuronalen Kalziumumgangs in vivo. J. Vis. Exp. (2023)Dieses Video zeigt in vivo die Bildgebung des subzellulären Kalziumflusses in den ventralen Nervenstrangneuronen von transgenen Caenorhabditis elegans-Stämmen. Es werden zwei unterschiedliche Kalziumindikatoren verwendet: ein zytoplasmatischer Indikator in einem Stamm und ein mitochondrialer Indikator in einem anderen. Neuronen werden unter einem Fluoreszenzmikroskop beobachtet, um...

Bildgebung der subzellulären Kalziumdynamik in Neuronen von Caenorhabditis elegans

Die Abbildung von Verhalten und neuronaler Aktivität über lange Zeitskalen ohne Immobilisierung des Tieres ist eine Voraussetzung, um Verhalten zu verstehen. Die mikrofluidische Kammerbildgebung (AMI) von Agarose kann verwendet werden, um die neuronale Aktivität und das Verhalten für alle Lebensstadien von Caenorhabditis elegans abzubilden.

Agarose Mikrokammern für Langzeit Calcium Imaging von<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Dieses Protokoll beschreibt den Einsatz von genetisch codierte Ca2 + Reporter Datensatzänderungen in neuronale Aktivität im Verhalten Caenorhabditis Elegans Würmer.

Ratiometrischen Kalzium Imaging einzelner Neuronen im Verhalten Caenorhabditis Elegans

Diese Methode bietet eine Möglichkeit, Optogenetik und genetisch kodierte Kalziumsensoren zu koppeln, um die zytosolischen Kalziumspiegel und Veränderungen in evozierten Kalziumtransienten in den Körperwandmuskeln des Modellorganismus C. elegansabzubilden.

In Vivo Calcium Imaging in C. elegans Körperwandmuskeln

Hier wird ein System zur Kalziumbildgebung bei frei verhaltender Caenorhabditis elegans mit gut kontrollierter , nicht lokalisierter Vibration berichtet. Dieses System ermöglicht es den Forschern, nicht lokalisierte Schwingungen mit gut kontrollierten Eigenschaften bei nanoskaliger Verschiebung hervorzurufen und Kalziumströme während der Reaktionen von C. elegans auf die Schwingungen zu quantifizieren.

Kalziumbildgebung bei frei verhaltender Caenorhabditis elegans mit gut kontrollierter, nicht lokalisierter Schwingung

Dendritische Stacheln sind wichtige zelluläre Merkmale des Nervensystems. Hier werden bildgebende Verfahren zur Beurteilung der Struktur und Funktion von dendritischen Dornen in C. elegans beschrieben. Diese Ansätze unterstützen die Entwicklung von mutierten Screens für Gene, die die Form oder Funktion der dendritischen Wirbelsäule definieren.

Bildgebung dendritischer Dornen bei Caenorhabditis elegans

Die aktuellen Methoden beschreiben einen nicht-ratiometrischen Ansatz für die hochauflösende, subkompartimentelle Kalziumbildgebung in vivo in Caenorhabditis elegans unter Verwendung leicht verfügbarer genetisch kodierter Kalziumindikatoren.

Subzelluläre Bildgebung des neuronalen Calcium-Handlings in vivo

Hier stellen wir Protokolle und Werkzeuge zur Visualisierung von Kalzium während der Befruchtung und der frühen Embryogenese unter Verwendung eines genetisch kodierten Kalziumreporters vor, der in der Keimbahn des Modellfadenwurms C . elegans exprimiert wird.

In vivo Visualisierung von Calciumtransienten während der Befruchtung und frühen Entwicklung bei C. elegans

Lernen Sie die Messung neuronaler Calciumdynamik in C. elegans mittels genetisch kodierter Fluorophore. Diese Methode ermöglicht die Analyse neuronaler Aktivität und zellulärer Reaktionen auf Schäden in vivo.

In vivo Neuronale Calcium Imaging in C. elegans

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