Potenziale di membrana Dye Imaging di ventromediale dell'ipotalamo neuroni da topi adulti per studiare glucosio Sensing

L'obiettivo generale di questa procedura è valutare il rilevamento del glucosio nei neuroni ipotalamici ventrali mediali o VMH di topi più anziani, utilizzando il colorante sensibile al potenziale di membrana come indice di attività neuronale. Ciò si ottiene eseguendo prima la perfusione cardiaca per eliminare il sangue dal cervello di un topo anestetizzato prima della rimozione del cervello. Il secondo passo consiste nel creare fette di cervello coronale e sezionare il VMH.

Successivamente, i neuroni VMH vengono dissociati e coltivati su vetrini. Il passaggio finale consiste nel misurare la fluorescenza dei neuroni quando il glucosio diminuisce in presenza di un colorante potenziale di membrana. In definitiva, ogni cambiamento di neuroni nella fluorescenza viene utilizzato per quantificare la risposta di quel neurone inibito dal glucosio ai cambiamenti del glucosio.

Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come l'elettrofisiologia, è la capacità di studiare i neuroni di un topo adulto. Questo ci permette di studiare gli stati patologici in età adulta. Iniziare questa procedura posizionando il cervello sezionato sul mandrino nella camera Vibram con il Vibram impostato su bassa velocità al livello due e alta ampiezza al livello nove, tagliare le fette a 300-500 micron fino a raggiungere l'area ipotalamica.

Quindi tagliare fette sottili a 100 micron dalla parte posteriore a quella anteriore per isolare la precisa regione VMH. Prestare molta attenzione ai cambiamenti anatomici a bgma meno 2,30 millimetri. Il terzo ventricolo è separato in sezioni dorsale e ventrale. Corona.

Una volta che le sezioni trasversali del fusibile del terzo ventricolo hanno tagliato due fette da 500 micron, queste fette conterranno la regione corretta di VMH. Trasferire queste fette in una capsula di Petri su ghiaccio contenente terreni di coltura. Quindi seziona il VMH.

Utilizzare una pipetta per trasferire delicatamente i pezzi VMH in millilitri di terreno di coltura su ghiaccio. In questa fase, rimuovere il terreno di coltura contenente il VMH dal ghiaccio e lasciare acclimatare a temperatura ambiente. Aggiungere 20 unità per millilitro di pape a quattro millilitri di terreno di coltura, quindi capovolgere per mescolare e porre in un bagnomaria a 34 gradi Celsius Controllare e mescolare per inversione ogni minuto fino a quando il terreno di digestione non è più torbido.

Successivamente, filtrarlo in un pallone sterile e trasferire il fazzoletto nel mezzo di digestione. Successivamente, digerire il tessuto agitando a 100 giri/min a 34 gradi Celsius per 30 minuti. Durante la digestione, preparare un millilitro di terreno contenente l'8% di albumina sierica bovina sciogliendo 80 milligrammi di BSA in un millilitro di terreno di coltura e filtrandolo in una provetta conica.

Lavare il tessuto trasferendolo in cinque millilitri di terreno di coltura in una provetta conica e capovolgendolo lentamente. Una volta dopo, aggiungere 30 microlitri di enzima del DNA a sei millilitri di coltura, terreno e mescolare per ottenere terreni di coltura. Quindi aspirare il mezzo di lavaggio e aggiungere tre millilitri di mezzo di cottura.

Usa le pipette di vetro per tritrare delicatamente 10 volte nell'ordine dal più grande al più piccolo, quindi attendi quattro minuti affinché i pezzi più grandi si depositino. Quindi, utilizzare la seconda pipetta per trasferire i due millilitri superiori contenenti la sospensione cellulare dissociata in una nuova provetta conica. Aggiungere due millilitri di tri media tri 10 volte e attendere tre minuti.

Utilizzare la terza pipetta per trasferire i due millilitri superiori nella sospensione cellulare. Successivamente, aggiungi un millilitro di tri media tri rate cinque volte e attendi due minuti. Utilizzare la quarta pipetta per trasferire i due millilitri superiori nella sospensione cellulare.

Ora sovrapponi la sospensione cellulare dissociata sopra l'8% di BSA, facendo attenzione a non mescolarli. Quindi centrifugato a 1000 giri/min per cinque minuti. Posizionare quindi i cilindri di clonazione dell'autoclave di sei per otto millimetri al centro di ogni vetrino coprioggetto completamente asciutto.

Quindi aspirare e risospendere il pellet in 440 microlitri di terreno di coltura caldo. Successivamente, riempire i cilindri di clonazione con la sospensione neuronale e metterla nell'incubatrice per 20 minuti. Rimuovete i cilindri di clonazione e lavate via i detriti molto delicatamente.

Quindi riempire ogni piatto con due millilitri di terreno di coltura e lasciare che le cellule si riprendano per almeno un'ora prima di eseguire qualsiasi test In questa procedura, preparare la soluzione di registrazione e regolare il pH a 7,4. Ora aggiungi quattro millilitri di tampone a temperatura ambiente a una miscela di fiale di MPD blu e aggiungi cinque microlitri di colorante per millilitro di soluzione di registrazione. Successivamente, incubare le cellule in due millilitri di soluzione di registrazione del glucosio da 2,5 millimolari con colorante a 34 gradi Celsius per 30 minuti al riparo dalla luce.

Quindi riempire le pompe a siringa con una soluzione di registrazione del glucosio da 2,5 o 0,1 millimolari e il sistema a profusione con una soluzione di registrazione del glucosio da 2,5 millimolari. Collegare il tubo da siringhe da 60 millilitri a un collettore. Il tubo di uscita del collettore deve essere collegato a un riscaldatore in linea, quindi a un tubo in polietilene, che viene quindi collegato a una camera chiusa.

Elimina le bolle eseguendo il sistema di perfusione e picchiettando con un oggetto duro, se necessario. Quindi impostare il tasso di perfusione a 0,5 millilitri al minuto e utilizzare la minima luce per il minor tempo possibile per configurare il sistema. Quindi, trasferire un vetrino coprioggetto da 25 millimetri con neuroni aderenti nella camera chiusa.

Facendo attenzione a non far asciugare il vetrino e a non introdurre bolle d'aria. Allineare lo slip nelle scanalature del pezzo inferiore. Posizionare un paio di gocce di soluzione di registrazione lungo i lati e inserire delicatamente la parte superiore per tenere in posizione il vetrino coprioggetto.

Quindi utilizzare un contagocce per riempire la camera con la soluzione di registrazione e posizionare sopra un vetrino coprioggetto da 18 millimetri. Inserire delicatamente l'anello bianco nella camera per tenere in posizione il vetrino coprioggetti più piccolo. Dopodiché, premere l'anello bianco molto lentamente e leggermente per evitare che le bolle d'aria vengano introdotte nella camera chiusa.

Avviare la pompa a siringa per la soluzione di registrazione del glucosio da 2,5 millimolari. Quindi premere sull'anello bianco e collegarlo alla camera chiusa. Rilasciare lentamente la pressione dall'anello bianco e collegarlo al tubo che porta a un contenitore per rifiuti.

Per l'MPD Imaging Center, i neuroni utilizzano una luce a basso campo luminoso. Cerca di ridurre al minimo la quantità di tempo in cui le celle vengono esposte alla luce e lascia che il sistema di perfusione funzioni per 10 minuti per stabilizzare la temperatura, la messa a fuoco e l'equilibrio del die durante l'adescamento. Apri il programma METAMORPH e scatta un'immagine in campo chiaro dei neuroni con un ingrandimento di 10 volte.

Usa la funzione di messa a fuoco automatica per scattare tre pile di immagini fluorescenti e determinare la messa a fuoco entro cinque micron. Al termine del periodo di adescamento di 10 minuti, controllare nuovamente la messa a fuoco, quindi iniziare a registrare immagini fluorescenti ogni 30 secondi per 40 minuti. Stabilire una linea di base a 2,5 millimolari di glucosio per 10 minuti.

Quindi diminuire il glucosio per 15 minuti e infine tornare a 2,5 millimolari di glucosio per 15 minuti. Dopo aver registrato tutte le immagini fluorescenti, scatta un'immagine in campo chiaro dei neuroni. Questa figura mostra un'immagine in campo chiaro dei neuroni VMH sani di un topo adulto.

Questa immagine è stata scattata 24 ore dopo la dissociazione ed è stata utilizzata per l'imaging MPD. Alcuni esempi di neuroni che verrebbero o non verrebbero utilizzati per l'analisi sono contrassegnati come mostrati. Ecco le tracce di fluorescenza MPD rappresentative di un neurone GI indicato dal verde e di un neurone non GI indicato dall'arancione Le cellule sono state perfuse con una soluzione di registrazione del glucosio 2,5 millimolare per 10 minuti, seguita da una diminuzione a 0,1 millimolari G per 15 minuti e un ritorno a 2,5 millimolari G per 15 minuti.

Questa figura mostra la percentuale dei neuroni VMH adulti, che si depolarizzano in modo reversibile in risposta alla diminuzione del glucosio rilevata utilizzando l'imaging MPD fluorescente. L'entità della variazione del glucosio è correlata positivamente con la percentuale di neuroni depolarizzanti che seguono questa procedura. Altri metodi, come la R-T-P-C-R a singola cellula, possono essere eseguiti per identificare proteine specifiche espresse dai neuroni sensibili al glucosio.