Groß Gene Knockdown in C. elegans Verwenden dsRNA Fütterung Bibliotheken zu Robust Loss-of-function Phänotypen generieren

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, großflächige RNA-Interferenz-Screenings in C-Eleganz unter Verwendung einer bakteriellen DS-RNA-Fütterungsbibliothek durchzuführen, um die Genexpression zu unterbinden. Dies wird erreicht, indem zunächst bakterielle Klone aus einer DS-RNA-Bibliothek kultiviert werden. Unter Wachstumsbedingungen, die einen Plasmidverlust verhindern, beginnen Sie mit der Duplizierung jeder primären Bibliotheksplatte und verwenden Sie dann die 96-Well-Duplikats-Bibliotheksplatte, um temporäre Bakterienstängel auf Agar-Omni-Platten zu erzeugen.

Bakterien aus diesen Omni-Platten werden über Nacht in Flüssigkulturen gezüchtet und anschließend auf die Oberfläche der Wurmfutterplatten übertragen. Jeder bakterielle Klon aus der Bibliothek trägt ein einzigartiges D-S-R-N-A-kodierendes Plasmid, das auf ein kelganisches Gen für den Knockdown abzielt. Der zweite Schritt besteht darin, synchronisierte Würmer auf die Futterplatten zu legen.

Anschließend werden die Würmer mehrere Tage lang in einer befeuchteten Kammer bei 20 Grad Celsius gezüchtet. Wenn sich die Würmer von den Bakterien ernähren, werden die induzierten DS-RNAs in den Darm des Tieres freigesetzt, wo sie sich dann auf das umliegende Gewebe ausbreiten, um systemische Knockdown-Effekte zu verursachen. Der letzte Schritt besteht darin, die gefütterten Tiere auf phänotypische Effekte zu untersuchen, die durch genspezifischen Knockdown verursacht werden.

Diese phänotypischen Assays werden verwendet, um Gene zu identifizieren, die für den untersuchten biologischen Prozess wichtig sind. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie der Mikroinjektion von Dublett-strangigen RNAs in die Wurmgonade besteht darin, dass sie einen hohen Durchsatz bietet. Mit Hilfe von Fütterungsbibliotheken können wir die biologische Funktion fast aller Gene des Seeelgins in nur wenigen Wochen untersuchen.

Viele Labore haben mit diesem Knockdown-Ansatz zu kämpfen, weil die meisten Gene und die C-Eleganz haplo ausreichend sind. Und so muss der RNA-Knockdown die Genexpression um mehr als 50 % verringern, um einen Funktionsverlust von Phänotypen zu erzeugen. Um einen robusten Gen-Knockdown zu gewährleisten, ist es entscheidend, dass alle Bakterien, die an die Würmer verfüttert werden, das doppelsträngige RNA-Plasmid exprimieren.

Um mit dem Verfahren zur Bestimmung des Plasmidverlusts zu beginnen, entnehmen Sie eine kleine Bakterienprobe, wie in jedem relevanten Schritt beschrieben, und geben Sie sie in 450 Mikroliter steriles Wasser. Verwenden Sie 100 Mikroliter dieser verdünnten Probe, um weitere serielle Verdünnungen mit sterilem Wasser zu erzeugen. Mischen Sie die Lösungen zwischen den Verdünnungen gründlich.

Verteilen Sie 100 Mikroliter jeder Verdünnung auf LB- und LB AMP-Platten und inkubieren Sie sie am nächsten Tag über Nacht bei 37 Grad Celsius, identifizieren Sie die LB-Platte, die zwischen 100 und 500 Bakterienkolonien enthält. Zählen Sie die Anzahl der Kolonien auf dieser Platte und auf der entsprechenden lb amp-Platte, die die gleiche Verdünnung von Bakterien enthalten. Bestimmen Sie den Plasmidverlust mit dieser Gleichung.

Der Prozentsatz der Bakterien, die das Plasmid nicht enthalten, wird berechnet, indem die Anzahl der Kolonien auf der LB-Amp-Platte von der Anzahl der Kolonien auf der LB-Platte subtrahiert, durch die Anzahl der Kolonien auf der LB-Platte dividiert und mit 100 multipliziert wird. Der Plasmidverlust wird durch das Wachstum von Bakterien in hohen Konzentrationen von kohlenstoffhaltigem Sellin verhindert Für einen effektiven Knockdown. Vor der Fütterung von Tieren auf Plasmidverlust prüfen und nur fortfahren, wenn der Plasmidverlust weniger als 15 % beträgtBeginnen Sie diesen Vorgang, indem Sie doppelte Bibliotheksplatten aus dem Gefrierschrank mit minus 80 Grad Celsius entfernen. Nehmen Sie das Foliensiegel ab, während die Kulturen noch gefroren sind.

Bringen Sie die Kunststoffabdeckung der Platten wieder an und stellen Sie die doppelten Bibliotheksplatten auf eine ebene Fläche, damit sie nicht länger als 30 Minuten bei Raumtemperatur auftauen. Sterilisieren Sie den bukkalen 96-poligen Replikator. Legen Sie es in ein Ethanolbad und verbrennen Sie dann das Ethanol.

Die Stecknadeln mit einem Dutt und einem Brenner abziehen. Lassen Sie die Flamme erlöschen und wiederholen Sie den Vorgang. Die Stifte eines sauberen Replikators sollten vor jedem Gebrauch mit destilliertem Wasser gespült und dann sterilisiert werden.

Setzen Sie den sterilisierten Replikator in die Vertiefungen der aufgetauten Duplikatplatte ein und rühren Sie die Kulturen damit vorsichtig um. Kleine Mengen der Kultur haften an den Stiften des Replikators. Entfernen Sie den Replikator vorsichtig aus den Vertiefungen der Duplikatplatte und platzieren Sie ihn vorsichtig auf der Oberfläche der Kugelplatte.

Achten Sie darauf, die Agaroberfläche nicht zu durchstechen. Lassen Sie den Replikator drei bis vier Sekunden lang auf der Oberfläche der Omniplatte, damit Bakterien von den Stiften des Replikators auf die Agaroberfläche übertragen werden. Um Plasmidverluste auf festen Medien zu verhindern, enthält das Ate zwei Milligramm pro Milliliter.

Kohlensäure-Sellin. Entfernen Sie den Replikator und lassen Sie das kleine Volumen der Bakterienkultur in den Agar einziehen. Nachdem beide Platten dupliziert wurden.

Inkubieren Sie die Omni-Platten am nächsten Morgen 15 bis 18 Stunden lang bei 37 Grad Celsius. Diese Omni-Platten können entweder zur Beimpfung von 96-Well-Flüssigkulturen verwendet oder bis zu sieben Tage bei vier Grad Celsius gelagert werden. Die Bakterien für die Fütterung von Würmern werden als Flüssigkulturen unter Verwendung von Bakterien aus den Kugelplatten unter Verwendung einer Repeatpipette und einer 50-Milliliter-Kombispitze hergestellt, wobei je zwei Milliliter ein Milliliter bakterielles Wachstumsmedium dosiert wird.

Sterilisieren Sie den Replikator und platzieren Sie ihn auf der Oberfläche einer Omniplatte mit Bakterienkolonien, wobei Sie sicherstellen, dass die Stifte mit jeder der 96 Bakterienkolonien in Kontakt kommen. Bewegen Sie den Replikator vorsichtig von der Oberfläche der Kugelplatte in die Vertiefungsplatte und stellen Sie sicher, dass die Stifte die Seiten der Vertiefungen nicht abkratzen, bis sie in Wachstumsmedien eingetaucht sind. Um die Bakterien in das Wachstumsmedium zu verdrängen.

Bewegen Sie den Replikator langsam in einer quadratischen Bewegung entlang der Innenwand der Deep-Well-Platte. Achten Sie darauf, keine Brunnen zu spritzen und zu verunreinigen. Für jede 96-Well-Deep-Well-Kulturplatte sollten zwei Kontrollen enthalten sein.

Bakterien, die DS-RNA exprimieren, als Positivkontrolle für den erwarteten Knockdown, Phänotyp, und Bakterien, die einen leeren DS-RNA-Vektor enthalten, als Negativkontrolle. Entfernen Sie mit einer sterilen Impfschlaufe eine einzelne gut isolierte Kolonie von der Positivkontrollplatte und impfen Sie eine leere Vertiefung in die tiefe Vertiefung, die als Platte bezeichnet wird. Notieren Sie die Position der Vertiefung, die geimpft wurde.

Wiederholen Sie den Vorgang für die Negativkontrolle. Schütteln Sie die Deep-Well-Platten in flacher Position bei 650 U/min auf einem Mikroschüttler bei 37 Grad Celsius über Nacht. Nach der Inkubation der Kulturen über Nacht werden die Bakterien aus den 96 Deep-Well-Platten auf 12 übertragen.

Der Transfer von Well-Zuführplatten kann mit vier Wells gleichzeitig erfolgen. Platzieren Sie die Pipettenspitzen auf jedem dritten Kanal einer 12-Kanal-Mehrkanalpipette. Entnehmen Sie 150 Mikroliter Bakterienkultur aus der Deep-Well-Platte und werfen Sie sie auf die Oberfläche von vier Wells der 12-Well-Fütterungsplatte.

Es ist wichtig, die Oberfläche des Agars während des Transfers nicht zu durchstechen, da sich Würmer eingraben und sich nicht von den DS-RNA-exprimierenden Bakterien ernähren. Nachdem jeder Satz von vier Vertiefungen übertragen wurde, ersetzen Sie die vier Pipettenspitzen durch vier neue sterile Pipettenspitzen und säen Sie die nächsten vier Vertiefungen der Fütterungsplatte aus. Lagern Sie die ausgesäten Platten aufrecht im Dunkeln bei Raumtemperatur über Nacht, damit die Bakterien in den Agar aufgenommen werden können. Vor dem Transfer von L One wurden C elgan-Larven für ein Fütterungssieb auf DS-RNA-Futterplatten gefesselt.

Die Konzentration der zuvor vorbereiteten L 1 gefangenen Larven muss bestimmt werden. Der Erlenmeyerkolben mit den gefangenen L-1-Larven wird gemischt, um die Tiere zu verteilen. Entfernen Sie dann ein 10-Mikroliter-Aliquot und legen Sie es tropfenweise auf eine freie, sechs Zentimeter große NGM-Platte.

In vier bis fünf Tropfen die Mitte der Platte hinunter. Stellen Sie sicher, dass alle Medien aus der Pipette ausgestoßen sind. Verteilen Sie mit dem Ende der Pipettenspitze die Punkte der Wurmsuspension, um eine einzige durchgehende Flüssigkeitslinie zu bilden, die sich über den Durchmesser der Platte erstreckt.

Mit einem Präpariermikroskop werden alle Tiere gezählt, beginnend an einem Ende der Flüssigkeitslinie und weiter bis zum anderen Ende, bevor die Flüssigkeit in die Platte aufgenommen wurde und sich die Tiere zerstreuen. Dies kann eine ständige Neuausrichtung des Präparierzielfernrohrs erfordern, um sicherzustellen, dass keine Tiere übersehen werden. Wiederholen Sie diesen Zählvorgang für drei separate 10-Mikroliter-Aliquoten, um die durchschnittliche Anzahl von Würmern pro Mikroliter Wurmsuspension zu bestimmen, und notieren Sie diese Zahl direkt auf dem Erlenmeyerkolben

Um das Fütterungssieb zu starten, verwenden Sie die Suspension aus L one gefangenen Larven und sterilem Wasser, um eine Lösung herzustellen, die 2000 Würmer pro Milliliter enthält. Für jede 12-Well-Fütterungsplatte werden 120 Mikroliter dieser Wurmsuspension benötigt, die gründlich gemischt werden, um eine gleichmäßige Verteilung der Tiere zu gewährleisten und die Tiere zum Pipettieren in ein steriles Reservoir zu bringen. Mit der Mehrkanalpipette, die mit Spitzen in jeder dritten Position ausgestattet ist, werden 10 Mikroliter der Wurmlösung direkt auf den Bakterienrasen der Futterplatten übertragen.

Achten Sie darauf, die Oberfläche des Agars nicht zu durchstechen, da sich Würmer in den Agar eingraben und sich nicht von den D-S-R-N-A-exprimierenden Bakterien ernähren. Nach dem Umfüllen der Wurmlösung in alle zwei Reihen von Fütterungsplatten mischen Sie die Wurmlösung im Reservoir erneut, indem Sie sie vorsichtig schwappen, während sich die Würmer schnell ansiedeln, untersuchen Sie frühzeitig einige Vertiefungen unter dem Präparierzielfernrohr, um sicherzustellen, dass jede Vertiefung 20 bis 30 Würmer enthält. Sobald alle Fütterungsplatten Würmer haben, lagern Sie die Platten am nächsten Tag, nachdem die Wurmsuspension in die Platte aufgenommen wurde, aufrecht in einer befeuchteten Box in einem 20 Grad Celsius heißen Inkubator, drehen Sie die Platten um und kehren Sie bei 20 Grad Celsius in den Humidor zurück.

Tiere auf diesen Platten können nach drei Tagen für P-Null-Phänotypen und dann wieder nach sechs Tagen für F1-Phänotypen beobachtet werden. Das hier beschriebene Protokoll wurde verwendet, um vier Gene auf Knockdown-Ei L 30, dumpy 17, PAT 10 und auf vier Eizellen L 30 und auf vier Eizellen zu testen, die im Nervensystem exprimiert werden. Pat 10 wird in der Körperwandmuskulatur exprimiert und Dumpy 17 wird in Epidermiszellen exprimiert.

Erie one Lin 15 B-Mutanten wurden in den Screens verwendet, da sie eine erhöhte Empfindlichkeit gegenüber RNAi als Negativkontrolle aufweisen. Die Würmer wurden mit Bakterien gefüttert, die das leere PL 44 40-Plasmid enthielten und nicht wie erwartet eine DS-RNA exprimierten. RIE one Lin 15 B-Tiere, die mit Bakterien gefüttert wurden, die im leeren Plasmid enthalten waren, zeigten keine morphologischen oder Verhaltensdefekte.

Dieses Foto zeigt sich frei bewegende Tiere, was sich in ihrer normalen Körperhaltung zeigt. Der schwarze Pfeil zeigt die Position eines jungen erwachsenen Tieres an. Der weiße Pfeil zeigt die Position einer Gruppe von gelegten Eiern an.

Das normale Verhalten der Würmer ist in diesem Videoclip zu sehen: Ei L 30 kodiert für das Sea Elegance Ortho log der G-Protein-Untereinheit G alpha Q. Als L ein Stadium Erie eins Lin 15 B Larven mit Bakterien gefüttert wurden, die Ei L 30 DS RNA exprimierten. Die Larven wuchsen zu erwachsenen Larven heran, die deutliche Defekte im Fortbewegungs- und Eiablageverhalten zeigten. Nach drei Tagen waren 100 % der Tiere, die mit DS-RNA gegen Ei L 30 gefüttert wurden, gelähmt und nicht in der Lage, Eier zu legen.

Dieses Foto zeigt, dass alle Tiere ein starres Aussehen angenommen haben, das typisch für gelähmte Tiere ist. Zu beachten ist auch das völlige Fehlen von gelegten Eiern auf dem Teller. Dumpy 17 kodiert ein Kollagenprotein, das für die Bildung der Nagelhaut im Meer benötigt wird.

Elgan und dumpy 17 Null-Mutanten sind kleiner und fetter als Wildtyp-Tiere. In diesem Experiment wurden keine morphologischen Defekte bei P-Null-Tieren beobachtet, die mit dumpy 17 D-S-R-N-A gefüttert wurden. Allerdings zeigten 98 % der F1-Tiere, wie in dieser Abbildung gezeigt, den dumpfen Phänotyp.

Beachten Sie, dass erwachsene Tiere auf dem Feld, von denen eines durch den Pfeil gekennzeichnet ist, kleiner und dicker sind als das erwachsene Tier, das durch den schwarzen Pfeil gekennzeichnet ist. In Panel A. Der Mangel an kurzen und dicken P-Null-Tieren deutet darauf hin, dass die Funktion des dumpigen 17-Gens in frühen Larvenstadien für eine korrekte Körpermorphologie erforderlich ist. Pat 10 kodiert das Troponin-CA-Protein der Körperwandmuskulatur und enthält vier EF-Handmotive, die Kalzium binden.

In dieser Studie wurde beobachtet, dass 100% der Erie one Lin 15 B-Tiere, die mit Pat 10 DS RNA gefüttert wurden, innerhalb von drei Tagen gelähmt waren und keine Eier legten, was zu einem tödlichen Phänotyp führte. Beachten Sie, dass, obwohl die Tiere gelähmt sind, sie immer noch ihre Kopfmuskeln bewegen können, um zu fressen, wie die Beseitigung von Bakterien in der Nähe des Kopfes, die durch den Pfeil auf vier Kodierungen markiert sind, ein Homöo-Domänenprotein, das in ventralen Motoneuronen exprimiert wird und für einen korrekten synaptischen Input erforderlich ist, angezeigt wird. Choice on four wurde in dieser Studie als Testgen gewählt, da es sich als resistent gegen frühere DS-RNA-Fütterungsstrategien erwiesen hat.

Die Ergebnisse dieser Studie zeigten, dass 62% der Tiere, die mit vier DS-RNA-exprimierenden Bakterien aus dem Bibliothekspräparat gefüttert wurden, Defekte im Fortbewegungsverhalten aufwiesen, verglichen mit Wildtyp-Tieren, die sich frei in einer sinusförmigen Bewegung zurückzogen, wenn sie auf den Kopf gestoßen wurden, UNC vier Null-Mutanten nicht zurückweichen, sondern sich stattdessen eng zusammenziehen, was zu einem dorsalen Flexor führt, die oft so extrem wird, dass sich Kopf und Schwanz des Tieres berühren und den Körper in eine zusammengerollte Position bringen. Diese Tabelle zeigt den Prozentsatz der Tiere, die nullähnliche Phänotypen aufweisen, wenn sie mit DS-RNA gegen jedes der vier getesteten Gene gefüttert werden. Für jedes Knockdown-Experiment wurden 100 Tiere untersucht. Diese Ergebnisse zeigen, wie wichtig die Plasmidretention für den Erfolg der DS-RNA ist.

Interferenz-Screens: Robuste und hochpenetrante Funktionsverlust-Phänotypen können in allen Geweben beobachtet werden. Wenn alle Bakterien, die an Würmer verfüttert werden, DS-RNA exprimieren, kann die gesamte Fütterungsbibliothek in etwa zwei Monaten von einer Person gescreent werden. Um den Durchsatz zu verbessern, testen wir jeden bakteriellen Klon nur einmal in einem Fütterungssieb.

Alle Gene, die beim ersten Durchgang durch die Bibliothek identifiziert wurden, werden dann erneut getestet. In dreifacher Ausfertigung bestehen wir darauf, dass der gewünschte Phänotyp in allen Wiederholungstests beobachtet wird, damit das Gen als positiver Treffer quadriert wird. Das Plasmid wird dann von den Bakterien gereinigt und sequenziert, um die Identität des kodierten Gens zu überprüfen.

Sobald ein Gen identifiziert ist, bestellen wir eine L-Mutante, falls eine verfügbar ist, und testen sie auf den gewünschten Phänotyp, bevor wir eine weitere Charakterisierung des Gens durchführen.