Иммуногистохимические и кальция способы визуализации в Wholemount сетчатке крыс

Общая цель данной процедуры — селективное мечение ганглионарных клеток сетчатки в препарате целого mounts-образца путем введения индикатора кальция в культю зрительного нерва. Это достигается путем первоначального введения в культю зрительного нерва индикатора кальция с очень высоким сродством, такого как flow four. Затем сетчатка отделяется от глазного яблока и разделяется на квадранты для закрепления на предметном стекле. В регистрационной камере, настроенной для имитации физиологических условий, изучается вклад потенциалзависимых кальциевых каналов в кальциевый сигнал.

В ганглиозных клетках сетчатки измерения можно проводить в деполяризованных клетках с использованием блокаторов каналов. В конечном итоге полученные результаты могут дать полуколичественную оценку вклада потенциал-зависимых кальциевых каналов в такой сигнал, как кальциевый сигнал, вызванный высоким содержанием калия. Основным преимуществом данного метода перед существующими, такими как электропорация и объемное введение, является возможность селективного маркирования ганглиозных клеток сетчатки и их аксонов в препаратах целого mounts, препарированных глазах крыс в среде Hibernate-E или аналогичном растворе.

Теперь, если вы планируете проводить эксперименты по кальциевому имиджингу, выполните ретроградное заполнение ганглиозных клеток сетчатки красителем Fluo-4. Введите 0,5 µL 40 mM пентакалийсоли Fluo-4, реконструированного в воде, в культю зрительного нерва примерно в 1 мм кзади от глазного яблока. Перенесите глазное яблоко в раствор Рингера для млекопитающих.

Продувайте смесью 95% кислорода и 5% углекислого газа или выдержите один час при комнатной температуре. Храните препарат в темноте. Проведите диссекцию глаз под микроскопом с контролируемой интенсивностью освещения.

С помощью лезвия бритвы осторожно сделайте небольшой надрез в передней части глазного яблока и удалите роговицу. Затем с помощью пинцета извлеките хрусталик с внутренней поверхности сетчатки. Плотно удерживайте склеру.

При удалении стекловидного тела другим пинцетом осторожно отслаивайте основание стекловидного тела по направлению к центру сетчатки. Полученный препарат, называемый «чашкой I» (I cup), можно использовать для приготовления целого препарата для иммуногистохимического анализа, для кальциевого имиджинга или для нарезки поперечных срезов сетчатки с целью последующего создания иммуногистохимического целого препарата. Сначала сделайте четыре разреза сетчатки, чтобы она легла плоско.

Поместите сетчатку на предметное стекло покровным слоем ганглионарных клеток вниз. Затем добавьте каплю раствора на сетчатку и, при необходимости, накройте ее фильтровальной бумагой из целлюлозы, расправляя сетчатку с помощью кисти или пинцета. В завершение, когда сетчатка станет полностью плоской и отделится от фильтровальной бумаги, перенесите ее обратно в раствор.

Для предварительной обработки препарата перенесите его в 4% раствор параформальдегида на 10–15 минут. Затем трижды промойте сетчатки в 0,1 молярном фосфатном буфере при pH 7,4 по 30 минут на каждую промывку, общим временем 90 минут. Затем инкубируйте сетчатки в 500 µL блокирующего раствора в течение ночи при температуре 4 °C.

Данный раствор представляет собой 5% нормальной сыворотки козы или осла в фосфатном буфере с добавлением 0,3% Triton и 0,1% азида натрия. В течение следующих пяти-семи дней инкубируйте сетчатки в растворе первичных антител при температуре четыре градуса Цельсия. Состав этого раствора должен быть определен эмпирически. Смойте раствор первичных антител так же, как смывали фиксатор.

Затем инкубируйте сетчатки в растворе вторичных антител в разведении 1:1000 в течение ночи при температуре четырех градусов Цельсия. Удалите вторичные антитела, промыв образцы еще три раза фосфатным буфером. После этого смонтируйте сетчатки для визуализации и загерметизируйте их лаком для ногтей.

Эти предметные стекла необходимо хранить в темноте при температуре 4 °C. Начните с приготовления целого препарата глаза I для кальциевого имиджинга в растворе Рингера. Сначала разрежьте ткань сетчатки на квадранты.

Поместите один квадрант на плоскость записывающей камеры слоем ганглионарных клеток вверх, таким образом, чтобы слой фоторецепторов был обращен вниз. Осторожно промокните окружающую область салфеткой Kim wipe и аккуратно установите смазанную арфу на ткань. Теперь закрепите препарат сетчатки в установке и завершите настройку восьмиканальной системы гравитационной суперфузии.

Если после установки гарпуна закрепленная сетчатка сместилась, осторожно снимите и очистите гарпун. Просушите область вокруг сетчатки и заново закрепите верхний гарпун. Заполните записывающую камеру раствором Рингера для млекопитающих и обеспечьте постоянное барботирование раствора смесью 95% oxygen и 5% carbon dioxide.

Сначала, в качестве контроля без применения препаратов, проведите два парных импульса с высоким содержанием калия (от 3 мМ до 60 мМ) продолжительностью 33 секунды. При условии работоспособности препарата деполяризация должна привести к активации потенциалзависимых кальциевых каналов RGC. После этого переходите к экспериментам.

Нифедипин, блокатор кальциевых каналов L-типа, обычно используется для оценки вклада потенциалзависимых кальциевых каналов L-типа в вызванный деполяризацией кальциевый сигнал. Для неселективной блокады потенциалзависимых кальциевых каналов может быть использован неспецифический блокатор кальциевых каналов. Сканируйте препарат каждые пять секунд для визуализации и получения изображений флуоресцентных RGC.

Используйте минимально возможную мощность лазера. Возбуждение должно быть установлено на 488 нанометров, а эмиссию следует собирать с использованием LP-фильтра 505 нанометров. С использованием описанных протоколов было проведено иммуномаркирование белка ганглионарных клеток R-B-P-M-S, который представляет собой РНК-связывающий белок с множественным сплайсингом. Четыре.

Окрашивание действительно было ограничено ганглионарными клетками, что соответствует специфичности антител. Далее изучался вклад потенциалзависимых кальциевых каналов в кальциевый сигнал в R GCs с использованием значений интенсивности флуоресценции, полученных от rgc. На базовом уровне видно мечение RGC и аксонов RGC с помощью flow four.

Для получения значений интенсивности флуоресценции области интереса (ROI) были установлены на ганглионарные клетки, сомы и/или аксоны. После применения раствора с высокой концентрацией калия к препарату общего примонтирования интенсивность флуоресцентного сигнала RGC увеличилась. Затем, при втором импульсе высокого содержания калия, в присутствии кобальта наблюдалось последующее снижение значений интенсивности флуоресценции.

После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как селективно вводить синтетический краситель-индикатор кальция в ганглионарные клетки сетчатки в препарате целого органа.