Name: 구조적 조명 현미경을 사용하여 쥐 차 해마 신경 세포의 돌기 쪽 이미징 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-05-04T15:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 11 s
Description: 학습하세요 구조적 조명 현미경(SIM)을 이용한 초고해상도 이미징으로 쥐 해마 신경 세포의 돌기 쪽 형태를 정밀 분석하는 방법입니다. 이 기술은 시냅스 가소성 연구에 필수적인 미세 구조 변화를 포착합니다.

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이 작품은 CPF에 과학 연구에 대한 네덜란드기구 (NWO)의 VIDI 인증 번호의 H64.09.016에 의해 재정되었다. CPF는 그녀의 중요한 의견과 최종 원고에 대한 수정 박사 Silvina A. Fratantoni에 감사합니다. GMRDL / 네 ..는 네덜란드의 기술 재단 NWO의 일부입니다 STW (프로젝트 12151 및 11350), 어느 부분적 경제부에 의해 자금 지원에 의해 지원된다. 우리는 도움과 지원을 위해 니콘 인스트루먼트의 유럽 BV의 캐서린 키츠 피터 Drent 감사합니다. HX 보조금 과학 연구에 대한 네덜란드기구 (부여 820.02.006)에 의해 지원되었다 네덜란드 왕립 예술 과학 아카데미 (부여 11CDP10) 및 WT에 의해 지원되었다.

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이 문서에서는 SIM을 사용하여 체외에서 배양 된 쥐의 기본 해마 신경 세포에서 이미지 돌기 쪽을 작동 프로토콜을 설명한다. 차 해마 신경 세포 배양법 Kaech와 뱅커 (18)에 의해 설명 된 방법 일본어의 적응이다. 브루 등 19에 의해 설명 된 주된 차이점은, Neurobasal/B27 배양 astroglial 피더 문화의 요구를 제거 가능 매체, 및 아교 세포의 증식을 억제하면서 신경의 생존을 촉진 일 3에 유사 분열 억제제 FUDR의 첨가의 사용이다. 프로토콜의 여러 중요한 단계가 있습니다. 세포를 플레이트에 사용되는 커버 슬립의 두께가 정확한 SIM 실험을 위해 결정적이다. 커버 슬립 준비 및 코팅 동안 불임이 중요합니다. 폴리-L-라이신 처리 된 커버 슬립 2.3 및 2.4 동안 건조하게하지 마십시오. 단계 5.8에서 사용 된 화염 연마 펫의 직경은 중요하다.너무 좁은 끝은 나중 단계에서 낮은...

수지상 척추 신경 막의 작은 돌기이다. 이 특징적인 구조는 일반적으로 단일 시냅스로부터 입력을 수신하도록 전문이 뉴런 사이의 물리적 접촉 면적을 나타내고있다. 대부분의 기능적 성숙 돌기 쪽은 구형 팁,라고 머리, 그리고 돌기 축에 머리를 연결하는 얇은 목으로 구성되어 있습니다. 그러나 등뼈가 정적되지 않고 적극적으로 이동하고 심지어 성인의 뇌 2에 지속적으로 형태를 변경합니다. 시간이 2 주 기간 내에서 후반 배아 또는 출생 초기 시간에서 파생 된 쥐 차 해마 신경 세포 배양은 척추와 같은 구조 3 초 filipodia 진화 수많은 막 돌기 복잡한 돌기 아버을 개발한다. 이러한 동적 동작과 다른 특성에 기초하여, 돌기 쪽은 메모리 저장 및 시냅스 전달의 4,5위한 해부 기판을 제공하는 것으로 생각된다. 일을 감안할 때돌기 척추의 크기와 모양이 시냅스 기능에, 정확하게 자신의 치수를 측정하는 것이 중요하다 것을 전자 중요한 역할. 등뼈의 길이는 약 200 내지 2000 나노 미터에서 변화 좀처럼 공 초점 레이저 주사 형광 현미경에 의해 식별 될 수있다. 그러나 길이보다 다른 척추의 크기는 일반적으로 이론적으로 200 나노 미터 6 주위 회절에 의해 고정 된 종래의 광 시스템의 해상도, 아래에. 이러한 해결 능력은 척추의 목 및 머리의 폭과 미세한 세부 사항을, 이미징에 충분하다. 많은 일이 문제를 해결하기 위해 전념하고있다 많은 비교적 새로운 슈퍼 해상도 현미경 기술은 상당한 진전을 제공하고 있습니다. 특히, 광 시야, 비 촛점 현미경 7-10에서 측방 구조화 조명 현미경 (SIM)을 사용하여 임의의 발광색을 폐기하지 않고 고전 넘어선 해상도를 달성 할 수있다. 비 리네아와 함께이 기술을 사용R 현미경 기법, 그것은 제한 요소 (11)에 의해 광학 현미경의 측 방향 해상도를 개선하기 위해 이론적으로 가능하다. 그러나, 대부분의 실험 상황에서, SIM은이 하나의 요인에 의한 해상도 한계를 넘어 설 수있다. 이러한 자극 방출 고갈 (STED) 현미경 (12)와 사진 활성화 현지화 현미경 (PALM) 12와 같은 다른 슈퍼 해상도 광학 현미경 기술은 돌기 쪽의 영상에 적용되었습니다. 같은 PALM 등 현지화 기반의 방법은 최고 해상도를 달성하기 위해 RAW 이미지의 매우 큰 숫자를 필요로하기 때문에 속도가 제한됩니다. 한편, STED 높은 촬상 속도를 달성 할 수있는 비교적 낮은 광자 카운트 및 SIM (13)에 대한 경우가 아닐 수도 보이는 작은 필드에서 비록. 이 문서의 목적은 체외에서 배양 한 쥐의 기본 해마 신경 세포에서 이미지 돌기 쪽을 작동하는 프로토콜을 제공하는 것입니다 </EM&gt; SIM을 사용하여. 설립, 개발, 형질 전환 쥐의 기본 해마 신경 세포 배양의 면역 조직 화학 염색과 영상을 샘플링하기 위해 최선을 다하고 늦은 단계로 구성된 최초의 하나 :이 프로토콜은 서로 구분되는 두 단계로 구성됩니다.

<table><tbody><tr><td>세밀한 집게</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>큰 집게</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>큰 가위</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>큰 가위</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>무딘 주걱</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>조명이 있는</td><td></td><td></td><td></td>해부 현미경</tr><tr><td>빛 현미경</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>37 & 도그; C 수조</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>층류 세포 배양 후드</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>고온 건조 오븐</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>분젠 버너</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>세포 배양 인큐베이터(5% CO2, 37 &deg; C)</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>마이크로 원심 분리기</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>궤도 쉐이커</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">[헤더]</td></tr><tr><td>Nikon 구조 조명 현미경 설정:</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Perfect Focus System</td><td></td><td></td><td></td>이 있는 Nikon Eclipse Ti 연구 도립 현미경</tr><tr><td>Nikon CFI Apo TIRF 100x 오일 대물 렌즈(NA. 1.49)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>4 코히런트 사파이어 레이저(458, 488, 514 및 561nm 출구 파장)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>SIM 조명기</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>니콘 스테이지 컨트롤러</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MCL 나노 드라이브 피에조 컨트롤러</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>니콘 인텐시라이트 C-HGFIE 수은 램프</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>SIM 현미경 인클로저 온도 제어</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Andor EM-CCD 카메라 iXon DU897</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PC with Microsoft Windows 7 Home Edition</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nikon' s NiS Elements 6.14 SIM 소프트웨어 패키지</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nikon A형 이멀젼 오일</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

구조적 조명 현미경을 사용하여 쥐 차 해마 신경 세포의 돌기 쪽 이미징

Imaging Dendritic Spines of Rat Primary Hippocampal Neurons using Structured Illumination Microscopy

돌기 쪽은 신경 세포의 수상 돌기에서 나오는 돌출부이며, 뇌의 흥분성 입력의 기본 시냅스 대상을 나타냅니다. 기술의 발전은 신경 세포의 연결 및 시냅스 가소성의 핵심 요소로 이러한 구조를 발견했습니다. 광학 현미경을 사용하여 척추의 형태의 정량 분석​​에 의한 빛의 굴절 고유 제한과 관련된 기술적 인 한계에 대한 근본적인 문제가 남아있다. 돌기 쪽이 용이하게 공 초점 레이저 주사 형광 현미경에 의해 식별 될 수있다. 길이 아닌 다른 척추 치수는 일반적으로 200 ㎚의 광학 현미경의 이론적 인 해상도 한계에 의해 고정 된 기존의 광학 해상도보다 작은 있기 때문에, 척추의 모양과 크기에 미묘한 변화를 측정하는 것은 어렵다. 몇 가지 최근에 개발 된 슈퍼 해상도 기술이 돌기 쪽을 포함하여 200 나노 미터보다 작은 이미지 세포 구조에 사용되어왔다. 티HESE 기술은 고전적인 원방 조작에 기초하기 때문에 시료의 표면을 넘어 기존의 샘플 준비 방법과 이미지를 사용할 수있게됩니다. 여기에 설명 된 기본 해마 신경 세포의 문화에 돌기 쪽의 영상을 초 고해상도 구조 조명 현미경 (SIM)을 적용하는 작업 프로토콜입니다. SIM의 가능한 응용 프로그램은 공 초점 현미경의 사람들과 겹칩니다. 그러나,이 기술은 다양한 적용 가능성을 제시한다. 공 초점 현미경으로 인해 실제 구멍의 사용에 초점 빛을 밖으로 제거의 비용으로 해상도 향상을 달성하면서 SIM은, 높은 효과적인 측면 해상도를 제공합니다. 이 프로토콜에서 기본 뉴런은 DNA 플라스미드는 형광 단백질을 인코딩하고 SIM을 사용하여 몇 군데로 형질 표준 프로토콜을 사용하여 유리 커버 슬립에 배양. 돌기 쪽이 체외에서 16-17일 후, 때 이미지가 있기 때문에 여기에 설명 된 전체 프로토콜은, 약 2 주 소요수지상 개발이 최적이다. 프로토콜을 완료 한 후, 돌기 쪽이 전문 소프트웨어를 사용하여 SIM 이미지 스택의 시리즈에서 3D로 재구성 할 수있다.

여기에 설명하는 것은 SIM을 사용하여 체외에서 쥐 차 해마 신경 세포의 돌기 쪽 이미징을위한 표준화 작업 프로토콜입니다. 프로토콜 워크 플로우와의 중요한 단계는 그림 1에 나타내었다. 전반적으로, 프로토콜 문화, 개발, 쥐 차 해마 신경 세포 및 면역 조직 화학 염색의 형질을 포함한 샘플 준비의 첫 단계에서 분리 실험적인 작업의 약 2 주가 걸리고, 두 번째 단계 SIM을 사용하여 샘​​플 이미징. 쥐 차 해마의 뉴런은 약 이주 뉴런은 수많은 돌기 쪽이 3,5 베어링 복잡한 돌기 아버를 개발 한 문화의 시작 후 고정되어 있습니다. 섹션 1-8에 자세히 설명 된 프로토콜을 사용하여, 최고 해상도의 이미지를 체계적으로 돌기 쪽이 가능합니다. (16) 이전에 설명하는 공 초점 형광 현미경을 이용하여 종래의 수지상 척추 영상 법에 비해,(17), SIM을 사용하여 본원에 기재된 프로토콜 있도록 훨씬 더 나은 이미지 해상도 및 3...

이 문서는 구조적 조명 현미경 (SIM)을 사용하여 체외에서 해마 신경 세포에서 이미지 돌기 쪽을 작동 프로토콜을 설명합니다. SIM을 사용하여 초 고해상도 현미경 개선 된 세부 사항과 함께 개별 돌기 쪽의 영상을 허용, 크게 세 가지 차원 공간에서 빛의 회절 한계를 넘어 이미지 해상도를 제공합니다.

Dendritic spines are protrusions emerging from the dendrite of a neuron and represent the primary postsynaptic targets of excitatory inputs in the brain. ...

본 절차의 전반적인 목표는 초고해상도로 수상돌기 가시(dendritic spines)를 이미징하는 것입니다. 이는 먼저 쥐의 일차 해마 배양 세포를 준비함으로써 수행되며, 두 번째 단계는 GFP 형질전환 및 염색을 통해 수상돌기 가시를 시각화하는 것입니다. 그 다음, SIM 현미경을 사용하여 초고해상도로 GFP 표지된 수상돌기 가시의 영상을 획득합니다.마지막 단계는 원본 이미지 데이터를 3D로 재구성하여 후속 이미지 분석이 가능하도록 하는 것입니다. 최종적으로, 초고해상도로 촬영된 GFP 발현 일차 해마 뉴런을 통해 수지상 돌기 가시 형태의 미세한 변화를 보여줍니다. 기존의 일반 공초점 현미경과 같은 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은 수지상 돌기 가시 형태를 더욱 상세하게 연구할 수 있다는 점입니다.이 방법은 수지상 돌기 가시(dendritic spine)의 형태에서 나타나는 분자 및 약물 의존적 변화와 같은 신경과학 분야의 주요 현안들을 조사하는 데 도움이 될 수 있습니다. 구조광 조명 현미경(Structured illumination microscopy)은 시료에 선 패턴을 투사하는 방식에 기반하며, 이를 통해 컴퓨터 프로그램으로 추출 가능한 추가 정보를 얻을 수 있어 더욱 선명한 이미지를 구현하고 미토콘드리아 및 세포 내 기타 미세 구조물을 관찰할 수 있게 합니다. SIM 이미지의 유효한 재구성을 달성하기 위해서는 고품질의 원시 데이터를 얻기 위한 단계들을 거치는 과정에 대한 시각적 시연이 매우 중요합니다.중요한 준비 단계로, 멸균 라미나 후드 내에서 커버슬립을 코팅하는 과정이 포함됩니다. 작은 멸균 핀셋을 사용하여 개별 커버슬립을 12웰 플레이트의 각 웰에 하나씩 넣습니다. 그런 다음, 각 웰에 polylysine 용액 500 µL를 첨가하여 커버슬립을 완전히 잠기게 합니다.웰을 세척한 후, 플레이팅 배지 1 mL를 첨가하고 세포를 플레이팅하기 전까지 커버슬립을 조직 배양 인큐베이터에 최대 24시간 동안 둡니다. 이 과정은 저희 연구 그룹의 박사 과정 학생인 HU is SH가 시연할 것입니다. 쥐 배아를 분리한 후, 미세 핀셋을 사용하여 뇌에서 소뇌를 제거하여 폐기합니다.해부 현미경 하에서 중앙선을 따라 시상 절개를 하여 두 반구를 분리하고, 작은 핀셋 한 쌍으로 중뇌를 조심스럽게 잡고 제거합니다. 다른 핀셋을 사용하여 피질과 해마가 포함된 반구의 나머지 부분을 온전히 남겨둡니다. 다음으로 뇌수막을 조심스럽게 제거하고, 해마가 위를 향하도록 조직의 방향을 다시 잡습니다.해마는 특유의 CS자 모양 구조를 통해 식별할 수 있습니다. 미세 핀셋을 사용하여 해마를 박리한 후, 신선하고 차가운 1X HBSS가 담긴 새로운 30mm 디쉬에 넣습니다. 모든 배아에서 해마를 제거한 후, 해마의 총 개수를 세고 이를 작은 조각으로 자릅니다.1X HBSS 3 mL가 들어 있는 15 mL 원심분리 튜브에 조직 조각들을 수집합니다. 원심분리 후 상층액을 제거하고, 해마당 6 µL의 trypsin을 첨가합니다. 텍스트 프로토콜에 기술된 대로 해마 조각들을 배양하고 세척한 후, 모든 조직 조각들이 단일 세포로 균질하게 분산될 때까지 화염 연마된 파스퇴르 피펫으로 조각들을 30회 천천히 피펫팅합니다.기포가 생기지 않도록 주의하십시오. 다음으로, 37 °C로 예열된 플레이팅 배지 5 mL를 추가합니다. 트라이판 블루(trypan blue) 생존 염색법을 사용하여 세포 수를 측정한 후, 12웰 플레이트의 웰당 1 mL의 플레이팅 배지에 50,000개의 세포를 분주하여 총 부피를 2 mL로 맞춥니다.플레이트를 흔들어 세포를 고르게 분산시킨 후, 37°C, 5% CO2 조건에서 세포를 배양합니다. 2~3일 후, 도말 배지 0.5 mL를 10 µM FUDR이 포함된 배양 배지로 교체합니다. 뉴런을 트랜스펙션하기 위해 리포좀을 첨가합니다.A DNA 믹스에 한 방울씩 혼합한 후 상온에서 30분 동안 배양합니다. 라미나 플로우 후드 내에서, DNA 리펙토미 혼합물 배양 30분이 끝나기 10분 전에, 원래의 첫 번째 배양 플레이트에서 컨디셔닝 배지를 두 번째 12-웰 플레이트로 피펫팅하여 옮기고, 이 플레이트를 37 °C, 5% carbon dioxide 조건의 첫 번째 배양 플레이트에 보관합니다.세포가 건조되는 것을 방지하기 위해 조건 배지를 1 mL의 예열된 배양 배지로 신속하게 교체합니다. 두 플레이트 모두 37 °C, 5% CO2 조건의 인큐베이터에 다시 넣습니다. 30분간의 DNA lipectomy 배양이 끝나면, DNA lipectomy 믹스를 세포에 첨가할 준비가 완료됩니다.각 웰에 DNA lipectomy 믹스 200 µL를 천천히 한 방울씩 가한 후, 37 °C, 5% CO2 조건에서 45분 동안 배양합니다. 45분간의 배양 후, 작은 핀셋을 사용하여 뉴런이 부착된 커버 슬립을 들어 올립니다. 신선하고 따뜻한 neuro basal medium이 담긴 3 cm 디쉬에 커버 슬립을 담가 세척한 후 웰에 넣습니다.조건 배지가 들어 있는 두 번째 12-웰 플레이트에 옮깁니다. 그런 다음 트랜스펙션된 뉴런을 37 °C, 5% CO2 조건에서 48시간 동안 배양합니다. 면역 염색을 준비하기 위해, 커버슬립이 들어 있는 웰에서 배지를 조심스럽게 흡입하여 제거합니다.그런 다음 수상돌기가 손상되지 않도록 따뜻한 4% PFA 500 µL를 조심스럽게 첨가합니다. 세포를 인큐베이션하고 세척한 후, 실온에서 1% T-B-S-B-S-A 용액으로 30분 동안 블로킹하고, 다시 세척한 후 희석된 1차 항체를 첨가하여 혼합한 뒤 실온에서 1시간 동안 인큐베이션합니다. 그 후 4 °C에서 부드럽게 흔들어주며 하룻밤 동안 인큐베이션합니다.다음 날 아침, 1차 항체를 제거하고 다시 세척하며, 이후부터는 커버슬립이 빛에 노출되지 않도록 보호하십시오. 그다음, 배양액에 희석한 2차 형광 결합 항체를 첨가합니다. 혼합 후 실온에서 2시간 동안 배양하십시오.그 다음 2차 항체를 제거하고 미세 핀셋을 사용하여 세포를 세척합니다. 웰에서 커버슬립을 꺼내고 조직(tissue)으로 과잉의 TBS를 닦아냅니다. 마지막으로 마운팅 매질을 사용하여 커버슬립을 고정하고 매니큐어로 밀봉합니다.SIM 이미징을 시작하려면 488 nanometer 레이저, 수은 램프, 스테이지 컨트롤러, 피조 컨트롤러 및 투과광용 할로겐 램프를 켭니다. nsim 모드를 위해 SIM 소프트웨어를 실행합니다. 대물렌즈에 침유 한 방울을 떨어뜨린 후, 오일 방울 내에 기포가 없는지 확인합니다.해마 뉴런이 있는 커버슬립을 현미경 스테이지 위에 놓습니다. 오일이 샘플에 닿을 때까지 대물렌즈를 위로 이동시킵니다. 획득 과정 동안 주변 빛으로부터 샘플을 보호하기 위해 스테이지 위에 커버를 덮고, 실내 조명을 가능한 한 최대한 낮게 조절하십시오.SIM 소프트웨어에서 광학 구성 IFI를 선택하고, 백색광 설정으로 샘플 초점을 시각적으로 확인하기 위해 비어 있는 필터 블록 하나를 선택하십시오. 이어서 백색광을 끄고 수은 램프를 켭니다. 셔터를 열고 녹색 필터를 선택하여 충분히 밝은 수지상 돌기를 찾으십시오.관심 있는 충분히 밝은 수지상 돌기를 발견하고 관심 분절을 시야 중심에 맞춘 후, 셔터를 닫습니다. 소프트웨어의 광학 설정을 3D SIM 4 88로 설정하고, 카메라 설정을 다음과 같이 지정합니다. 판독 모드를 em으로 설정하십시오.게인을 1MHz 16bit로 설정하십시오. 노출 시간을 100 milliseconds로 설정하십시오. 레이저 출력을 5%로 설정하십시오. EM 게인을 200으로 설정하십시오.초점 조절 속도를 extra fine으로 설정한 후, 관심 대상에 초점을 맞춥니다. 카메라 설정을 다음과 같이 빠르게 조정하십시오. 강도 값을 30, 040 5, 000 사이로 얻으려면, 레이저 출력을 0%에서 20%로 설정하십시오. 노출 시간은 50 milliseconds에서 2 seconds로 설정하십시오.판독 모드를 em으로 설정하십시오. Gain은 1 MHz, 16 bit로 설정합니다. EM gain을 0에서 300 사이로 설정하십시오.컨버전 게인(conversion gain)을 1x에서 5.1x로 설정하십시오. 라이브(live) 포맷을 no Binning으로 설정하십시오. 캡처(capture) 포맷을 no Binning으로 설정하십시오.다음으로, ND 시퀀스 패널에서 세 가지 DZ 스택의 설정을 다음과 같이 구성하고, 범위를 2 µm로 설정하십시오. 단계 크기를 120 nm로 설정한 다음 홈 위치(home position)를 클릭하십시오. 그런 다음 람다(lambda) 섹션에서 광학 구성인 3D SIM 4 88을 선택하십시오.획득 모드로 3D SIM을 선택한 후, ND 시퀀스 획득을 실행하고 로우 데이터를 저장하십시오. 여기에는 공초점 및 SIM 현미경으로 촬영한 수지상 돌기(dendrites)와 수지상 돌기 가시(dendritic spines)가 표시됩니다. 획득된 데이터는 공초점 및 SIM 이미지로부터 재구성되었습니다. 목 길이(neck length), 목 직경(neck diameter) 및 머리 직경(head diameter)과 같은 주요 파라미터를 조정한 후, 소프트웨어를 통해 수지상 돌기를 추적하고 가시를 자동으로 분류하였습니다.상자 표시된 영역은 공초점 및 SIM 현미경으로 촬영하고 해당 Z-스택에서 재구성한 개별 수지상 돌기 가시(dendritic spine)를 보여주며, 이는 결과물인 3D 재구성의 해상도와 정확도 차이를 나타냅니다. SIM의 더 높은 해상도에 따른 머리와 목 직경의 정량적 분석 결과, 동일한 수지상 돌기 가시에 대해 SIM 현미경이 공초점 현미경보다 유의하게 더 작은 치수를 측정하는 것으로 나타났으며, 이는 SIM이 수지상 돌기 가시 형태의 더 작은 변화를 감지할 수 있음을 시사합니다. 이 절차를 수행할 때, 동일한 이미지의 더 유효한 후속 재구성을 위해 고품질의 원본 이미지를 획득하는 것이 중요함을 기억하십시오.구조광 조명 현미경(Structured illumination microscopy)은 살아있는 세포 이미징에도 효과적이며, HeLa 세포, 뉴런 또는 대장균(E. coli) 박테리아와 같은 세포의 역동성을 조사할 수 있게 해줍니다. 이 영상을 시청하고 나면, 일차 해마 뉴런(primary hippocampal neurons)의 표준 시료를 초고해상도로 준비하고 시각화하며 이미징하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

많은 최근의 연구는 뇌 pathologies와 관련된 시냅스 단백질에 돌연변이가 확인되었습니다. 기본 교양 피질 뉴런이 돌기 척추의 형태와 운동성에서 이러한 질병 관련 단백질의 영향을 조사 큰 유연성을 제공합니다.

교양 CNS의 뉴런의 돌기 스파인 형태론 분석

출처: Pekarek, B. T., et. al., CLARITY 조직 투명화를 통한 온전한 신경 수상돌기의 이미징 및 정량화. J. Vis. Exp. (2021)이 비디오에서는 컨포칼 현미경 및 3D 재구성 기술을 사용하여 수지상 가지, 척추 형태 및 신경 분포를 조사하기 위해 제거된 마우스 뇌의 준비, 이미징 및 분석을 보여줍니다.

Confocal Microscopy Imaging of intact dendritic arbors and spine morphology in a cleared mouse brain(투명화된 쥐 뇌에서 온전한 수지상 가지와 척추 형태에 대한 컨포칼 현미경 이미징)

출처: Gouder, et. al. 인간 유도 만능 줄기 세포에서 파생된 피라미드 뉴런의 수지상 가시의 3차원 정량화. J. Vis. 경험. (2015).이 비디오는 공초점 현미경을 사용하여 형질도입된 면역 표지 피라미드 뉴런에서 수지상 가시의 이미징 및 분석을 보여줍니다. 배경 소음이 감소하고 수상돌기가 직경과 길이를 추정하여 추적됩니다. 자동화된 척추 분할에는 수상돌기 및 척추 치수에 대한 매개변수 설정과 척추 분류가 포함됩니다. 3D 모델이 생성되고 분석을 위해 내보내집니다.

공초점 현미경 이미징을 사용한 수지상 가시의 정량화

살아있는 동물의 타임랩스 영상은 온전한 뇌의 구조적 재구성에 대한 귀중한 정보를 제공합니다. 여기에서는 이광자 현미경으로 살아있는 쥐 피질의 형광 표지된 시냅스 구조를 경두개 이미징할 수 있는 얇은 두개골 제제를 소개합니다.

두 광자<em&gt; 생체</em&gt; 시닝 두개골 준비를 사용하여 마우스 피질 돌기 쪽의 영상

우리는 마우스 모델의 해마에서 수지상 수목화의 시각화 및 정량화를 위한 두 가지 방법, 즉 실시간 이미징과 확장된 피사계 심도 이미징에 대해 설명합니다. 전자의 방법은 정교한 지형 추적과 분기 정도의 정량화를 가능하게 하는 반면, 후자는 수지상 나무를 빠르게 시각화할 수 있습니다.

쥐의 해마 영역의 치아 이랑 (dentate gyrus)에서 수지상 Arborization의 평가

피라미드 신경 세포의 돌기 쪽은 포유류의 뇌 피질에있는 대부분의 흥분성 시냅스의 사이트입니다. 이 방법은 유도 된 다 능성 줄기 세포로부터 유래 된 인간 피질 피라미드 글루타메이트 성 뉴런의 척추 모폴로지의 3D 정량 분석​​을 설명한다.

인간 유도 만능 줄기 세포에서 파생 된 피라미드 뉴런에서 돌기 쪽의 3 차원 정량화

이 방법은 살아있는 마우스의 해마에 광학적인 접근을 허용하는 만성 준비를 기술합니다. 이 제제는 몇 주 동안 신경 구조 가소성 및 활동 유발 세포 가소성의 세로 광학 이미징을 수행하는 데 사용할 수 있습니다.

살아있는 마우스에 있는 등도 해마 CA1의 세로 2 광자 화상 진찰

이 프로토콜은 1 차적인 신경 배양에서 단백질 공동 국소화를 공부하기 위하여 초해상도 현미경 검사를 채택하는 방법을 보여줍니다.

1차 뉴런에서 단백질과 시냅스 마커의 공동 국소화를 연구하는 초해상도 이미징

직렬 블록-얼굴 스캐닝 전자 현미경 검사(SBEM)는 뮤린 해마의 수지상 척추를 이미지 및 분석하기 위해 적용된다.

수지상 척추 연구를 위한 직렬 블록-얼굴 스캐닝 전자 현미경 검사(SBEM)

본 프로토콜은 배양된 래트 해마 뉴런 및 3D 구조화된 조명 현미경(3D-SIM)을 사용하여 축색 초기 분절의 막주기적 골격의 액틴 고리 및 기타 성분을 시각화하고 측정하는 방법을 기술한다.

3D 구조화 조명 현미경(3D-SIM)을 사용하여 축삭 초기 세그먼트의 멤브레인 주기적 골격의 특성 측정

이 프로토콜은 쥐의 해마 및 내측 전두엽 피질에서 뉴런을 염색하기 위해 신경계의 모든 부분에 적응할 수있는 신속한 골지 방법의 변형을 기술합니다.

해마와 전두엽 피질의 Dendritic Spine Visualization을위한 빠른 골지 얼룩

학습하세요 구조적 조명 현미경(SIM)을 이용한 초고해상도 이미징으로 쥐 해마 신경 세포의 돌기 쪽 형태를 정밀 분석하는 방법입니다. 이 기술은 시냅스 가소성 연구에 필수적인 미세 구조 변화를 포착합니다.

구조적 조명 현미경을 사용하여 쥐 차 해마 신경 세포의 돌기 쪽 이미징

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