Langzeit-Intravitalimmunfluoreszenz-Imaging von Gewebematrix Bestandteile mit Epifluoreszenz und Zwei-Photonen-Mikroskopie

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die intravitale Immunfluoreszenz-Bildgebung des Ohrs von Mäusen mit Melanom durchzuführen, um die Dynamik der Matrixbestandteile des Tumorgewebes zu untersuchen. Dies wird erreicht, indem zunächst ein Mausohr mit GFP-exprimierenden B16F10-Melanomzellen inokuliert wird. Anschließend wird am Mausohr eine Operation durchgeführt, um die ventrale von der dorsalen Ohrhaut zu trennen und das Tumorgewebe freizulegen.

Anschließend wird eine Immunfärbung am freigelegten Gewebe des Ohrs durchgeführt. Abschließend wird das Tier für die intravitale Bildgebung vorbereitet. Letztendlich kommen fluoreszenzoptische Stereomikroskopie oder Multiphotonenmikroskopie zum Einsatz, um die Lokalisation und das dynamische Verhalten von Tumorzellen sowie deren Matrixkomponenten darzustellen.

Der Hauptvorteil dieser Technik im Vergleich zu anderen Verfahren der Live-Bildgebung besteht darin, dass wir die dynamischen Wechselwirkungen von Tumorzellen mit stromal-assoziierten Zellen wie Immunzellen im Kontext einer faserigen, netzartigen extrazellulären Matrix abbilden können. Diese Methode kann daher helfen, zentrale Fragen der Tumorbio­logie zu beantworten, beispielsweise wie Tumorzellen mit ihrer physikalischen Mikroumgebung interagieren, was wiederum wichtige Erkenntnisse über den Tumorprogress liefern kann. Einige Teile des Verfahrens werden von Vita Kki, einer leitenden Wissenschaftlerin unseres Labors, demonstriert. Um die Tumorzellen für die Injektion vorzubereiten, kultivieren Sie zunächst B 16 F 10 GFP-Melano­mzellen.

Nach dem Zentrifugieren überführen Sie die Zellen in ein 1,5-Milliliter-Einwegröhrchen und zentrifugieren erneut. Entfernen Sie den gesamten Überstand, bis auf eine dünne Mediumschicht, die direkt über dem Pellet verbleibt. Resuspendieren Sie die Zellen zu einer dichten Zellsuspension und geben Sie anschließend die Zellsuspension in einem Volumen von 10 Mikrolitern in eine Hamilton-Spritze. Entfernen Sie die Nadelspitzenkappe einer befestigten Nadel mit 33 Gauge und laden Sie 20 Mikroliter der Suspension auf die Spitzenkammer auf.

Ziehen Sie dann den Kolben zurück, bis fünf Mikroliter der Suspension in die Spritze aufgenommen sind. Nachdem Sie eine C57BL/6-Maus mit injizierbarem Anästhetikum betäubt haben, rasieren Sie den Kopf der Maus, entfernen Sie die Haare am Kopf und um das Ohr herum und spülen Sie mit Wasser ab. Befestigen Sie mit Klebeband die proximale Kante des Ohres an der Fingerspitze eines Zeigefingers.

Führen Sie die Hamilton-Spritzennadel zwischen die dorsale Dermis und den Knorpel des Ohres einer C57 black six Maus ein, wobei das Ohr über eine Strecke von proximal nach distal um etwa zwei bis drei Millimeter durchdrungen wird. Injizieren Sie die Zellsuspension und ziehen Sie die Nadel langsam aus der Haut zurück. Lassen Sie die Tumorzellen über einen Zeitraum von sieben bis neun Tagen einen solide Tumor bilden, wobei Sie ein Fluoreszenzmikroskop verwenden, um das Tumorwachstum zu verfolgen.

Nachdem Sie eine Mischung aus befeuchtetem Sauerstoff und Iso-Fluoran verwendet haben, um die Maus zu anästhesieren, platzieren Sie die Maus auf einer Heizplatte mit einer Temperatur von 37 Grad Celsius und führen Sie eine sanfte Zehenquetschung durch, um zu bestätigen, dass das Tier ausreichend anästhesiert ist. Tragen Sie ein ophthalmologisches Salbe auf die Augen auf und halten Sie die Maus während des gesamten Eingriffs auf einer über einen Rektalthermistor gesteuerten Heizplatte.

Legen Sie anschließend das tumorbehaftete Ohr vorsichtig auf einen Stapel Glasobjektträger. Befestigen Sie dann mit kleinen Streifen Klebeband die vordere und hintere Ohrkante an dem Stapel. Schneiden Sie mit einem Skalpell die ventrale Haut des Ohrs entlang der Antihelix der Mausohrmuschel auf. Entfernen Sie die Klebestreifen mit Hilfe einer gebogenen Pinzette vom Ohr.

Lösen Sie vorsichtig die ventrale Dermis und den Knorpel von der dorsalen Dermis ab. Spülen Sie das Ohr mit Ringer-Puffer, um eine immunfluoreszenzchemische Färbung durchzuführen. Geben Sie primäre Antikörper, die gegen extrazelluläre Matrixmoleküle gerichtet sind, in Blockierpuffer auf das präparierte Ohr und legen Sie einen Deckgläser darauf.

Inkubieren Sie 15 Minuten, bevor Sie etwa fünf Milliliter Ringer-Puffer verwenden, um das Ohr zweimal zu waschen. Geben Sie geeignete sekundäre Antikörper oder Strep Aden im Blockierpuffer hinzu. Bringen Sie einen Deckgläser auf und inkubieren Sie 15 Minuten, bevor Sie wie zuvor zweimal waschen. Falten Sie den offenen Dermisbereich in die EM mencia conki und trocknen Sie die äußere, ungeöffnete Ohrhaut mit sterilen Tüchern ab.

Platzieren Sie das Ohr auf einem Stapel Glasobjektträger und geben Sie 0,5 µL chirurgischen Klebstoff an die vorderen und hinteren dorsalen Ränder, um es für kurze Bildgebungszeiträume von zwei Stunden oder weniger zu fixieren. Geben Sie frisch hergestellte, sterile Sorbat-Ringer-Pufferlösung auf das fixierte Ohr und legen Sie einen Deckgläser auf. Verwenden Sie anschließend ein fluoreszierendes Stereomikroskop mit zwei Linsen, um das Ohr abzubilden.

Für Langzeit-Aufnahmen: Bringen Sie die Öffnung einer Nadel, die an ein Reservoir mit Sorbat-Ringer-Lösung angeschlossen ist, unter der Deckglasabdeckung etwa 0,5 Zentimeter vom Ohr entfernt an. Verwenden Sie eine peristaltische Pumpe mit einer Geschwindigkeit von einem Mikroliter pro Minute, um kontinuierlich Puffer in die Kammer zu leiten.

Öffnen Sie die Aufnahmesoftware. Passen Sie die Verstärkung, die Fluoreszenzintensität, die Vergrößerung und die Belichtungszeit des Bildes an, und erfassen Sie mehrere Felder, die Tumorzellen sowie angefärbte extrazelluläre Matrixproteine enthalten, um eine intravitale Bildgebung mittels Mehrphotonenmikroskopie mit Silikonfett durchzuführen. Beginnen Sie an der Basis des Ohrs.

Bauen Sie eine kreisförmige Wand mit einem Durchmesser von etwa zwei Zentimetern und einer Höhe von zwei bis drei Millimetern um das Ohr herum auf. Füllen Sie den Kreis mit einer Sorbat-Ringer-Lösung. Stellen Sie die Maus auf die Probebühne auf eine Heizplatte, die auf 37 Grad Celsius eingestellt ist, und konfigurieren Sie die Einstellungen des Mikroskops gemäß dem schriftlichen Protokoll.

Wie in dieser Abbildung gezeigt, können viele Strukturen anhand ihrer Morphologie nach einer Immunfärbung unterschieden werden. Für Komponenten der Basalmembran wie Kollagen IV oder Laminin, vor allem strukturelle Proteine, die normalerweise nicht mittels SHG nachgewiesen werden können, kann die klassische Matrixdetektionsmethode sichtbar gemacht werden.

Beispielsweise fanden wir heraus, dass Tenascin C an unterschiedlichen Stellen des Tumorstromas abgelagert wird, während faserige Kollagene an anderen Orten vorliegen. Kräfte, die innerhalb des Tumormikromilieus entstehen, können zu einer Ausdehnung oder Kontraktion der Tumormatrix führen und infolgedessen eine Umgestaltung der Tumorgefäßversorgung ähnlich der Wundheilung bewirken. Hier zeigen wir, dass wir Zweiphotonen-Zeitraffermikroskopie durchführen können, während wir gleichzeitig immunmarkierte Tenascin-C-Matrizes abbilden, wobei eine minimale Photobleiche der Fluorophore auftritt, selbst bei Mikroskopie mit hoher Photondichte. In diesem Video haften Tumorzellen, die auf die exponierte, vorab für Kollagen IV angefärbte Dermis aufgebracht wurden, am Gewebe und beginnen gruppenweise, kollektiv entlang der Basalmembran von Blutgefäßen und Fettgewebsarealen zu wandern.

Wenn der gesamte Vorgang des Öffnens des Ohrs und der Immunfärbung beherrscht ist, dauert er zwei Stunden. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man eine intravitale Immunfärbung durchführt, um Zell-Matrix-Interaktionen in Tumoren mittels Epifluoreszenz- oder Zweiphotonenmikroskopie zu untersuchen.