細胞内記録、感覚野のマッピング、および培養は、リーチのニューロンを同定しヒルドmedicinalis

この手順の全体的な目標は、個々のニューロンからの細胞内記録のための浸出神経節の準備方法、感覚受容野をマッピングするための皮膚のパッチの準備方法、および浸出ニューロンの培養方法を学ぶことです。これは、最初に氷を使用してレックを麻酔し、腹側を上にして固定することによって達成されます。次のステップは、約3つの別々の神経節を解剖し、それらを伸ばして記録することです。

最後のステップは、個々のニューロンを突き刺し、活動電位を記録することです。全体として、ニューラルネットワークの振る舞いは、実験と併せて様々な細胞タイプの生理学的特性評価を行うことによって特徴付けることができる。Sナメクジや甲殻類などの他の単純な無脊椎動物製剤よりもレッシュを使用する主な利点は、神経節には400を超える簡単にアクセスできるニューロンがあり、これらのニューロンが数日間培養中で活動し続けることができることです。

この方法は、皮膚の準備と単一のニューロンの引き抜きを学ぶのが難しいため、視覚的にデモンストレーションすることが重要です。神経節は、皮膚のパッチを侵襲する神経節を簡単に損傷したり、ニューロンを培養するときに損傷を与えたりする可能性があります。映画を見たり、浸出の神経系についてのテキストを読んだりすると聞いたときに自然に尋ねることができる質問は、人間の脳がはるかに興味深いのに、いったいなぜ誰かが無脊椎動物の脳に取り組むのかということです。

そして、あなたが無脊椎動物に取り組むつもりだったなら、なぜあなたは嫌な動物を分泌する恐ろしい血液突然の粘液を浸出させるのでしょうか?まあ、それにはいくつかの正当な理由があります。1つ目は、リーチは私たちに比べて非常に単純な神経系を持っているということです。

そして、その中で個々の神経細胞を研究し、それらがどのように接続されているかを確認し、それらの接続が動物の行動にどのようにもたらされるかを、より複雑な動物では不可能な方法で見ることができます。もう一つの理由は、1960年にスティーブン・コフラーによって初めて神経科学に導入されたリーチが、私たち自身の脳の働きに実際に関連する基本的な問題を研究する機会を提供していることです。そして、私が指摘できる多くの例があります。

一つは、脳内の細胞の大部分、私たちの脳は神経細胞ではなく、いわゆるグリア細胞、衛星細胞であり、最初は浸出で研究され、そこでどのように働いているかがわかれば、私たち自身の脳内でも類似しているかどうかがわかり、実際そうであり、それは多くの臨床的なことにとっても重要でした。しかし、この動物に取り組む主な理由は、映画で見るように、それは美しい神経系を持っています。神経系は、神経節の鎖、神経細胞のグループ、限られた数で構成されています。

それらから個別に記録できるすべてのセルを確認できます。パリの地下鉄の地図を勉強するのと同じように、それらがどのように接続されているかを知ることができます。そして、この美しさこそが、この準備を非常に魅力的なものにし、解剖を開始する前に特定の基本原則を発見する能力と相まって

必ず最初に録音ソフトウェアと記録電極を設定してください。ピンを使用して、リンガー溶液で満たされた大きなシリコーンエラストマー裏地皿で浸出を解剖する準備をします。10番または11番のメスで動物を腹側を上に伸ばします。

腹側の正中線に非常に浅い切り込みを入れて、縦方向に切開します。動物が完全に開き、血液洞がよじれなく伸びるまで、腹側血液洞を切断しないようにしてください。VNCは今に含まれています。

細い虹彩はさみを使用して血液の副鼻腔に傷をつけ、はさみの1つの刃を副鼻腔の下に滑り込ませ、刃を少し上げて副鼻腔を神経組織から分離します。次に、神経根、分節神経、または神経節間の結合体を避けながら、洞をVNCの長さに切断します。次に、血管が根と結合する場所の遠位の根を切って、腹側神経索の一部を切除します。

次に、生理食塩水で満たされた清潔な皿に神経節を移し、神経根と結合体で固定します。この調製物を使用して、感覚ニューロンの細胞体から細胞内記録を取得します。L15を含む清潔な皿に腹側をピンで固定します。

胎児FCSでは、細いハサミで根を少し伸ばす必要があります。ニック、片方の端のグリアカプセルが滑り、カプセルの下とカプセルを横切る1つのはさみの刃。次に、100マイクロリットルのコラゲナーゼを皿に加え、皿をシェーカーに15分間置き、露出した細胞体の周りで培地を動かして細胞を調べます。

本体の直径よりわずかに大きい約50ミクロンのボアサイズのファイヤーポリッシュピペットからの最小限の吸引を使用して細胞を神経節から抽出できるようになるまで、細胞をさらに15分以上シェーカーに戻します。細胞ECMを遊離するには、FCS培地を含むL 15を数滴細胞に加え、室温で数時間から24時間インキュベートします。準備ができたら、基板でコーティングされたマイクロウェル皿に細胞を隣り合わせにプレートします。

L 15ミディアム付き。FCSは使用しないでください。24時間後、彼らは電気生理学の準備ができており、数日間生存可能なままになります。

最初は、電気的特性はin vivo調製とまったく同じではありません。しかし、数日後には、衝動はほとんど区別がつかなくなります。浸出背側を下にして、前述のようにエラストマーで裏打ちされた皿に固定します。

次に、切断された神経節の反対側に根を付けて、皮膚を片側に固定します。あるいは、体壁へのすべての根が無傷の神経節上の浸出の腹側に窓を作ります。感覚細胞の1つで安定した細胞内記録を取得した後、小さなファイヤーポリッシュロッドを使用して、t細胞とp細胞と同じセグメントの皮膚に軽く触れます。

肌に軽く触れると、電気的な反応が起こります。エンドセルでは、ロッドからの圧力がさらに必要になり、ほとんどの場合、エンドセルはピンセットで皮膚をつまんだ場合にのみ反応します。したがって、潜在的な組織損傷を最小限に抑えるために、N個の細胞から最後に記録して、検査されたニューロンが特定の場所にプロセスを持っているかどうかを判断します。

神経節間の結合体を切断し、受容野を損失がないか再調査することができます。浸出神経節の感覚ニューロンからの細胞内記録は、それらの明確な時間トレースによって特徴付けられます。それらの静止電位はマイナス45〜60ミリボルトです。

それより低い温度で測定した場合は、新しいガラスプローブまたは新しい調製物を使用する必要があります。振幅が小さい自発的な活動電位は、細胞が運動ニューロンである可能性があることを示しています。神経節体壁の準備では、電流注入を使用して、ニューロンがまだ付着している筋肉を神経支配しているかどうかを判断できます。

たとえば、神経節の腹側にある輪状起立筋運動ニューロンは、襟の目を浮かび上がらせます。電流注入後に特性のない波形が見られる場合は、不平衡ブリッジまたはオフセット容量補償が原因である可能性があります。ブリッジのバランスが取れていると、7時間後の電流パルスの開始時と終了時に刺激アーチファクトが見られます。

初代培養では、一対の網膜細胞から測定を行いました。シナプス電位の振幅は約1〜2ミリボルトでした。培養で56時間後、シナプス電位は10ミリボルトを超えました。

活動電位の形状も変わりました。同じ調製物で、神経根または結合体が刺激された。黒い痕跡は、細胞外電極を使用して結合体に加えられたサブスレッショルド刺激によって誘発されました。

赤いトレースは、刺激電圧の増加によって細胞がどのように発火し、活動電位が発生したかを示しています。レチアセルへのルシファーイエローの注入は、電極に負の電流を流すことによって行われました。注射直後、染料は体細胞に局在したままでした。

30分後、染料はすでに神経根に拡散していました その発達後。この技術は、神経生物学の研究者が活動電位の形状の背後にある根本的なメカニズムを探求し、神経回路をさらに調査するのに役立ちます。また、識別可能なニューロンの再生と修復の理解を促進するため。

このビデオでは、一連の実験手法を示します。浸出を使用することは、シナプス形成、神経調節、または神経生理学の基本的な側面に適用できる可能性があります。