Name: Elektron Probe X-ışını Mikroanaliz tarafından Nöronlar Toplam Kalsiyum Ölçümü (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-11-20T17:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 42 s
Description: Öğrenin EPMA yöntemiyle kültüre edilmiş nöronlarda mitokondri düzeyinde kalsiyum konsantrasyonunu ölçmeyi. Bu teknik hücre içi kalsiyum sinyalleşmesini incelemek için yüksek çözünürlüklü element analizi sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Biz mükemmel teknik yardım için Bayan Christine A. Winters teşekkür etmek istiyorum. Bu çalışma NINDS İntramural Araştırma Programı, NIH (Z01 NS002610) Temel Nörobilim Programı tarafından desteklenmiştir.

Burada açıklanan yaklaşım özel araçlar, araçlar ve yazılımlar kullanarak geliştirilmiştir. Laboratuvarları, aynı deney düzeneği kullanarak olmayacak çünkü yaklaşım mümkün jeneralize. 1.. Hızlı Dondurma Bu dondurma anda canlı hücrelerde olduğu gibi nicel yayılabilir doku bileşenleri ve kimyasal elementlerin dağılımını koruyan bir şekilde hücreler ya da dokuların 1) &quot;cryofixation&quot;: tarif edilecek olan analitik yöntem için kriyojenik yaklaşımlar kesinlikle bağlıdır ve 2) ultra ince hazırlanması bir TEM görüntüleme ve analiz için uygun cryosections. Bu teknikler kısaca burada açıklanan, ancak diğer laboratuvarlarda bu prosedürleri yeniden üretimi için gerekli ayrıntıları bu yazının kapsamı dışındadır vardır. İlgilenen okuyucular mükemmel yeni makaleler 9,14 adlandırılır. Dikkat: Bu bölüm, Sıvı sabun kullanımını tarif ederson derece yanıcı ve potansiyel olarak patlayıcı olan efied etan; uygun önlemler alınmalıdır. Operatör ayrıca sıvı azot aşina olması gerekir (LN 2) koruyucu laboratuvar önlüğü, gözlük ve eldiven gibi cryoresistant güvenlik önlemleri. Not: Burada ve genelinde, tüm aletleri (forseps, vb) dondurulmuş örnekler yanlışlıkla çözülme önlemek için kullanmadan önce LN 2 precooled olmalıdır işlemek için kullanılır. Lamelleri kültürlü hücrelerin <ol><li> LN 2-soğutmalı orta kuyuda -160 ° C&#39;de gaz etan yoğunlaştırarak bir dalma dondurma cihazını hazırlayın. Işaretine kadar doldurun ve dönebilen alüminyum kapak kullanılmadığı ile kuyu kapağı. </li><li> Ince bir sulu film deneysel olarak uygun koşullar altında hücrelerin kültüre plastik lamelleri leke filtre kağıdı kama, kullanma. Doku dokunmamak şekilde kenarından Blot, deneme-yanılma ile belirlenen ideal kalan film, mümkün olduğu kadar ince ama çok th değildoku yüzeyinin kurumasını buharlaşması ve izin verecek şekilde de. </li><li> Sıkma forseps ile kenarından lamel tutarak, hızlı bir şekilde elle veya yerçekimi çalışan pistonu kullanarak, sıvı etan batırmayın. </li><li> Uzun süreli saklama kapları içine lamelleri istenilen sayıda işlemek için yeterince büyük LN 2 yakındaki bir strafor kase, donmuş lamel yerleştirin. LN 2 altında kaçırmamak yok alüminyum vidalı kapaklı kutu tavsiye edilir. </li></ol> Kültürlü beyin dilimleri hızlı dondurma <ol start="5"><li> Diseksiyon mikroskop, görünüm ve şark rahatsız ve hala kültür membran eklemek bağlı bir organotipik hipokampal dilim altında. Siyah Sharpie-tipi kalem ve fotoğraf ile dilimin kenarına yakın membran fiducial işaretlerini yerleştirin. </li><li> Hala mikroskop altında, yaklaşık kesip. Karelere merkezli bireysel dilimleri ile 5 x 5 mm zar kareler. Dilim dokunarak veya zarı eğilmemesie. </li><li> (Aşağıda açıklanan) bir cryoultramicrotome uygun yapılan bir özel tasarlanmış alüminyum disk üzerinde çap agar yastığa ¼ tarafından yastıklı bir membran destekli dilim, montaj. Hızla pnömatik özelleştirilmiş bir &quot;slam dondurma&quot; cihaz vasıtasıyla bir LN 2-soğutmalı safir bloğuna karşı iten tarafından dilim dondurma. </li><li> Kültürlenmiş hücreler için tarif edildiği gibi depolama taşı. </li></ol> 2. Cryosectioning CAVEAT: basit ve mantıklı, eğitim, sabır ve önemli pratik gerektirir iken Başarıyla ultra ince kesitlerin kuru kesim kurdeleler üreten. <ol><li> -135 ° C&#39;ye bir cryoattachment ve serin ile donatılmış bir cryoultramicrotome dışarı pişirin </li><li> Yaklaşık içine donmuş lamelleri kesin. Keskin, soğutulmuş neşter kullanılarak 3 x 3 mm kareler. Kültürler Standart 3 üzerinde, bir viskoz sıvı &quot;cryoglue&quot; in (bir etanol 01:06 karışımı ve 2-propanol 11) yukarı bakacak parçaları gömmikrotom numune aynasını uyacak şekilde tasarlanmış mm çaplı alüminyum pimleri. Kültür yüzeye cryoglue sızıntı kaçının. -160 ° C ≤ için cryobox sıcaklığını düşürerek cryoglue katılaşmaya <ul class="lalpha"><li> Dondurulmuş beyin dilimleri için, güvenli bir vida yaka vasıtasıyla bir ısmarlama numune aynada doğrudan diskler takın. </li></ul></li><li> Bir yakl - dilim lamel parçaları veya belirlenen alanlarda örneğin hücre açısından zengin alanlar - dondurulmuş örneklerin seçili alanlarını kesin. Bir elmas kesme aracı kullanarak 250 x 250 mikron blok yüz ve ~ 100 mikron derinlik. </li><li> Ca ince kesit Kuru kesilmiş şeritler. 35 ° elmas cryoknife kullanılarak -160 ° C, Referencs 4, 9 anlatıldığı esas olarak. Kesme hızı ve bıçak boşluk açısı ampirik olarak belirlenir; iyi bir başlangıç ​​noktası 9 ° 0.4-0.6 mm / sn &#39;dir. Hidratlı bölümlerin anma kalınlığı, yani numune avans, ibölümler esas olarak, sıkıştırma nedeniyle, aslında 1.5-2.0x daha kalın olmakla birlikte, tipik olarak 80 nm s. Tatmin edici kesit, bir antistatik cihaz gereklidir. Bıçak kenarından aygıt 0.5-1 cm&#39;lik iyonize ucu yerleştirin ve bölme tatmin edici şeritleri üretilir kadar çıkış gücü ayarlamak. </li><li> Ahşap aplikatör sopalarla (epoksi) kirpik yapıştırma tarafından kirpik sondaları hazırlayın. Böyle bir sonda kullanılarak, pick up ve bıçak arkasından transfer kısımlarına 100-örgü katlama bakır döküm ızgaralar üzerinde parlayan taburcu, karbon kaplı pioloform destek filmleri üzerine ve arkasında bir çalışma rafta yarım katlanmış indiyum folyo zarfın üzerine oturtulmuş bıçak. Soğuk presleme aracı ile ızgara ve zarfın üst yarısını, basın üzerinde katlayın. </li><li> Bir alüminyum uygun bir ızgara kutusu ve mağaza transfer sarılı ızgaralar gibi adım 1.4 &#39;de tarif edebilirsiniz. </li></ol> 3. Elektron Mikroskop için Örneklerinin Cryotransfer EPMA için temel araçBu laboratuarda 120 kV işletilen ve kriyomikroskopisi için donanımlı, yani temiz bir vakum, numune alan anticontaminator, bir 2k x 2k yüksek hassasiyetli dijital kamera ve cryotransfer numune tutucu ile tasarlanmış analitik bir elektron mikroskobu. Hem de düşük ve yüksek büyütme modlarında mikroskop uyum ve çalışma koşullarını önceden kontrol ve ideal ≤ 10 -7 Torr, tatmin edici bir sütun vakum onaylayın. Gerekli ayar kadar. <ol><li> Cryoholder bir Dewar bileşeninin vakum yalıtım tatminkar olduğunu doğrulayın. Gerektiğinde Pompa. </li><li> Kendi kontrol kutusuna tutucu bağlantı kablosunu ayırmak, mikroskop aşamasının içinde yüksek vakum altında ise, minimum sıcaklık, en az -160 ° C, cryoholder soğutun. Operatör ve mikroskop yüzeylere dökülüp LN 2 en aza indirmek için yuvasından çıkarmadan önce açıölçer 45 ° saat yönünde eğin. </li><li> İntegral izole soğutma benchtop cryoworkstation hazırlayın160 ° C ≤ d cup </li><li> Transferi (quickly!) mikroskop soğutmalı cryoholder iş istasyonu kriyo için. Sahibinin don kalkanını geri çekin. </li><li> LN 2 cryoworkstation çalışma masanın üzerinde depolama ve yerden bir ızgara sandviç altında almak. Sahibinin örnek kuyu için bir tutma halkası da masaya yerleştirilir. </li><li> Indiyum zarfı açın ve cryoholder bir örnek çukuruna kapalı katlama ızgara taşıyın. Anahtar aracı sağlanan ve don kalkan kapatmak kullanarak tespit halkasını ile ızgara sabitleyin. </li><li> Çabuk cryoworkstation gelen cryoholder çıkarın ve mikroskop hava kilidi takın ve mümkün olduğunca çabuk pompalama dizisi geçmesi. Ekleme, sütun vakum minimum bozulma olmalıdır. </li><li> 0 ° eğim açıölçer dönün. Bağlayın ve kontrol kutusu reenergize ve numune sıcaklığı 150 ° C&#39;yi ≤ olduğunu teyit </li><li> Bir Dewar dolduruntutucu numune ve vakum ve sıcaklık tamamen kurtarmak için izin verir. </li></ol> 4. Bölümler Görsel Anketi <ol><li> Örnek ortaya çıkarmak ve elektron ışın açmak için sahibinin don kalkanını geri çekin. </li><li> Görme düşük büyütme, tipik 250X ve düşük aydınlatmada örneği değerlendirmek. Şekil 1 &#39;de gösterildiği gibi, bölümler, ince ve pürüzsüz, katlanmamış veya üst üste gelen, düz ve iyi destek filminin bağlanmış olabilir ve genellikle ızgara çubukları tarafından gizlenmiş olmamalıdır. </li><li> İsteğe bağlı olarak seçilen bölümleri fotoğraflamak. (NOT: dondurulmuş sulu bölümler ışın kaynaklı hasarlara karşı çok duyarlı olduğundan, ışın maruziyeti en aza indirin.) Seçilmiş bölümlerin koordinatlarını saklamak için otomatik dijital açıölçer sahne kullanın. </li></ol> 5. Bölümler dondurarak kurutma <ol><li> Dondurarak-kurutma bölümleri için ca tutucu sıcaklığının artırılması ile. ~ 30 dakika boyunca 100 ° C. </li><li> Aşağıda -160 ° C veya tutucu recool. </li><li&gt; görüntüleme önce, nedeniyle termal bisiklet ve / veya titreşim pikap görüntü kaymasını önlemek için cryoholder kontrol ünitesi ve fiziksel ayırma kontrolör kablosu kapatılabilir. </li></ol> 6. Hücreler ve Organellerin görüntüleme Dondurularak kurutulmuş bölümlerin yapısal görüntüleri ca elde edilir. -160 ° C gibi düşük doz, uygun yazılımı tarafından kontrol 2k x 2k yavaş tarama CCD kamera kullanarak dijital kaydedilen sıfır kayıp görüntüler. <ol><li> Hi-mag modunda EM etkinleştirin. </li><li> Seç ve görüntü ~ 2,000 X de (TIFF olarak, bakınız Şekil 2) Seçilen hücreler ve yerleri önceden kaydedilmiş depolanmıştır yüksek kaliteli bölümlerinde ilgi hücre içi alanları. (NOT: kurutulmuş bölümleri artık önemli ölçüde daha az kırılgan ve elektron ışın hasar daha az duyarlıdır. </li><li> X-ışını analizi için ilgi alanları (ROI) seçmek için görüntüleri değerlendirin. Bu adım, isteğe göre off-line bir şekilde ifa, EM açık olabilir ve bu durumda olabilirkapalı ve oda sıcaklığına kadar ısınmaya bırakıldı numune. </li></ol> 7. X-ray Spectra kazanılması X-ışını spektrumları herhangi biri kullanılarak kaydedilebilir birkaç ticari veya özel tasarlanmış X-ışını minimal bir enerji dağılımlı X-ışını (EDX) dedektörü, ilişkili darbe işlemcili elektronik ve uyumlu edinimi ve görüntüleme yazılımının oluşan analiz sistemleri. (Bu laboratuvarda kullanılan sistem, Tablo 1 &#39;de tarif edilmektedir.) <ol><li> , Sütunun (gerekirse) içine EDX detektörü sokulması amacı diyafram çekilmesi ve herhangi bir kaçak radyasyon deliklere sokulması ve merkezleme ile X-ışını edinimi için EM yapılandırma. Numunenin donma kirlenmesi önlenir olan en düşük sıcaklığa cryoholder ayarlayın, ancak en az -100 ° C altında </li><li> Sahibine dedektörün doğru 20 ° eğin. </li><li> Geniş alan görüntüleme koşulları altında ve bir bir individua matrisini analiz niyetinde varsayarakl mitokondri, analiz için mitokondriden seçtiğiniz alanın merkezine doğru hareket ettirin ve odaklanır. </li><li> (Bazı mikroskoplar sadece ikinci kondansatör odağını kullanarak ışın yakınsama) nokta moduna gidin ve 100 nm noktaya (bir Faraday fincan veya benzeri ile ölçüldüğü gibi). 3 nA ca ışın akımını arttırmak. </li><li> Spektrum toplama yazılımı başlatın ve ekran monitör üzerinde canlı zaman izlenebilir 100 sn satın almalar, başlar. Kaydedilen spektrumu (Şekil 2) kaydedin. Endüstri standardı EMSA biçimi tercih edilmektedir. </li><li> EM kapatın ve (çevrimdışı) analizi iş istasyonu birden spektrumları dosya (lar) aktarmak. </li></ol> 8. X-ray Spectra Analizi Kalitatif analiz Bir EDX spektrumu (Şekil 2, ek), esas olarak, enerji vs X-ışını yoğunluğunun bir xy grafiğidir. Spectra t elementel kompozisyon ilgili niceliksel ve niteliksel bilgileri içerirBir tepe &quot;karakteristik&quot; enerji yoğunluğu o elementin miktarını yansıtır ederken zirveye sebebiyet veren elemanını tanımlayan o, hacim analiz. Karakteristik tepe noktaları, yavaş değişen bir arka plan, &quot;süreklilik&quot; üstüne binmek. (Şekil 2 &#39;ye gösterge ayrıca EDX spektrumu belirgin bilgilerini ele almaktadır.) Tüm periyodik tablonun için zirve manifoldların enerji elemanlarının iyi bilinen elektronik yapısı, otomatik bileşenlerini tanıtan bir veritabanına böylece tüm EDX yazılım bağlantıları ile tanımlanır Bir analit. Fizyolojik bağlamda, EDX analizi için de uygundur genel ilgi elemanları Na (1.04 keV da K α), P (2.01 keV), K (3.31 keV) ve Ca (3.69 keV) içerir. <ol><li> Spektrasındaki önemli unsurları tanımlamak için mevcut yazılım veritabanı ve zirve eşleşen rutinleri yararlanın. Biyolojik bir örnekte Na, Mg, P, S, Cl, K, ve Ca için zirveleri bulmak için bekliyoruz. (DİKKAT:Son iki unsur örtüşüyor!) </li></ol> Kantitatif analiz EDX spektrumlarının kantitatif analiz ile piklerin entegre alanını ekstre edilmesi ve bir konsantrasyona kadar, bu değer dönüştürme oluşur. Biyolojik analiz için, kurulu bir yaklaşım (yukarıda ve Şekil 2&#39;de tanımlanan) süreklilik yoğunluğu analiz hacminin kuru kütlesine bağlı olarak orantılı olduğu gerçeğinden yararlanır Hall tepe / sürekli yöntem 4,7,10, olup . Bilinen bileşimin standartları spektrumları aynı oran ile karşılaştırıldığında Böylece, pik alanı / sürekli alanının oranı, hedeflenen hücre bölmesine konsantrasyonunu belirtir. Bu yaklaşım, genellikle mmol / kg kuru ağırlığı olarak ifade edilen ağırlık başına mol birimlerinde konsantrasyonlarını içerir unutmayın. Bu birim, sıra dışı ve yorumlanması için EL tarif edildiği gibi, örneğin, mmol / L veya ıslak ağırlık mmol / mg protein, ek dönüştürme gerektirebilir4,10 sewhere. <ol start="2"><li> Z = 10-20 arasında biyolojik elemanları (0,5-4,0 keV) &#39;in doruk alanlarının (ve hata tahminleri) ekstrakte örneğin, Na, Mg, P, S, Cl, K, Ca, analiz yerleşik fitingin rutinleri birini kullanarak yazılım (özellikle 4 dipnot, Tablo 1). Bu laboratuvar Simplex veya çok az kareler uydurma kullanır. Bu uydurma K ve Ca zirveleri arasındaki örtüşme (bkz. Şekil 2) çözümünde dikkat gerektirdiğini unutmayın. </li><li> 1,45-1,61 keV arasındaki süreklilik içinde kaynaştıran. Alternatif parazitsiz bölgeleri kullanılabilir. </li><li> Standartlara kıyasla daha sonra pik / süreklilik oranları ve konsantrasyonları hesaplayın. Analiz boyunca hataları yaymak. </li><li> Biyolojik farklılıkları yansıtmaktadır ortalamalarını tahmin standart istatistiksel yazılım ve formülleri kullanın. </li></ol>

<ol><li>Aronova, M. A., Kim, Y. C., Pivovarova, N. B., Andrews, S. B., Leapman, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+EFTEM+mapping+of+near+physiological+calcium+concentrations+in+biological+specimens%5BTitle%5D)+AND+%22Ultramicroscopy%22%5BJournal%5D)">Quantitative EFTEM mapping of near physiological calcium concentrations in biological specimens.</a> Ultramicroscopy. 109, 201-212 (2009).</li>
<li>Aronova, M. A., Leapman, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elemental+mapping+by+electron+energy+loss+spectroscopy+in+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Elemental mapping by electron energy loss spectroscopy in biology.</a> Methods Mol. Biol. 950, 209-226 (2013).</li>
<li>Bezprozvanny, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+signaling+and+neurodegenerative+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Mol.+Med%22%5BJournal%5D)">Calcium signaling and neurodegenerative diseases.</a> Trends Mol. Med. 15, 89-100 (2009).</li>
<li>Fernandez-Segura, E., Warley, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+probe+X-ray+microanalysis+for+the+study+of+cell+physiology%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Electron probe X-ray microanalysis for the study of cell physiology.</a> Methods Cell Biol. 88, 19-43 (2008).</li>
<li>Gibson, G. E., Starkov, A., Blass, J. P., Ratan, R. R., Beal, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cause+and+consequence%3A+Mitochondrial+dysfunction+initiates+and+propagates+neuronal+dysfunction%2C+neuronal+death+and+behavioral+abnormalities+in+age-associated+neurodegenerative+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">Cause and consequence: Mitochondrial dysfunction initiates and propagates neuronal dysfunction, neuronal death and behavioral abnormalities in age-associated neurodegenerative diseases.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1802, 122-134 (2010).</li>
<li>Leapman, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+techniques+in+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Novel techniques in electron microscopy.</a> Curr. Opin. Neurobiol. 14, 591-598 (2004).</li>
<li>LeFurgey, A., Bond, M., Ingram, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Frontiers+in+electron+probe+microanalysis%3A+application+to+cell+physiology%5BTitle%5D)+AND+%22Ultramicroscopy%22%5BJournal%5D)">Frontiers in electron probe microanalysis: application to cell physiology.</a> Ultramicroscopy. 24, 185-219 (1988).</li>
<li>Newbury, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+new+X-ray+mapping%3A+X-ray+spectrum+imaging+above+100+kHz+output+count+rate+with+the+silicon+drift+detector%5BTitle%5D)+AND+%22Microsc.+Microanal%22%5BJournal%5D)">The new X-ray mapping: X-ray spectrum imaging above 100 kHz output count rate with the silicon drift detector.</a> Microsc. Microanal. 12, 26-35 (2006).</li>
<li>Pierson, J., Vos, M., McIntosh, J. R., Peters, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perspectives+on+electron+cryotomography+of+vitreous+cryo-sections%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Electron+Microsc%22%5BJournal%5D)">Perspectives on electron cryotomography of vitreous cryo-sections.</a> J. Electron Microsc. 60, S93-S100 (2011).</li>
<li>Pivovarova, N. B., Hongpaisan, J., Andrews, S. B., Friel, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Depolarization-induced+mitochondrial+Ca+accumulation+in+sympathetic+neurons%3A+spatial+and+temporal+characteristics%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Depolarization-induced mitochondrial Ca accumulation in sympathetic neurons: spatial and temporal characteristics.</a> J. Neurosci. 19, 6372-6384 (1999).</li>
<li>Pivovarova, N. B., Nguyen, H. V., Winters, C. A., Brantner, C. A., Smith, C. L., Andrews, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Excitotoxic+calcium+overload+in+a+subpopulation+of+mitochondria+triggers+delayed+death+in+hippocampal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Excitotoxic calcium overload in a subpopulation of mitochondria triggers delayed death in hippocampal neurons.</a> J. Neurosci. 24, 5611-5622 (2004).</li>
<li>Ritchie, N. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spectrum+simulation+in+DTSA-II%5BTitle%5D)+AND+%22Microsc.+Microanal%22%5BJournal%5D)">Spectrum simulation in DTSA-II.</a> Microsc. Microanal. 15, 454-468 (2009).</li>
<li>Stanika, R. I., Winters, C. A., Pivovarova, N. B., Andrews, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+NMDA+receptor-dependent+calcium+loading+and+mitochondrial+dysfunction+in+CA1+vs.+CA3+hippocampal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol.+Dis%22%5BJournal%5D)">Differential NMDA receptor-dependent calcium loading and mitochondrial dysfunction in CA1 vs. CA3 hippocampal neurons.</a> Neurobiol. Dis. 37, 403-411 (2010).</li>
<li>Zhang, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+visualization+of+receptor+arrays+in+frozen-hydrated+sections+and+plunge-frozen+specimens+of+E.+coli+engineered+to+overproduce+the+hemotaxis+receptor+Tsr%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microsc%22%5BJournal%5D)">Direct visualization of receptor arrays in frozen-hydrated sections and plunge-frozen specimens of E. coli engineered to overproduce the hemotaxis receptor Tsr.</a> J. Microsc. 216, 76-83 (2004).</li>
</ol>

Yazarlar Çıkar çatışması rapor.

Elektron mikroskobu tabanlı bir analitik yöntem, burada sunulan saptama, tanımlama ve Na, K, P, Ca ve özellikle de dahil olmak üzere biyolojik ilgi çeşitli elemanları, miktar tayini için olanak sağlar. Bu analizler, hücre içi de gerçekleştirilebilir, yani, intra-organel, hızlı bir şekilde dondurulmuş numuneler hazırlanmış kriyo seksiyonlarda yüksek kaliteli görüntüler ilgi yapıları bulmak ve tespit etmek yeteneği sayesinde çözünürlük. Boyanma dokusu elemanlarının yer nicel olarak korunur bile, geleneksel olarak...

Kalsiyum iyonları sinaptik iletimi ve gen ifadesi olarak çeşitli normal süreçlerde önemli bir rol oynuyor, belki biyolojideki en önemli ve çok yönlü hücre sinyal varlık vardır. Öte yandan, kalsiyum hücre ölümünde de eşit derecede önemlidir. Özellikle, kalsiyum serbestleşme inme nöronal yaralanmaya önemli bir faktördür, Parkinson hastalığı, Alzheimer ve diğer nörodejeneratif hastalıklar 3,5. Böylece, kalsiyum hücre içinde nasıl dağıtıldığı kantitatif anlamak için son derece önemlidir ve nasıl bu fizyolojik veya patofizyolojik uyaranlara aşağıdaki değiştirir. Çözelti içinde serbest veya bir substrata bağlanmış - - ve hücresel kalsiyum konsantrasyonları stimülasyon bir sonucu olarak, birkaç büyüklük içinde değişebilir, bu amaç, kalsiyum dinamik olarak iki fiziksel durumlar arasında dağıtılır gerçeği ile karmaşıktır. Fr analizi için çeşitli yöntemler gelişmiş olsa da,hücre içi kalsiyum ee, tanımlanmış hücre içi bölümlerinde toplam kalsiyum konsantrasyonları belirlenmesi gerçekçi bir yaklaşımda, yani elektron probu mikroanaliz (EPMA) ile sınırlıdır. EPMA bu çiftler, bir transmisyon elektron mikroskobu (TEM) ile bir X-ışını spektrometresi bir tekniktir. TEM elektron tabancası ilgi ve elektron bombardımanı sonucunda yayılan eleman özgü X-ışınları bir alt hücresel bölgede sabit, Mikronaltı elektron prob odaklanır (ayrıntılı teknik değerlendirmeleri için başvurular 7, 4&#39;e bakın) toplanır ve analiz edilir. EPMA Avantajları tek organel düzeyinde çözünürlüğe ve submillimolar hassasiyet vardır. Ancak uygulamada, EPMA numune hazırlanması ve analizi için özel cryotechniques ve aletleri gerektirir. Burada, araçlar, teknikler ve EPMA kullanılarak hücre içi kalsiyum ölçümleri için uygun araçlar açıklanmıştır. Intramitokondriyal kalsiyum özel i olankritik rol nedeniyle nterest bu nörodejeneratif hastalıklarda mitokondriyal kalsiyum aşırı çalış.

<table><tr><tbody><td colspan="4">REAKTİSLER/MALZEMELER</td></tr><tr><td>Thermanox plastik lameller</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>72280</td><td></td></tr><tr><td>Kültür ekleri</td><td>BD Falcon</td><td>353090</td><td>6 oyuklu plakalar için</td></tr><tr><td>Cryopins</td><td>Leica Microsystems</td><td>16701952</td><td>Yivli</td></tr><tr><td>Ahşap aplikatörler</td><td>EM Sciences</td><td>72300</td><td></td></tr><tr><td>Katlanır EM ızgaraları</td><td>Ted Pella</td><td>4GC100/100</td><td>100 gözenekli</td></tr><tr><td>İndiyum folyo</td><td>Alfa Aesar</td><td>13982</td><td>0,25 mm kalınlık</td></tr><tr><td colspan="4">EQUIPMENT</strong</td></tr><tr><td>>Plunge dondurma cihazı</td><td>Leica Microsystems</td><td>KF-80</td><td></td></tr><tr><td>Slam dondurma cihazı</td><td>LifeCell</td><td>CF-100</td><td></td></tr><tr><td>Ultramikrotom</td><td>Leica Microsystems</td><td>UC6</td><td></td></tr><tr><td>Mikrotom için kriyo eki</td><td>Leica Microsystems</td><td>FC6</td><td></td></tr><tr><td>Elmas kriyotrim aleti</td><td>Diatome</td><td>Cryotrim 45</td><td></td></tr><tr><td>Elmas kriyobıçak</td><td>Diatome</td><td>Cryo 35</td><td></td></tr><tr><td>Antistatik cihaz</td><td>Diatome</td><td>Hauf Statik Çizgi</td><td></td></tr><tr><td>Kriyo elektron mikroskobu</td><td>Carl Zeiss Mikroskopi</td><td>EM912 Omega</td><td></td></tr><tr><td>EM kriyo numune tutucu</td><td>Gatan</td><td>CT3500</td><td></td></tr><tr><td>Yavaş taramalı CCD kamera, 2k x 2k</td><td>Troendle (TRS)</td><td>Sharpeye</td><td></td></tr><tr><td>Görüntü elde etme yazılımı</td><td>Olympus SIS</td><td>iTEM suite</td><td></td></tr><tr><td>ED x-ray dedektörü</td><td>Oxford Instruments</td><td>Linksystem Pentafet</td><td></td></tr><tr><td>Darbe İşlemcisi</td><td>Oxford Instruments</td><td>XP-3</td><td></td></tr><tr><td>PCI arka paneli kart</td><td>4pi Sistemleri</td><td>Spektral Motor II</td><td></td></tr><tr><td>Masaüstü bilgisayar</td><td>Apple</td><td>Herhangi bir OS9 uyumlu model</td><td></td></tr><tr><td>X-ışını analiz yazılımı</td><td>NIST</td><td>DTSA, DTSA II</td><td></td></tr><tr><td>Elektronik tablo yazılımı</td><td>Microsoft</td><td>Excel</td><td></td></tr><tr><td colspan="4"> <ol> <li>CF100 artık ticari olarak satılmamaktadır, ancak makine birçok akademik tesiste mevcuttur ve komple makineler veya parçalar on-line olarak bulunabilir.</li> <li>CT3500 kriyotransfer tutucu için bir video eğitimi şu adreste mevcuttur: <a href="http://www.gatan.com/files/Movies/CT3500_Cryo_transfer_holder.mp4" target="_blank">http://www.gatan.com/files/Movies/CT3500_Cryo_transfer_holder.mp4</a>.</li> <li>SEII artık kullanılmıyor; Evrensel Spektral Motor Karşılaştırılabilir işlevselliğe sahip daha sonra, PC uyumlu bir üründür. 4PI üretimi ve satışı durdurdu ancak yine de teknik müşteri desteği sağlıyor. Kullanılmış sistemler genellikle çevrimiçi olarak bulunur.</li> <li>Orijinal DTSA artık kullanılmamaktadır. NIST, kamuya açık alanda güncellenmiş bir halef olan DTSA II'yi 12 (<a href="http://www.nist.gov/mml/mmsd/software.cfm" target="_blank">http://www.nist.gov/mml/mmsd/software.cfm</a>)</li> </ol> </td></tr></tbody></table> sunar

elektron probe x-ışını mikroanaliz tarafından nöronlar toplam kalsiyum Ölçümü

Measurement of Total Calcium in Neurons by Electron Probe X-ray Microanalysis

Bu yazıda Electron Probe Micro (EPMA) olarak bilinen teknik kullanılarak araçlar, teknikler ve hücre içi element içeriği nicel ölçümü için uygun bir alet açıklanmaktadır. Intramitokondriyal kalsiyum nedeniyle mitokondriyal kalsiyum aşırı nörodejeneratif hastalıklarda oynadığı kritik rolü belli bir odak noktasıdır. Yöntem, X-ışınları analizi örnek ile bir elektron ışını etkileşimi ile bir elektron mikroskobu (EM) oluşturulur dayanmaktadır. Elektron mikroskobu örneklerinde yayılabilir elemanlarının yerel bir dağılımının muhafaza edilmesi için, ultra ince EPMA cryosections hazırlanması ve ardından doku &quot;cryofixation&quot; gerektirir. Kültürlenmiş hücreler ya da Organotipik dilim kültürlerinin hızlı dondurma sırasıyla soğuk metal bloğun karşı sıvı etan veya çarpma dondurma ile dondurma dalma ile gerçekleştirilir. Kriyokesitler nominal kalınlığında 80 nm ca bir elmas bıçakla kuru kesilir. -16076, C, karbon / pioloform kaplı bakır ızgaralar üzerine monte edilmiş ve özel bir cryospecimen tutucu kullanarak cryo-EM içine cryotransferred. C ve düşük elektron doz ≤ ° -160 görsel ve diğer yer haritalama sonra, dondurulmuş hidratlanmış cryosections dondurularak kurutuldu, ~ 30 dakika boyunca 100 ° C altındadır. Kuru cryosections of organel düzey görsel yavaş tarama CCD kamera ve analiz için seçilen ilgi hücre içi bölgeleri ile, aynı zamanda, düşük bir dozda, kaydedilir. Bir sabit, odaklanmış, yüksek yoğunluklu elektron probu ile ROI yayılan X-ışınları, bir enerji dağıtıcı X-ray (EDX) ilişkili elektroniği tarafından işlenir spektrometresi, ve bir X-ışını spektrumu olarak sunulan toplanır, yani, bir enerji vs X-ışını yoğunluğu arsa. Ek yazılım kolaylaştırır: onların &quot;karakteristik&quot; pik enerjileri ve parmak izi ile elemental bileşenlerin 1) kimlik ve pik alanları / arka plan çıkarma 2) kantitatif analizi. Bu kağıt tipik gösteren iki örnek ile sona eriyorMitokondriyal kalsiyum analizi iskemi direncinin temelini ortaya eksitotoksik yaralanmalara ve diğerinin mekanizmaları önemli bir fikir temin edilen bir hangi EPMA uygulamaları.

Beyin hücreleri tipik olarak işemik koşulları altında ortaya çıkar ve patolojik sinir-iletici salıverilmesinde bir sonucu olarak eksitotoksik incinme. EPMA kalsiyum büyük miktarda ayırmak için nöronal mitokondri yeteneği yaralanma mekanizmasının temelini nasıl keşfetmek için kritik oldu. Şekil 3'teki elektron mikrografı hızlı bir eksitotoksik uyarıcı (100 uM NMDA) ile 30 dakika maruz kaldıktan sonra dondurulabilir kültürlenmiş hipokampal nöronlar dondurularak kurutulmuş cryosections mitokondri görünümün...

Bu kağıt fizyolojik tanımlanan biyolojik numunelerde subselüler çözünürlükte toplam kalsiyum içeriği ve dağılımı kantitatif ölçümüne cryoanalytical elektron mikroskobu uygulamasını açıklar.

Elektron Probe X-ışını Mikroanaliz tarafından Nöronlar Toplam Kalsiyum Ölçümü

In this article the tools, techniques, and instruments appropriate for quantitative measurements of intracellular elemental content using the technique ...

Bu prosedürün genel amacı, kültürlenmiş nöronlarda hücre altı çözünürlükte kalsiyum gibi biyolojik olarak önemli elementlerin konsantrasyonunu kantitatif olarak ölçmek için analitik elektron mikroskobu kullanmaktır. Bu, önce canlı hücre kültürlerinin hızlı bir şekilde dondurulması ve ultra ince kriyo bölümlerinin hazırlanmasıyla gerçekleştirilir. İkinci adım, kriyo kesitlerini analitik bir elektron mikroskobuna aktarmak ve dondurarak kurutmaktır.Sonraki görüntüler ve x-ışını spektrumları, nöronal mitokondri dahil olmak üzere seçilmiş hücre altı bölgelerden gereklidir. Son adım, lokalize element konsantrasyonlarını belirlemek için x-ışını spektrumlarını kantitatif olarak analiz etmektir. Sonuç olarak, EPMA olarak bilinen bu yaklaşım, hücre içi kalsiyum sinyallemesinin altında yatan kalsiyum konsantrasyonları ve dağılımındaki değişiklikleri ortaya çıkarmak için kullanılır.Bu tekniğin floresan, mikroskopi, radyoizotop alımı veya alev fotometrisi gibi ilgili yöntemlere göre ana avantajı, tek organel düzeyinde çözünürlük ve milimolar altı hassasiyettir. Prosedürü göstermek, laboratuvarımızda kıdemli bir personel bilim adamı olan Dr.Natalia pva olacaktır. Başlamak için, sıvı nitrojen soğ

measurement-total-calcium-neurons-electron-probe-x-ray

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Biz intrasellüler serbest kalsiyum konsantrasyonu ve sinaptik etkinliği değişiklikleri eşzamanlı bir ganglion hazırlanmasında nasıl takip edilebileceğini...

Mollusk içinde hücre içi kalsiyum konsantrasyonu ve Synaptic Etkinliği İzlenmesi Değişiklikler<em&gt; Aplysia&#39;nın</em

Bu video, kalsiyum görüntülemenin arkasındaki kavramları tanıtır ve kalıplanmış agaroz kuyularında bulunan solucanların hızlandırılmış görüntülemesi için örnek bir protokol içerir.

Kalsiyum Görüntüleme: Canlı C. elegans'ta Nöral Aktiviteyi Görselleştirmek İçin Bir Yöntem

Onun küçük şeffaf gövde, iyi belgelenmiş nöroanatomi ve müsait genetik teknikler ve reaktiflerin bir dizi...

C. vivo Nöronal Kalsiyum Imaging&#39;de elegans

Prosedürler, membran potansiyelinin veya akımının eşzamanlı kayıtlarını ve hücre içi kalsiyum konsantrasyonundaki değişiklikleri gerçekleştirmek için tanımlanır. Suprakiazmatik çekirdek nöronları, tüm hücre yama kelepçesi konfigürasyonunda bir yama kelepçe elektrodu kullanılarak kalsiyum indikatörü bis-fura-2 ile doldurulur.

Eşzamanlı Elektrofizyolojik Kayıt ve Suprakiazmatik Nucleus Nöronlar Kalsiyum Görüntüleme

Biz bütün hücreli yama-kelepçe kayıtları ve Ca2 + geçişler akut beyin dilimleri içinde nöronal dendrites kaydetmek için iki fotonlu Imaging birleştiren bir yöntem mevcut.

Nöronal Dendrites beyin dilimleri içinde iki fotonlu kalsiyum görüntüleme

Floresan kalsiyum görüntülemeile in situ hibridizasyonunu birleştiren ve deneycinin kalsiyum aktivitesi modellerini tek hücreli düzeyde gen ekspresyonu profilleriyle ilişkilendirmesine olanak tanıyan iki parçalı bir protokol salıyoruz.

Xenopus laevis'te Nöronal Öncül Karakterizasyonu için Floresan Kalsiyum Görüntüleme ve Daha Sonra Yerinde Hibridizasyon

Sinaptik iletim için gerekli olan hücre altı olayları görselleştirmek için iki ilgili yöntem tanımlanmıştır. Bu protokoller, in vitro kültürlü nöronların canlı hücre görüntülemesini kullanarak presinaptik kalsiyum akışı ve sinaptik vezikül membran füzyonunun dinamiklerinin gerçek zamanlı olarak izlenmesini sağlar.

Amiyotrofik Lateral Skleroz Modellerinde Sinaptik Fonksiyonların Gerçek Zamanlı Floresan Ölçümü

Protokol, kesilmiş sinirden fare motor sinir terminallerine floresan kalsiyum boyası yükleme yöntemini açıklar. Ek olarak, konfokal mikroskopi kullanarak periferik sinir uçlarındaki hızlı kalsiyum geçicilerini kaydetmek için benzersiz bir yöntem sunulmuştur.

Konfokal Mikroskopi Kullanılarak Fare Nöromüsküler Kavşağında Yüksek Zamansal Çözünürlükte Kalsiyum Geçici Maddelerinin Kaydı

Mevcut yöntemler, kolayca bulunabilen genetik olarak kodlanmış kalsiyum göstergelerini kullanarak Caenorhabditis elegans'ta in vivo olarak yüksek çözünürlüklü, sub-kompartmanlı kalsiyum görüntüleme için orantılı olmayan bir yaklaşımı tanımlamaktadır.

Nöronal Kalsiyum Kullanımının In Vivo Subsellüler Görüntülemesi

Önerilen protokol, multimodal analizler kullanarak kemik rejenerasyonu bağlamında kemik oluşumunu değerlendirmek için küresel bir yaklaşım gerektirmektedir. Yeni kemik oluşumu hakkında kalitatif ve kantitatif bilgi sağlamayı, temel ve klinik öncesi araştırmaların titizliğini ve geçerliliğini artırmayı amaçlar.

Ex Vivo Modelde Doku Mineralizasyonunun Kapsamlı Karakterizasyonu

Öğrenin EPMA yöntemiyle kültüre edilmiş nöronlarda mitokondri düzeyinde kalsiyum konsantrasyonunu ölçmeyi. Bu teknik hücre içi kalsiyum sinyalleşmesini incelemek için yüksek çözünürlüklü element analizi sağlar.

Elektron Probe X-ışını Mikroanaliz tarafından Nöronlar Toplam Kalsiyum Ölçümü

Daha fazla video keşfet