Görüntüleme Hücre Membran Hasarı ve Onarımı ilgilendim hücrealtı Süreçleri

Aşağıdaki deneyin genel amacı, istenen uygulamaların hasarlı hücrelerin onarımı üzerindeki etkisini gözlemlemek ve hasarlı hücrelerin onarılmasına yardımcı olan hücresel alt süreçleri incelemektir. Bu işlem, sağlam hücre membranlarını geçemeyen floresan boyaların varlığında hücrelere zarar verilerek, hasarlı hücrelerin bu boyaların girişini engelleme yeteneği ve kinetiği değerlendirilerek gerçekleştirilir. İkinci bir adım olarak, ilgilenilen bir hücresel bölmenin hasarlı hücre membranına kaynaşarak onarıma katılma yeteneğini belirlemek için, hasarlı hücre membranında hücre içi proteinlerin ortaya çıkışını izleriz.

Ardından, hasarın kinetiğini izlemek amacıyla, ilgili hücresel kompartmanların hasarlı hücre membranı ile füzyonunu gözlemleriz. Bu kompartmanın tetiklenmiş füzyon sonuçları; hasarlı hücre yüzeyinde lizozom ilişkili membran proteini birinin artan görünürlüğü ve hasarlı hücreler tarafından lizozomal içeriğin salgılanmasının canlı görüntülemesine dayanarak, hücre membranı hasarının onarımının lizozomal ekzositoz ile ilişkili olduğunu göstermektedir. Bu yöntemler, hücre hasarı ve onarımıyla ilgili önemli soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir.

Örneğin, bunlar hücre membranındaki fokal yaralanmalara hangi proteinlerin ve hücresel kompartmanların yanıt verdiğini belirlemek ve ardından bu yanıtın kinetiğini değerlendirmek için kullanılabilir. Prosedürü, laboratuvarımdaki doktora sonrası araştırmacılardan Aurelia D dört ve hamma stra iki uygulamalı olarak gösterecektir. Bu işlem, iyileşen yaralı hücreleri ve iyileşemeyenleri ayrı ayrı işaretlemek için yapılacaktır.

Hücreleri üç deneysel koşul için steril lameller üzerine ekleyin. Hücreleri %50 konfluens oranının üzerine ulaşana kadar kültüre edin, ardından C1 ve C2'yi 37 °C'de CIM ile iki kez yıkayın. C3'ü 37 °C'de PBS ile yıkayın.

Ardından lamelleri silikon O-ringlerin üzerine transfer edin. Uygun tampon içindeki önceden ısıtılmış fitzy dekstran çözeltisinden 100 µL ekleyin. Oda sıcaklığında lamelin üzerine 40 mg cam boncuk ekleyip lameli manuel olarak eğerek C1 ve C3'teki plazma membranına zarar verin.

Hafif yaralanma için 30 derecelik bir açıyla altı ila sekiz kez ileri geri kaydırılır. Örnekler arasındaki yaralanma tekrarlanabilirliğini artırmak için, cam boncukların düzgün bir şekilde dağıldığından emin olunarak aynı bölgelerin tekrar yaralanması minimize edilir. Boncukların daha fazla yuvarlanmasını önleyerek, karşılaştırılacak farklı örneklerin cam boncuk yaralanma işlemleri eş zamanlı olarak gerçekleştirilir.

Tüm lamelleri, ortam CO2 düzeyindeki 37 degrees Celsius sıcaklığındaki bir inkübatöre aktarın ve boncukların yuvarlanmasına izin vermeden onarım işleminin beş dakika boyunca sürmesini sağlayın. Cam boncukları ve fitzy dekstranı, tampon çözelti veya PBS ile yıkayarak uzaklaştırın. Şimdi lamelleri tekrar O-ring üzerine yerleştirin ve 100 µL önceden ısıtılmış lizin ekleyin.

Sabitleyici trissy dekstran çözeltisini, ortam CO2 düzeyinde 37 °C'de beş dakika boyunca inkübe edin. Lamelini önceden ısıtılmış CIM ile iki kez yıkayın ve iki PBS yıkamasının ardından oda sıcaklığında %4 PFA ile 10 dakika boyunca sabitleyin. Hersch boyasında iki dakika inkübe edin ve iki PBS yıkamasından sonra örneği montaj medyası kullanarak bir lam üzerine monte edin.

Ardından, C iki örneğindeki hücreleri bir epi floresan mikroskop kullanarak görüntüleyin. Arka plan kırmızı ve yeşil boyama yoğunluğunu belirleyin. Daha sonra, tüm örnekler için kırmızı ve yeşil kanalları eşiklemek için bu değeri kullanın.

Yeşil olan toplam hücre sayısını belirleyin. Ayrıca C1 ve C3 örneklerinde kırmızı olan veya hem kırmızı hem yeşil olan hücreleri belirleyin. Şimdi, her bir durum için 100'den fazla yeşil hasarlı hücreyi sayın ve onarımı başaramayan hücrelerin oranını, hasarlı tüm hücrelerin bir yüzdesi olarak ifade edin.

%50 konfluensin üzerine çıkmış hücreleri önceden ısıtılmış CIM ile yıkayın ve lamelini FM boyalı CIM içerisinde monte edin. 37 °C'de tutulan sahne üstü inkübatördeki bir tutucuya yerleştirin. Tutarlı ancak ölümcül olmayan bir hasar sağlayan optimal gücü kullanarak hücre membranının bir bölgesini seçin.

Bunu başarmak için örneği darbeli lazerle 10 milisaniyeden daha kısa bir süreyle ışınlayın. Hasar öncesinde başlayıp hasardan sonra üç ila beş dakika boyunca devam edecek şekilde; epi, floresan ve parlak alan modlarında her iki ila 10 saniyede bir izleme yapmak, onarımı gözlemlemek ve görüntüler elde etmek için lazer gücünü yazılım üzerinden tepe gücün %40 ila %50'sine düşürün. Onarım kinetiğini nicelleştirmek için hücresel FM boya floresanını ölçün.

Görüntüleme süresince yoğunluktaki değişimi hesaplayın. Her koşul için 10'dan fazla hücrenin verilerinin ortalamasını alın ve bunları ortalama değerler veya bireysel hücre değerleri olarak grafikleyin. C bir ve C iki lamelini yıkayın.

Kültür hazırlıkları 37 °C'de CIM ile gerçekleştirilir ve C3, 37 °C'de PBS ile yıkanır. Ardından numuneler silikon O-ringlere aktarılır. Önceden ısıtılmış 100 µL lizinle fikslenebilir trissy dekstran eklenir.

Daha önce gösterildiği gibi C1 ve C3 üzerindeki plazma membranına zarar verin. Ardından, boncukların daha fazla yuvarlanmasını önleyerek tüm lamelleri ortam CO2 konsantrasyonundaki 37 °C'lik bir inkübatöre aktarın ve onarımın beş dakika boyunca gerçekleşmesine izin verin.

Şimdi cam boncukları ve Trixie dekstranı uzaklaştırmak için lamelleri, cam boncukların hücreler üzerinde yuvarlanmadığından emin olarak soğuk büyüme ortamında yıkayın. Lamelleri soğuk büyüme ortamıyla iki kez durulayın ve C1 ve C3 O-ringlerine transfer edin. Soğuk komple büyüme ortamı içerisinde 100 µL rat anti-US lamp one antikoru ekleyin ve antikor bağlanmasını sağlamak için C2'ye soğuk komple büyüme ortamı ekleyin. Soğuk CIM ile üç yıkama yaptıktan sonra lamelleyi 4 °C'de 30 dakika inkübe edin.

Tüm lamelleri oda sıcaklığında 10 dakika boyunca %4 PFA ile sabitleyin. Ardından CIM ile üç kez durulayın. Sonrasında, tüm lamelleleri 15 dakika boyunca 100 µL bloklama çözeltisinde, ardından 15 dakika boyunca 100 µL 4 88 anti rat antikorunda inkübe edin.

PBS ile iki kez yıkayın ve iki PBS yıkamasının ardından oda sıcaklığında iki dakika boyunca her lekesinde inkübe edin. Numuneleri bir lam üzerine monte edin, ardından C iki hücrelerinin görüntülerini kullanarak epi floresan mikroskobu ile numuneleri görüntüleyin. Kırmızı ve yeşil kanallardaki spesifik olmayan arka plan boyanmasını belirleyin.

Tüm örnekler için kırmızı ve yeşil kanalları eşiklemek amacıyla bu arka plan boyama değerlerini kullanın. Yaralı hücrelerdeki lamp 1 boyamasının yoğunluğunu ölçmek için C1 ve C3'ten elde edilen 100'den fazla kırmızı etiketli hücreyi kullanın. Başarılı bir deneyde, C3'ten gelen lamp 1 boyamalı hücreler, C1'den gelen hücrelere göre anlamlı derecede daha düşük olacaktır. Lizozomları floresan boya ile etiketlemek için, %50 konfluense ulaşmış ve fitzi dextran içeren büyüme ortamında büyütülmüş hücreleri inkübe edin.

Dekstranın hücre kültürü inkübatöründe iki saat boyunca endositoze olmasına izin verin. Hücreleri önceden ısıtılmış büyüme besiyeri ile yıkayın ve görüntüleme öncesinde tüm endositoze olmuş dekstranın lizozomda birikmesini sağlamak için CO2 inkübatöründe iki saat boyunca bekletin. Lamelini önceden ısıtılmış CIM ile durulayın ve 37 derece Celsius'taki sahne üstü inkübatörde bulunan bir lamel tutucuya CIM ile monte edin.

Görüntüleme için, fitzy dekstran ile işaretlenmiş lizozomları aşırı yoğun olmayan hücreleri seçin. Tekil lizozomların hareketi ve eksositozu. Hücre genelindeki lizozom hareketlerini izlemek için geniş alan görüntüler alın.

Alternatif olarak, hücre yüzeyindeki hareketleri izlemek ve ekzositozlarını takip etmek için turf görüntüleri alın. Lizozomun hücre yaralanmasına verdiği yanıtı izlemek için, daha önce gösterildiği gibi radyasyon ile hücre membranını yaralayın; ilgilenilen hücrelerdeki ekzositoz dinamiğine bağlı olarak, hücreleri saniyede dört ila altı kare hızla en az iki dakika veya daha uzun süre görüntüleyin. Bu toplu analizde, yaralanan tüm hücreler işaretlenir ve onarımı başarısız olanlar belirlenirken, yaralanmamış hücreler etiketsiz kalır.

Fitzy dekstran varlığında cam boncuklarla hasar verilen hücreler, kalsiyum varlığında onarılmalarına izin verildiğinde yeşil ile işaretlenir. Hücrelerin onarılmasına izin verildiğinde, hasarlı hücrelerin çoğu onarılmayı başarır ve trissy dekstran ile işaretlenmez. Kalsiyum yokluğunda ise hasarlı hücrelerin çoğu trissy dekstran tarafından kırmızı ile işaretlenir.

Bu deney, FM boyasının hücreye girişini izleyerek hücre membran onarımının kinetiğini değerlendirmektedir. FM boyası ile inkübe edildiğinde, sağlam hücreler çok az hücre içi boyama gösterir veya hiç göstermez. Hücre membranının bölgesel lazer yaralanmasının ardından, FM boyası hücreye girmeye ve endomembranlara bağlanmaya başlar; hücre membranının lazer yaralanması sonrası onarım kapasitesi kalsiyuma bağlı olduğundan, bu durum FM boyası floresanında ani bir artışa neden olur.

Kalsiyum varlığında hasar gören bir hücre onarım yapabilir, bu da hasardan bir dakika sonra FM boyasının girişinin durmasını sağlar. Buna karşın, kalsiyum yokluğunda onarıma bırakılan bir hücre onarılamaz; bu durum boyanın sürekli girişine ve dolayısıyla hasardan dört dakika sonra bile FM d floresansının sürekli artışına neden olur. Böylece, hücre membranı onarımı, FM boyası boyamasının bir platoya ulaşmasını sağlar.

Hücre zarı onarımının eksikliği, platoya ulaşamayan sürekli bir boya girişine neden olur. Toplu cam boncuk yaralama yaklaşımı, yaralanmaya yanıt olarak veziküllerin ve proteinlerin hücre yüzeyine translokasyonunu izlemek için kullanılabilir. Burada hücreler, trissy dekstran varlığında yaralanır.

Böylece, hasarsız hücreler kırmızı ile işaretlenmezken, hasar görmüş tüm hücreler kırmızı ile işaretlenir. Birincil antikorla işleme tabi tutulmamış hasarsız hücrelerin, hücre yüzeyindeki lamp 1 için arka plan seviyesinde bir işaretleme gösterdiğine dikkat edin. Ancak, hücreler hasar gördüğünde ve kalsiyum varlığında iyileşmelerine izin verildiğinde, lizozomlar ekzositoz geçirir ve böylece hasarlı hücrelerin yüzeyinde lamp 1 boyama seviyesi artar.

Hücre yüzeyindeki LAMP1 işaretlemesindeki bu artış, kalsiyum yokluğunda iyileşmesine izin verilen hücrelerde çok daha düşüktür. Bu nedenle, hem yüksek hücre yüzeyi LAMP1 boyamasına sahip hücre sayısının belirlenmesi hem de tekil yaralı hücrelerdeki hücre yüzeyi LAMP1 boyama düzeyinin ölçülmesi, hücrenin yaralanma tetiklemeli lizozomal ekzositoza girme yeteneği için ölçütler sağlar.

Bu deney, tekil lizozom füzyonunun kinetiğini, doğasını ve konumunu doğrudan izlemektedir. Hücre zarı hasarına yanıt olarak hücreler darbeli lazer ile hasarlanır ve hücre yüzeyindeki lizozomlar, tekil hücrelerde hasarla tetiklenen lizozom ekzositozının izlenmesine olanak tanıyan turf görüntüleme yöntemiyle görüntülenir. Bu şekilde, sol panelde faz kontrast görüntüleme ile ve orta panelde turf mikroskopi ile görselleştirilmiş bir hücre gösterilmektedir.

Sağ panel, aynı hücrenin hasardan 105 saniye sonraki turf görüntüsünü göstermektedir. Burada, hasarın bir lizozomu hücre membranına çağırdığı ve ardından ekzositozun gerçekleştiği görülmektedir. Bu lizozom, hasar öncesindeki turf görüntüsünde görünür değildir; ancak hasarı takiben lizozom hücre membranına ulaşır ve saptanabilir hale gelir.

Vezikül hücre membranına yaklaştıkça, TIRF aydınlatması tarafından daha iyi uyarılır ve bu durum lizozomal fitzy DExT zinciri floresanının maksimum değere ulaşmasını sağlar. Füzyon gözenekleri açıldığında, bu durum lizozomal pH'ın nötralizasyonuna ve dolayısıyla fitzy DExT zinciri floresanının söndürülmesinin ortadan kalkmasına (de-quenching) neden olur. Ardından, DExT zinciri vezikülden hücre dışına boşaltılır; bu da ZI floresanının lateral olarak yayılmasına ve vezikül floresanının kademeli olarak azalmasına yol açar, böylece lizozomların çeşitli hasar tetiklemeli yanıtları ölçülebilir.

Bu videoyu izledikten sonra, hücrelerin geniş fokal yaralanmalardan onarılma yeteneklerinin nasıl izleneceği ile onarım sürecine yanıt veren ve bu sürece yardımcı olan hücre altı bölmelerin ve proteinlerin nasıl takip edileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız. IND hücrelerinin yaralanmaya verdiği yanıtı ve onarımdaki rolünü izlemek için farklı etiket canlı boyamaları, bölmeler veya proteinler kullanılarak daha fazla deney gerçekleştirilebilir.