השתלה של תאי ensheathing חוש ריח להערכת החלמה תפקודית לאחר פגיעה עצבית היקפית

המטרה הכוללת של הליך זה היא להציג מודל של השתלת תאים המבוסס על שימוש בתאי ריח ומעטפת במודל פגיעה עצבית בגרון. זה מושג על ידי חתך ראשון וביצוע אנסטומוזה של עצב הגרון החוזר. לאחר מכן, מושתלים תאי הריח והמעטפת המתקבלים מרירית הריח או מנורות הריח.

לאחר מכן, חודשיים-שלושה לאחר הניתוח, החיות מוערכות על ידי לרינגוסקופיה ואלקטרומיוגרפיה. לבסוף, עצב הגרון החוזר מבודד למחקרים היסטולוגיים. בסופו של דבר, ניתן להשיג תוצאות המראות שתאי ריח ומעטפת משפרים צמיחה אקסונלית של עצב הגרון החוזר והתאוששות תפקודית של מיתרי הקול באמצעות לרינגוסקופיה, אלקטרומיוגרפיה ומדידות היסטולוגיות.

שיטה זו יכולה לענות על שאלות מפתח בתחום הפגיעה בעצבים היקפיים הכוללות את מדד הצמיחה האקסונלית והיכולת לכמת את הפונקציונליות של ההחלמה. בדרך כלל, אנשים חדשים בשיטה זו יתקשו מכיוון שאנסטומוזה חוזרת של עצבי לאל דורשת מיומנויות מיקרוכירורגיות לאחר יצירת GFP מסומן תרביות ראשוניות של נורות ריח, או OB ורירית הריח או OM כמתואר בפרוטוקול הכתוב. התכוננו לניתוח על ידי חיטוי כל המכשירים.

לאחר שהחולדה הורדמה על ידי הזרקה תוך-צפקית של קטמין וכלורפרומזין, ודא את רמת ההרגעה שלה על ידי ביצוע בוהן. צובטים, מגלחים את מקום הניתוח ומניחים את החולדה בדקוביטוס הגב, מחטאים את העור בשטיפות לסירוגין של אלכוהול ותמיסת בטדין. לאחר מכן, הרכיבו סביבה כירורגית סטרילית ושמרו על הליכים סטריליים לאורך כל הניתוח.

השתמש באזמל כדי לבצע חתך עורי מדיאלי בצוואר הרחם בשני סנטימטרים. לאחר מכן, בעקבות הקו הלבן המדיאלי, בצע חתך אנכי של שרירי האינפרא היואיד באמצעות מפסק אורתוסטטי בין שרירי האינפרא היואיד. חשוף את הגרון ולאחר מכן את עצב הגרון החוזר או RLN.

לאחר מכן, תחת מיקרוסקופ כירורגי, השתמש במספריים מיקרו כדי לחתוך את העצב במלואו בגובה טבעת קנה הנשימה השביעית עם נקודה אחת של תפר 11 T. בצע אנסטומוזה כדי לעצב את הגרון ממש לפני ההשתלה. השתמש ב-0.05% טריפסין EDTA כדי להסיר את תאי ה-OB וה-OM מהכלים.

ואז כדי להפסיק את העיכול, הוסף חמישה מיליליטר של מדיום חם לאחר צנטריפוגה של התאים ב -432 גרם למשך חמש דקות. השתמש בציטומטר המו כדי לספור את התאים ולהתאים את ריכוז התאים במודל זה בין 1.2 לשש פעמים 10 לששת התאים ב-30 מיקרוליטר של D-M-E-M-F 12 שימשו בצינור מיקרו-פוגה. הכינו יחס של אחד עד שניים בין תאים לגורם גדילה, הפחיתו מטריג'ל והניחו על קרח ממש לפני ההשתלה.

הסר את הצינור מהקרח והחזק אותו כדי לחמם את התערובת. בעזרת פיפטה, הניחו את תמיסת המטריג'ל של התאים על אתר האנסטומוזה ואפשרו לתערובת להרכיב את עצמה על העצב הפגוע כאשר היא מתייצבת. השתמש בארבעה תפרים כדי לסגור את השרירים והעור.

הניחו את החולדה בכלוב בודד ושמרו אותה מתחת למנורת חימום למשך 24 שעות. יש לתת משככי כאבים במשך חמשת הימים הבאים, כחודשיים לאחר הניתוח לאחר ההרדמה. חולדות כפי שתואר קודם לכן בסרטון זה, השתמשו בצביטה בבוהן כדי לאשר טשטוש.

הנח את החולדה בדקוביטוס הגבי לפני הכנסת סרטון של 30 מעלות. לרינגוסקופ מותאם כדי לספק את התצוגה הטובה ביותר של הגרון כדי לשחזר את אותה תצוגה עבור כל הקלטה. קבע ציוני דרך אנטומיים כגון הקומיסורה האחורית, מיתר הקול הימני שבו הוא נכנס לאפופיזה הקולית של ה-OID וחוט המוקד השמאלי שבו הוא נכנס להשערה הקולית של ה-oid.

הקלט את תנועות מיתרי הקול על ידי בחירת שלושה רצפים של חטיפה מקסימלית וחטיפה מקסימלית. כדי לנתח את תפקוד הגרון, קבע תנועה זוויתית מוחלטת על ידי מדידת ההפרש בין תנועת החטיפה המקסימלית והמקסימלית של מיתרי הקול. קבע את הציון הדינמי על ידי מדידת משרעת התנועה והציון הפונקציונלי על ידי מדידת הסינקינזיס והתנועות הפרדוקסליות לביצוע אלקטרומיוגרפיה.

הנח אלקטרודה על שריר הירך האחורי של החולדה לאחר חשיפת הגרון וקנה הנשימה כפי שהודגם עבור אנסטומוזיס עצבי חוזר. חשוף את סחוס הקריקותירואיד. לאחר מכן, בעזרת מספריים מיקרו, פתח את סחוס ה-cricothyroid כדי לחשוף את שריר ה-cricothyroid האחורי או שריר ה-PCA.

הכנס אלקטרודת מחט חד קוטבית לשריר כשהחיה תחת אוורור ספונטני. השתמש במערכת רכישה כדי לתעד את הפעילות השרירית החשמלית של שריר ה-PCA. נתח את פעילות השרירים במונחים של עושר וסנכרון עם הנשימה על ידי הקצאת ציון איכותי מאפס לשלוש באמצעות הסולם הבא.

אפס שווה מעקב שלא נוסה ללא עלייה במהלך ההשראה. אחד שווה למעקב מחורז עם השראה גוברת, אבל עקיבה גרועה שתיים שווה למעקב מחורז עם פעילות עשירה יותר ושלוש שווה למעקב מחורז. זה עשיר מאוד ומהווה דפוס הפרעה הדומה לפעילות מכוונת מקסימלית.

לאחר מכן, כדי להימנע מפגיעה ב-RLN בגלל גודלו הקטן, חשפו את עצב התועה, ואז חברו אלקטרודה ועוררו באתר זה. רשום את ההשהיה ומשך הזמן הפוטנציאלי בשריר ה-PCA. לבסוף, לאחר המתת חסד של החיה באמצעות מנת יתר של פנטוברביטל תחת מיקרוסקופ, אתר את האנסטומוזיס, תפר והסר את הגדם הדיסטלי של ה-RLN בין האנסטומוזה לגרון.

בצע ניתוח היסטולוגי על פי פרוטוקול הטקסט המוצג כאן לאחר השתלת תאים מתרביות ראשוניות של ריח, רירית ונורות ריח הן דוגמאות לעקבות EMG המתקבלות בשריר ה- PCA במהלך הנשימה. בעלי חיים בקבוצת הביקורת הציגו פעילות שרירית חשמלית עשירה עם עלייה במהלך ההשראה שלא הייתה קיימת בקבוצת ה-Rerated . באיור זה, ניתוחים היסטולוגיים של ה-RLN על ידי צביעה כחולה טולואידין מראים פרופילי סיבים אופייניים מבעלי חיים עצבניים ומושתלים רגילים.

מדידה זו מאפשרת לכמת את מספר הסיבים המיאלינים, את הגודל הממוצע של הסיבים ואת העובי הממוצע של המיאלין כפי שמוצג כאן. להשלים את הניתוחים ההיסטולוגיים. מעקב אחר תאים חיוביים ל-GFP בוצע לאחר השתלה תוך עצבית בעצב הסיאטי.

אתר זה נבחר ולא RLN מכיוון שהגודל הקטן של R lns מונע השתלה תוך עצבית. אנסטומוזה מאסטר של הנס של העצב הפריאלי החוזר יכולה להיעשות תוך 15 דקות אם היא מבוצעת כראוי לאחר התפתחותו. טכניקות אלו סללו את הדרך לחוקרים בתחום הפגיעה העצבית ההיקפית לחקור את השימוש בהשתלת תאים במודל חולדות.

לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד להשתיל תאים במודל פגיעה עצבית חוזרת ולהעריך התאוששות תפקודית של מיתרי הקול באמצעות אלקטרומיוגרפיה, אנדוסקופיה מעבדתית ומדידות היסטולוגיות.