Name: Snelle screening van HIV reverse transcriptase en integrase-remmers (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-04-09T21:45:00.000+00:00
Duration: 5 min 46 s
Description: Leer een snelle screeningsmethode voor HIV-1-remmers met luciferase-assays. Deze techniek evalueert celcytotoxiciteit en antivirale werking tegen resistente stammen voor nieuwe antiretrovirale therapieën.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dit onderzoek werd gesteund door de Intramurale Research Program van het NCI.

1. Voorbereiding van de Master Voorraden <ol><li> Maak meester voorraden van de verbindingen te testen in DMSO. Bereid voorraden op een standaard concentratie van 20 mM. Opmerking: elke concentratie van meer dan 10 mm worden gebruikt. Verbindingen die kunnen worden gebruikt als positieve controles voor deze test te valideren omvatten RAL, EVG en DTG. </li><li> Controleer de verbindingen worden opgelost in DMSO door vortexen oplossingen meerdere keren gedurende 15 seconden en incuberen bij kamertemperatuur gedurende 1 uur. Sla de 20 mM voorraadoplossingen in het donker bij -20 ° C tot gebruik. </li></ol> 2. Bereiding van de 96-well platen voor Verbinding Screening <ol><li> Kies de cellijn te testen (bijv. HOS of TZM-bl), en zaden 100 ul van deze cellen bij een dichtheid van 4 x 10 4 cellen / ml (4000 cellen / putje) in medium (bijvoorbeeld Dulbecco&#39;s gemodificeerd Eagle&#39;s of DMEM medium aangevuld met 5% (v / v) foetaal runderserum, 5% pasgeboren kalfsserum en penicilline (50 eenheden / ml) plus streptomycin). </li></ol> 3. Generatie van virusvoorraden Produceren VSV-G-pseudogetypeerde HIV door transfecteren 293-cellen (zie Figuur 1, stap 1) 32-34. <ol><li> Op de dag voor transfectie, plaat 293-cellen in 100 mm schalen met een diameter bij een dichtheid van 1,5 x 10 6 cellen. </li><li> Op de dag van transfectie transfecteren 293-cellen met 16 ug wildtype of mutant HIV (pNLNgoMIVR - ΔLUC) en 4 ug van VSV (pHCMV-G) volgens de calciumfosfaat methode 35. </li><li> Ongeveer 6 uur na de calciumfosfaat precipitaat toegevoegd, was 293-cellen tweemaal met fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) en geïncubeerd met vers medium gedurende 48 uur. [DMEM aangevuld met 5% (v / v) foetaal runderserum, 5% pasgeboren kalfsserum en penicilline (50 eenheden / ml) en streptomycine (50 ug / ml)]. </li><li> Verzamel dan het virus bevattende supernatanten door het verwijderen van het materiaal uit de 100 mm diametergerechten, verduidelijken de bovenstaande vloeistoffen door lage snelheid centrifugeren bij 3000 rpm gedurende 10 min, filteren de bovenstaande vloeistoffen door een 45 um poriegrootte spuitfilter, behandelen de bovenstaande vloeistoffen met Turbo DNase gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur en verdun de bovenstaande vloeistoffen in media voor de voorbereiding op infectie assays . Bewaar de virale supernatanten bevroren, in aliquots bij -80 ° C. Opmerking: de hoeveelheid p24 in de supernatant wordt bepaald door een HIV-1 p24-enzym-gebonden immunosorbent assay kit. De p24-concentratie wordt gebruikt om de hoeveelheid virus in het monster regelen. Ongeveer 500 ng van het virus wordt toegevoegd aan HOS cellen op 60 mm schalen met een diameter bij een dichtheid van 1,5 x 10 5 cellen / schaal op de dag voorafgaand aan infectie. Na 48 uur incubatie worden de cellen geoogst door centrifugeren, gewassen en geresuspendeerd in 100 ui PBS. Voeg een gelijk aantal Luminescentie reporter gen assay reagens en meet luciferaseactiviteit zoals beschreven in sectie 5.4.1 en5.4.2. Hieruit kan een geschikte verdunning van het virus worden gemaakt zoals beschreven in stap 4.6. </li></ol> 4. Verbinding Screening in 96-well platen Screenen elke verbinding in drievoud en de resultaten gemiddeld. Opmerking: het effect van elke verbinding op virale replicatie wordt gecorrigeerd door het normaliseren van het niveau van replicatie verkregen in afwezigheid van verbinding. <ol><li> Bepaal de empirische concentratiegebied worden gescreend. Opmerking: typisch zijn schermen met 11 seriële verdunningen gemaakt door toevoeging van de verbinding aan de kolom voor kolom plaat en schermen met 7 seriële verdunningen worden gemaakt door toevoeging van de verbinding per rij. Een drievoud set van putten moeten worden gereserveerd voor de verbinding geen controle. Bovendien moet een kolom of een rij blanco blijven om als negatieve / achtergrond controle. Tenslotte, of het nu een cellulaire cytotoxiciteit of infectievermogen assay zal bepalen of virus wordt toegevoegd. </li><li> Bereidenseriële verdunningen van de 20 mM voorraadoplossing. De concentraties worden gekozen afhankelijk van het empirisch bepaalde reeks concentraties te testen (zie tabel 1). Bereid de verdunningen in media op 10x de uiteindelijke concentratie gewenst is, dwz als de uiteindelijke concentratie gaat worden 100 uM, maak een 1 mM werkvoorraad. Opmerking: verbindingen met IC 50 s boven 5-10 uM zijn meestal goede kandidaten voor de ontwikkeling van geneesmiddelen. In de eerste analyses testen we de verbindingen alleen tegen de WT vector. Veelbelovende verbindingen die de WT vector effectief remmen worden vervolgens getest tegen een panel van resistente mutanten. </li><li> Verwijder de 96-well platen uit de incubator en voeg de seriële verdunningen van te testen verbindingen aan de putjes in drievoud (zie Figuur 1, stap 2). Opmerking: het volume toegevoegd aan de put moet 1/10 volume van de uiteindelijke concentratie. Zo, voeg 22 ul / putje (eindvolume post virus toevoeging is 220 pi) voor infectiviteitsassays. Voor cytotoxiciteitsanalyses, voeg 11 ul / putje (uiteindelijk volume is 110 ul / putje). </li><li> Zet de 96-well platen in de incubator. Voor een cellulaire cytotoxiciteit scherm, incubeer de 96-well platen 48 uur bij 37 ° C en geen verdere manipulaties nodig zijn in Protocol nr. 4: overgaan tot Protocol nr. 5 Voor infectiviteitsassays, volgt u de instructies in Protocol nr. 4.. </li><li> Infectiviteitsassays alleen. Verwijder de platen uit de incubator na minimaal 3 uur incubatie bij 37 ° C met de verbindingen te analyseren. Opmerking: dit maakt de verbinding tot worden door de cellen voorafgaand aan infectie met het HIV vector. </li><li> Bereid een voorraad verdunning van het virus 33, 34 (meestal ongeveer 1:3) dat een luciferase signaal zal produceren tussen 0,2-1,5 relatieve luciferase-eenheden (RLE) in onbehandelde cellen. Een hele plaat zal ongeveer 10 ml van verwatering nemented virus. Voeg 100 ul van het virus aan elk van de putjes, wordt hetzij een 8 of 12 multichannel pipet. Heeft virus niet toe te voegen aan de negatieve / achtergrond controles. Zet de platen om de 37 ° C incubator gedurende 48 uur. Opmerking: a 1:03 voorraad verdunning van het virus typisch verdunning waarin een luciferase signaal tussen 0,2 -1,5 RLE&#39;s gebaseerd op een p24 assay toont dat de virale concentratie in de bovenstaande vloeistof ongeveer 500 ng in 1,0 ml oplevert. </li></ol> 5. Voorbereiding en meting van de cytotoxiciteit en de besmettelijkheid in 96-well platen <ol><li> Zuig het medium van de putten (fenol rood in de media kan interfereren met de luciferase signaal). Gebruik een glazen pipet met een 200 ul pipet aan het uiteinde. Beginnen aan de top van de media en werk langzaam naar beneden richting de onderste hoek van de put. Niet te veel tijd doorbrengen op de bodem van de put, of cellen kan uit de put worden verwijderd. </li><li> Voeg 100 ul van PBS aangevuld met 0,5 mM MgCl2 aan elk putje. Dit moet onmiddellijk worden gedaan nadat de media wordt verwijderd, zodat de cellen niet uitdrogen. </li><li> Alleen voor cytotoxiciteit assays, voeg 5 ml substraat buffer van de Luminescentie ATP detectietest elk flesje geleverde gevriesdroogd reagens. Een flacon is voldoende voor een 96-wells plaat. <ol><li> Voeg 50 ul van cellysis buffer van de Luminescentie ATP detectietest aan elk putje. Schud de plaat met 96 putjes bij 700 tpm bij kamertemperatuur gedurende 5 min met behulp van een compact thermomixer. </li><li> Voeg 50 ul van gereconstitueerde Luminescentie ATP detectietest reagens aan alle putjes behalve de negatieve controle / achtergrond putjes. Schudden bij 700 tpm bij kamertemperatuur gedurende 5 min met behulp van een compact thermomixer. Incubeer de platen bij kamertemperatuur gedurende 20 min tot tijd signaal groei te bieden. </li><li> Lees de plaat met 96 putjes met de microplaat luminometer. Let op: open de SoftMax Pro microplaat luminometer programma. Zorg ervoor dat de lichtmeter is ingesteld op lumi metennescence bij een gevoeligheid van 5 lezingen / goed. </li></ol></li><li> Alleen voor infectiviteitsassays, voeg 10 ml substraatbuffer van de luminescentie reportergentest om elke flacon geleverd gevriesdroogd reagens. Een flacon volstaat voor elke 96-well plaat. <ol><li> Voeg 100 ul van gereconstitueerde Luminescentie reportergen assay reagens aan elke well. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 20 min tot tijd signaal groei te bieden. </li><li> Lees de 96-well plaat met behulp van een microplaat luminometer zoals uitgevoerd in paragraaf 5.3.3. </li></ol></li></ol> 6. Bepaling van CC50 en IC50 waarden voor verbindingen <ol><li> Breng de luciferase gegevens van de microplaat lichtmeter in een Excel-spreadsheet. <ol><li> Gemiddelde zowel de luciferase gegevens in drievoud en van de achtergrond / stuursignaal data. Trek de gemiddelde achtergrond / stuursignaal van de gemiddelde drievoud signaal voor het gehele concentratiebereik. </li> &lt;li&gt; normaliseren de achtergrond gecorrigeerde signaal voor de concentratiebereiken tegen de activiteit, of het cytotoxiciteit of infectiviteit, in afwezigheid van een verbinding aan het percentage remming te bepalen. Opmerking: percentage remming wordt gedefinieerd als de luciferase-activiteit in aanwezigheid van het geneesmiddel gedeeld door de luciferaseactiviteit in afwezigheid van geneesmiddel vermenigvuldigd met 100. </li></ol></li><li> Gebruik Kaleidagraph softwareprogramma om CC 50 en IC 50-waarden te verkrijgen <ol><li> Transfer zowel de empirisch bepaalde concentratiegebied en het percentage remming van de luciferase-activiteit in Kaleidagraph. </li><li> Plot de gegevens met het concentratiebereik op de x-as en het percentage remming van luciferase activiteit op de y-as. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Mouton, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+protease+inhibitors+on+AIDS-defining+events+and+hospitalizations+in+10+French+AIDS+reference+centres.+Federation+National+des+Centres+de+Lutte+contre+le+SIDA%5BTitle%5D)+AND+%22AIDS%22%5BJournal%5D)">Impact of protease inhibitors on AIDS-defining events and hospitalizations in 10 French AIDS reference centres. Federation National des Centres de Lutte contre le SIDA.</a> AIDS. , 101-105 (1997).</li>
<li>Hammer, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+controlled+trial+of+two+nucleoside+analogues+plus+indinavir+in+persons+with+human+immunodeficiency+virus+infection+and+CD4+cell+counts+of+200+per+cubic+millimeter+or+less+AIDS+Clinical+Trials+Group+320+Study+Team%5BTitle%5D)+AND+%22New+Eng.+J.+Med%22%5BJournal%5D)">A controlled trial of two nucleoside analogues plus indinavir in persons with human immunodeficiency virus infection and CD4 cell counts of 200 per cubic millimeter or less AIDS Clinical Trials Group 320 Study Team.</a> New Eng. J. Med. 337, 725-733 (1997).</li>
<li>Hogg, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+survival+among+HIV-infected+patients+after+initiation+of+triple-drug+antiretroviral+regimens%5BTitle%5D)+AND+%22Can.+Med.+Assoc%22%5BJournal%5D)">Improved survival among HIV-infected patients after initiation of triple-drug antiretroviral regimens.</a> Can. Med. Assoc. 160, 659-665 (1999).</li>
<li>Egger, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+new+antiretroviral+combination+therapies+in+HIV+infected+patients+in+Switzerland%3A+prospective+multicentre+study.+Swiss+HIV+Cohort+Study%5BTitle%5D)+AND+%22BMJ%22%5BJournal%5D)">Impact of new antiretroviral combination therapies in HIV infected patients in Switzerland: prospective multicentre study. Swiss HIV Cohort Study.</a> BMJ. 315, 1194-1199 (1997).</li>
<li>Gulick, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Treatment+with+indinavir%2C+zidovudine%2C+and+lamivudine+in+adults+with+human+immunodeficiency+virus+infection+and+prior+antiretroviral+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22New+Eng.+J.+Med%22%5BJournal%5D)">Treatment with indinavir, zidovudine, and lamivudine in adults with human immunodeficiency virus infection and prior antiretroviral therapy.</a> New Eng. J. Med. 337, 734-739 (1997).</li>
<li>Perelson, A. S., Neumann, A. U., Markowitz, M., Leonard, J. M., Ho, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV-1+dynamics+in+vivo%3A+virion+clearance+rate%2C+infected+cell+life-span%2C+and+viral+generation+time%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">HIV-1 dynamics in vivo: virion clearance rate, infected cell life-span, and viral generation time.</a> Science. 271, 1582-1586 (1996).</li>
<li>Simoni, J. M., Amico, K. R., Pearson, C. R., Malow, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strategies+for+promoting+adherence+to+antiretroviral+therapy%3A+a+review+of+the+literature%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Infect.+Dis.+Rep%22%5BJournal%5D)">Strategies for promoting adherence to antiretroviral therapy: a review of the literature.</a> Curr. Infect. Dis. Rep. 10, 515-521 (2008).</li>
<li>Simoni, J. M., Amico, K. R., Smith, L., Nelson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antiretroviral+adherence+interventions%3A+translating+research+findings+to+the+real+world+clinic%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+HIV%2FAIDS+Rep%22%5BJournal%5D)">Antiretroviral adherence interventions: translating research findings to the real world clinic.</a> Curr. HIV/AIDS Rep. 7, 44-51 (2010).</li>
<li>Volberding, P. A., Deeks, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antiretroviral+therapy+and+management+of+HIV+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Antiretroviral therapy and management of HIV infection.</a> Lancet. 376, 49-62 (2010).</li>
<li>Acosta, E. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+method+to+assess+antiretroviral+target+trough+concentrations+using+in+vitro+susceptibility+data%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicr%22%5BJournal%5D)">Novel method to assess antiretroviral target trough concentrations using in vitro susceptibility data.</a> Antimicr. 56, 5938-5945 (2012).</li>
<li>Rockstroh, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+treatment+with+raltegravir+or+efavirenz+combined+with+tenofovir%2Femtricitabine+for+treatment-naive+human+immunodeficiency+virus-1-infected+patients%3A+156-week+results+from+STARTMRK%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">Long-term treatment with raltegravir or efavirenz combined with tenofovir/emtricitabine for treatment-naive human immunodeficiency virus-1-infected patients: 156-week results from STARTMRK.</a> Clin. Infect. Dis. 53, 807-816 (2011).</li>
<li>Fernandez-Montero, J. V., Eugenia, E., Barreiro, P., Labarga, P., Soriano, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antiretroviral+drug-related+toxicities+-+clinical+spectrum%2C+prevention%2C+and+management%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Opin.+Drug+Safety%22%5BJournal%5D)">Antiretroviral drug-related toxicities - clinical spectrum, prevention, and management.</a> Exp. Opin. Drug Safety. , (2013).</li>
<li>Lunzen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Once+daily+dolutegravir+%28S%2FGSK1349572%29+in+combination+therapy+in+antiretroviral-naive+adults+with+HIV%3A+planned+interim+48+week+results+from+SPRING-1%2C+a+dose-ranging%2C+randomised%2C+phase+2b+trial%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Once daily dolutegravir (S/GSK1349572) in combination therapy in antiretroviral-naive adults with HIV: planned interim 48 week results from SPRING-1, a dose-ranging, randomised, phase 2b trial.</a> Lancet Infect Dis. 12, 111-118 (2012).</li>
<li>Sax, P. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Co-formulated+elvitegravir%2C+cobicistat%2C+emtricitabine%2C+and+tenofovir+versus+co-formulated+efavirenz%2C+emtricitabine%2C+and+tenofovir+for+initial+treatment+of+HIV-1+infection%3A+a+randomised%2C+double-blind%2C+phase+3+trial%2C+analysis+of+results+after+48+weeks%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Co-formulated elvitegravir, cobicistat, emtricitabine, and tenofovir versus co-formulated efavirenz, emtricitabine, and tenofovir for initial treatment of HIV-1 infection: a randomised, double-blind, phase 3 trial, analysis of results after 48 weeks.</a> Lancet. 379, 2439-2448 (2012).</li>
<li>Sax, P. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Abacavir%2Flamivudine+versus+tenofovir+DF%2Femtricitabine+as+part+of+combination+regimens+for+initial+treatment+of+HIV%3A+final+results%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">Abacavir/lamivudine versus tenofovir DF/emtricitabine as part of combination regimens for initial treatment of HIV: final results.</a> Infect. Dis. 204, 1191-1201 (2011).</li>
<li>Kellam, P., Larder, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recombinant+virus+assay%3A+a+rapid%2C+phenotypic+assay+for+assessment+of+drug+susceptibility+of+human+immunodeficiency+virus+type+1+isolates%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicr.+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Recombinant virus assay: a rapid, phenotypic assay for assessment of drug susceptibility of human immunodeficiency virus type 1 isolates.</a> Antimicr. Agents Chemother. 38, 23-30 (1994).</li>
<li>Hertogs, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+method+for+simultaneous+detection+of+phenotypic+resistance+to+inhibitors+of+protease+and+reverse+transcriptase+in+recombinant+human+immunodeficiency+virus+type+1+isolates+from+patients+treated+with+antiretroviral+drugs%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicr.+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">A rapid method for simultaneous detection of phenotypic resistance to inhibitors of protease and reverse transcriptase in recombinant human immunodeficiency virus type 1 isolates from patients treated with antiretroviral drugs.</a> Antimicr. Agents Chemother. 42, 269-276 (1998).</li>
<li>Petropoulos, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+phenotypic+drug+susceptibility+assay+for+human+immunodeficiency+virus+type+1%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicr.+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">A novel phenotypic drug susceptibility assay for human immunodeficiency virus type 1.</a> Antimicr. Agents Chemother. 44, 920-928 (2000).</li>
<li>Engelman, A., Mizuuchi, K., Craigie, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV-1+DNA+integration%3A+mechanism+of+viral+DNA+cleavage+and+DNA+strand+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">HIV-1 DNA integration: mechanism of viral DNA cleavage and DNA strand transfer.</a> Cell. 67, 1211-1221 (1991).</li>
<li>Hazuda, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibitors+of+strand+transfer+that+prevent+integration+and+inhibit+HIV-1+replication+in+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Inhibitors of strand transfer that prevent integration and inhibit HIV-1 replication in cells.</a> Science. 287, 646-650 (2000).</li>
<li>Nguyen, B. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Raltegravir%3A+the+first+HIV-1+integrase+strand+transfer+inhibitor+in+the+HIV+armamentarium%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+N.Y.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Raltegravir: the first HIV-1 integrase strand transfer inhibitor in the HIV armamentarium.</a> Ann. N.Y. Acad. Sci. 1222, 83-89 (2011).</li>
<li>Wills, T., Vega, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elvitegravir%3A+a+once-daily+inhibitor+of+HIV-1+integrase%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Opin.+Invest.+Drugs%22%5BJournal%5D)">Elvitegravir: a once-daily inhibitor of HIV-1 integrase.</a> Exp. Opin. Invest. Drugs. 21, 395-401 (2012).</li>
<li>Kobayashi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Vitro+antiretroviral+properties+of+S%2FGSK1349572%2C+a+next-generation+HIV+integrase+inhibitor%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicr.+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">In Vitro antiretroviral properties of S/GSK1349572, a next-generation HIV integrase inhibitor.</a> Antimicr. Agents Chemother. 55, 813-821 (2011).</li>
<li>Cooper, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subgroup+and+resistance+analyses+of+raltegravir+for+resistant+HIV-1+infection.+Eng%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Med%22%5BJournal%5D)">Subgroup and resistance analyses of raltegravir for resistant HIV-1 infection. Eng.</a> J. Med. 359, 355-365 (2008).</li>
<li>Briz, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Raltegravir+and+etravirine+are+active+against+HIV+type+1+group+O%5BTitle%5D)+AND+%22AIDS+Res.Human+Retroviruses%22%5BJournal%5D)">Raltegravir and etravirine are active against HIV type 1 group O.</a> AIDS Res.Human Retroviruses. 25, 225-227 (2009).</li>
<li>Fransen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+raltegravir+susceptibility+by+human+immunodeficiency+virus+type+1+is+conferred+via+multiple+nonoverlapping+genetic+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Loss of raltegravir susceptibility by human immunodeficiency virus type 1 is conferred via multiple nonoverlapping genetic pathways.</a> J. Virol. 83, 11440-11446 (2009).</li>
<li>Goethals, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+mutations+selected+in+vitro+with+raltegravir+confer+large+fold+changes+in+susceptibility+to+first-generation+integrase+inhibitors%2C+but+minor+fold+changes+to+inhibitors+with+second-generation+resistance+profiles%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Primary mutations selected in vitro with raltegravir confer large fold changes in susceptibility to first-generation integrase inhibitors, but minor fold changes to inhibitors with second-generation resistance profiles.</a> Virology. 402, 338-346 (2010).</li>
<li>Goethals, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resistance+mutations+in+human+immunodeficiency+virus+type+1+integrase+selected+with+elvitegravir+confer+reduced+susceptibility+to+a+wide+range+of+integrase+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Resistance mutations in human immunodeficiency virus type 1 integrase selected with elvitegravir confer reduced susceptibility to a wide range of integrase inhibitors.</a> J. Virol. 82, 10366-10374 (2008).</li>
<li>Canducci, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+patterns+of+human+immunodeficiency+virus+type+1+integrase+gene+evolution+in+patients+failing+raltegravir-based+salvage+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22AIDS%22%5BJournal%5D)">Dynamic patterns of human immunodeficiency virus type 1 integrase gene evolution in patients failing raltegravir-based salvage therapies.</a> AIDS. 23, 455-460 (2009).</li>
<li>Ceccherini-Silberstein, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+and+structural+analysis+of+HIV-1+integrase+conservation%5BTitle%5D)+AND+%22AIDS+Rev%22%5BJournal%5D)">Characterization and structural analysis of HIV-1 integrase conservation.</a> AIDS Rev. 11, 17-29 (2009).</li>
<li>Charpentier, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug+resistance+profiles+for+the+HIV+integrase+gene+in+patients+failing+raltegravir+salvage+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22HIV+Med%22%5BJournal%5D)">Drug resistance profiles for the HIV integrase gene in patients failing raltegravir salvage therapy.</a> HIV Med. 9, 765-770 (2008).</li>
<li>Julias, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+mutations+in+the+G+tract+of+the+human+immunodeficiency+virus+type+1+polypurine+tract+on+virus+replication+and+RNase+H+cleavage%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Effects of mutations in the G tract of the human immunodeficiency virus type 1 polypurine tract on virus replication and RNase H cleavage.</a> J. Virol. 78, 13315-13324 (2004).</li>
<li>Hare, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+and+functional+analyses+of+the+second-generation+integrase+strand+transfer+inhibitor+dolutegravir+%28S%2FGSK1349572%29%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Structural and functional analyses of the second-generation integrase strand transfer inhibitor dolutegravir (S/GSK1349572).</a> Mol. Pharmacol. 80, 565-572 (2011).</li>
<li>Adachi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+acquired+immunodeficiency+syndrome-associated+retrovirus+in+human+and+nonhuman+cells+transfected+with+an+infectious+molecular+clone%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Production of acquired immunodeficiency syndrome-associated retrovirus in human and nonhuman cells transfected with an infectious molecular clone.</a> J. Virol. 59, 284-291 (1986).</li>
<li>Kemp, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+polymorphism+at+codon+333+of+human+immunodeficiency+virus+type+1+reverse+transcriptase+can+facilitate+dual+resistance+to+zidovudine+and+L-2%27%2C3%27-dideoxy-3%27-thiacytidine%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">A novel polymorphism at codon 333 of human immunodeficiency virus type 1 reverse transcriptase can facilitate dual resistance to zidovudine and L-2',3'-dideoxy-3'-thiacytidine.</a> J. Virol. 72, 5093-5098 (1998).</li>
<li>Butler, S. L., Hansen, M. S., Bushman, F. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+quantitative+assay+for+HIV+DNA+integration+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">A quantitative assay for HIV DNA integration in vivo.</a> Nat. Med. 7, 631-634 (2001).</li>
<li>Brussel, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Longitudinal+monitoring+of+2-long+terminal+repeat+circles+in+peripheral+blood+mononuclear+cells+from+patients+with+chronic+HIV-1+infection%5BTitle%5D)+AND+%22AIDS%22%5BJournal%5D)">Longitudinal monitoring of 2-long terminal repeat circles in peripheral blood mononuclear cells from patients with chronic HIV-1 infection.</a> AIDS. 17, 645-652 (2003).</li>
<li>Daelemans, D., Pauwels, R., De Clercq, E., Pannecouque, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+time-of-drug+addition+approach+to+target+identification+of+antiviral+compounds%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">A time-of-drug addition approach to target identification of antiviral compounds.</a> Nat. Protoc. 6, 925-933 (2011).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

We beschrijven een snelle, efficiënte en reproduceerbare test die kan worden gebruikt voor het screenen voor verbindingen cytotoxiciteit en hun vermogen om de replicatie van zowel WT en resistente HIV-1 remmen. De mogelijkheid om snel verbindingen identificeren en testen hun doeltreffendheid en cytotoxiciteit is cruciaal voor de ontwikkeling van nieuwe en betere geneesmiddelen tegen HIV-1. Zodra loodverbindingen zijn geïdentificeerd, kunnen analogen van de loodverbinding worden bereid en getest met gebruikmaking van dezelfde assay. De bepaling is relatief eenvoudig. Er zijn zowel positieve als negatieve controles die de gebruiker toestaan ​​om de meest voorkomende problemen (toxische verbindingen, problemen met de vector stock) te diagnosticeren. Het gebruik van een drievoudige reeks putjes zonder toegevoegde verbinding blijkt dat virale infectie heeft plaatsgevonden. Dat cytotoxiciteit wordt gemeten in een onafhankelijke test voorkomt verkeerd verlaging van luciferase door cytotoxiciteit als een specifiek effect op virale replicatie. De kritische stappenin het protocol bereiden de platen zodat de cellen gelijkmatig verdeeld in de putjes die de putjes de juiste concentraties van de te testen verbindingen, toevoegen van dezelfde hoeveelheid virus aan elk van de putjes en het meten van de luciferase activiteit bepalen de CC 50 en IC 50-waarden. De test is veilig, kwantitatieve en reproduceerbare. De test is veilig omdat de vector replicatie defect. De bepaling is kwantitatief en reproduceerbaar omdat het gebaseerd is op een enkele ronde vector die luciferase tot expressie, die nauwkeurig en gemakkelijk kan worden getest. In een multi ronde virusreplicatie assay gemeten IC50 afhankelijk van het aantal virale levenscycli; Dit is vooral een probleem wanneer de testen te betrekken zowel WT en resistente virussen die significant verschillend replicatie capaciteiten kunnen hebben. Er zijn verschillende enzymatische assays eerder gemeld dat kanworden gebruikt om te screenen op remmers IN. Testen die real-time PCR-technologie te betrekken bij geïntegreerde DNA meten vereisen gezuiverde recombinante eiwitten (s), en zijn in het algemeen, zowel meer arbeidsintensief en duur 36, 37. Hoewel het mogelijk is om enzymatische assays om het effect van verbindingen op de andere virale enzymen (RT en protease) meten elk enzym vereist zijn eigen testsysteem. De een ronde vector assay, zoals beschreven, kunnen worden gebruikt zonder modificatie te screenen op RT inhibitoren. Een vergelijkbare test kan worden gebruikt om te screenen op proteaseremmers; In een proteaseremmer assay, de verbindingen worden toegevoegd aan de cellen die de vectoren. Een verwante test met verschillende cellen en vectoren kunnen ook worden gebruikt om te screenen op middelen (env) en HIV ingang fusieinhibitors. Ten slotte kan de test worden gebruikt, op grotere schaal, met geautomatiseerde robot dispensers. Aldus kan de assay worden gebruikt om grote bibliotheken van verbindingen te screenen tegen WT en mutant HIV. Echter, het feit dat de test kan een remmer van HIV-replicatie die in verschillende fases van de virale levenscyclus wijst op een beperking in de interpretatie van de gegevens te detecteren. Door zelf de test niet bepalen welke stap in de levenscyclus wordt geblokkeerd door een verbinding. Als deze vraag kan worden opgelost door de tijd van toevoeging assays 38 en door het testen van de verbinding tegen gezuiverde recombinante virale eiwitten. Helaas, ondanks het succes van anti HIV medicijnen, zijn er nog steeds problemen met zowel weerstand en toxiciteit. Aangezien een effectieve anti HIV-vaccin, is het niet alleen nodig om nieuwe therapeutische geneesmiddelen die effectief zijn tegen bestaande resistente mutanten, maar ook voor profylactische geneesmiddelen die de verspreiding van het virus kan reduceren ontwikkelen. Als het profylactisch gebruik van anti HIV drugs incudes de behandeling van niet-geïnfecteerde mensen, zal deze aanpak een bijzondere last leggen op de ontwikkeling van geneesmiddelen die worden hebben little of geen toxiciteit op lange termijn.

De beschikbaarheid van geneesmiddelen gericht op verschillende essentiële stappen in de HIV-1 virale levenscyclus heeft geleid tot gecombineerde therapie (zogenaamde actieve anti retrovirale therapie, of HAART) die sterk verbeterd de behandeling van HIV-1 infecties en de lange termijn overleving patiënten. HAART, die doorgaans gebruikt combinaties van twee nucleoside reverse transcriptase (RT)-remmers en ofwel een proteaseremmer of een non-nucleoside RT-remmer, is nu omgebouwd van een dodelijke ziekte in een levenslange aandoening 1-5. Ondanks de vele successen van HAART in aanhoudende onderdrukking van virale replicatie, heeft het beperkingen. HAART niet uit te roeien HIV, zodat de patiënten niet genezen en therapie is het leven lang. Er zijn problemen met drugs toxiciteit en met de opkomst van resistente stammen. Resistentie kan ontstaan ​​voor alle goedgekeurde anti HIV drugs, waaronder de onlangs goedgekeurde geneesmiddelen die HIV integrase (IN) richten. Drug resistentie waarschijnlijk ontstaat becagebruik van spontane mutaties die optreden tijdens virale replicatie (foutenmarge van 3 x 10 -5 mutaties / base / replicatie cyclus) 6. Wanneer mutaties optreden in genen die coderen voor de doelwitten van anti remmers, zal een kleine subset van deze mutaties leiden tot een afname in de gevoeligheid van de virale stam voor de drugs. Om de ontwikkeling van resistentie tegen geneesmiddelen te voorkomen, moet drugconcentraties worden gehandhaafd op een niveau dat HIV-replicatie volledig te onderdrukken. Slechte therapietrouw van het therapeutische regime verergert het probleem, en kan leiden tot de snelle ontwikkeling van resistentie 7-9. Hoewel de concentraties van het geneesmiddel kan variëren in patiënten als gevolg van verschillen in de absorptie, metabolisme, verspreiding en excretie, kunnen hoge concentraties van geneesmiddelen leiden tot toxiciteit 10. Sinds therapie blijft voor het leven van de patiënt, zijn er ernstige bezorgdheid over de veiligheid van de toxiciteit op lange termijn van de anti retrovirale medicijnen. De anti-retrovirale medicijnen vaak gebruikt in HAART kan nadelige gevolgen hebbennd zijn er incidenten waarbij de bijwerkingen zijn levensbedreigende 11-15 geweest. De patiënten ondervinden problemen bij de ontwikkeling van resistentie en toxiciteit ten grondslag aan de behoefte om nieuwe geneesmiddelen die effectief blokkeert de replicatie van het gemeenschappelijk resistente stammen van het virus met toxiciteit weinig of geen lange termijn ontwikkelen. Er is dus een behoefte aan een test die kan screenen op verbindingen die essentiële stappen blok in de virale levenscyclus snel. Hier beschrijven we een efficiënte test die kan worden gebruikt om de cytotoxiciteit van de verbindingen en hun vermogen om de replicatie van zowel WT en resistente HIV-stammen snel en efficiënt blokkeren evalueren. De test die we gebruiken is vergelijkbaar met een test die is ontwikkeld voor het screenen van geneesmiddelen resistentie van het virus geïsoleerd uit patiënten 16-18. Hoewel de test zonder wijziging scherm kan worden gebruikt voor verbindingen die HIV reverse transcriptie blokkeren, zullen we describe met de test te evalueren IN remmers. IN een essentieel viraal enzym dat het virale DNA in het cellulaire genoom 19 ingevoegd. Hoewel een aantal veelbelovende IN remmers ontwikkeld, waarvan sommige momenteel klinische proeven slechts Isentress 20, 21 (ook bekend als Raltegravir of RAL) en meer recent, Elvitegravir (EVG) 22 en Dolutegravir (DTG) 23 zijn goedgekeurd door de FDA. Deze verbindingen zijn actief tegen zowel HIV B&#39;s niet B subtypes in celkweek en bij patiënten 24, 25. Echter, de behandeling met RAL selecteert voor resistente HIV-1 IN mutanten, waaronder Y143R, N155H en G140S/Q148H 24, 26-31. N155H en G140S/Q148H ook de werkzaamheid van EVG, die de noodzaak voor het ontwerpen en ontwikkelen van de tweede generatie IN strand transfer inhibitoren (INSTIs) die effectief zijn tegen deze resistente mutaties zijn benadrukt verminderen.

<table><tbody><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Corning Cellgro</td><td>10-017</td><td></td></tr><tr><td>ATPlite Luminescence ATP Detection Assay System</td><td>Perkin Elmer</td><td>6016941</td><td></td></tr><tr><td>Steady Lite Plus High Sensitivity Luminescence Reporter Gene Assay System</td><td>Perkin Elmer</td><td>6016751</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's PBS</td><td>Gibco-Life Technologies-Invitrogen</td><td>14190-136</td><td></td></tr><tr><td>SpectraMax Gemini EM</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td></td></tr><tr><td>KaleidaGraph</td><td>Synergy Software</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nunc F96 Microwell White Polystyrene Plate</td><td>Thomas Scientific</td><td>12-566-26</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Thermomixer Compact</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T1442-1EA</td><td></td></tr><tr><td>Turbo DNase</td><td>Ambion-Life Technologies-Invitrogen</td><td>AM2238</td><td></td></tr><tr><td>Millex HA Filter Unit, 0.45 &micro;M</td><td>Millipore</td><td>SLAHA033SS</td><td></td></tr><tr><td>Alliance HIV-1 p24 Elisa Kit</td><td>Perkin Elmer</td><td>NEK050B001KT</td><td></td></tr><tr><td>HOS cells</td><td>ATCC</td><td>CRL-1543</td><td></td></tr><tr><td>TZM-bl cells</td><td>NIH AIDS Reagent Program</td><td>8129</td><td></td></tr><tr><td>pNL4.3&Delta;Env.LUC</td><td>NIH-NCI HIV Drug Resistance Program- Hughes Lab</td><td></td><td></td></tr><tr><td>VSV-G</td><td>NIH-NCI HIV Drug Resistance Program- Hughes Lab</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SoftMax Pro</td><td>Molecular Devices</td><td>0200-310</td><td></td></tr></tbody></table>

snelle screening van hiv reverse transcriptase en integrase-remmers

Rapid Screening of HIV Reverse Transcriptase and Integrase Inhibitors

Hoewel een aantal anti HIV geneesmiddelen zijn goedgekeurd, zijn er nog steeds problemen met toxiciteit en geneesmiddelresistentie. Dit toont behoefte om nieuwe verbindingen die infectie kan remmen door het gemeenschappelijk resistente HIV-1 stammen met minimale toxiciteit identificeren. Hier beschrijven we een efficiënte test die kan worden gebruikt om snel bepalen van de cellulaire cytotoxiciteit en werkzaamheid van een verbinding met WT en mutante virusstammen. Het gewenste doel cellijn wordt geënt in een 96-well plaat en, na 24 uur incubatie serieel verdunningen van de te testen verbindingen toegevoegd. Verdere manipulaties vereist voor cellulaire cytotoxiciteit assays; anti HIV-testen een vooraf bepaalde hoeveelheid ofwel een WT of geneesmiddel resistente HIV-1 vector die expressie luciferase wordt toegevoegd aan de cellen. De cytotoxiciteit wordt gemeten met een ATP-afhankelijke luminescentie assay en het effect van de verbindingen op infectiviteit wordt gemeten door de hoeveelheid luciferase in aanwezigheid of afwezigheid van het vermeende remmers. Deze screening test duurt 4 dagen in beslag en meerdere verbindingen kunnen worden gescreend parallel. Verbindingen worden vertoond in drievoud en de gegevens worden genormaliseerd om de besmettelijkheid / ATP-niveaus in afwezigheid van doelverbindingen. Deze techniek biedt een snelle en nauwkeurige meting van de werkzaamheid en toxiciteit van potentiële anti HIV stoffen.

Indien de test (Figuur 1, stap 1 en 2) werd met succes uitgevoerd, dan is de luciferase waarden moeten de in tabel 2 gegevens lijken scannen over het concentratiebereik.; een potentieel krachtige verbinding onthullen toenemende luciferaseactiviteit van links naar rechts, en de besturing moet de hoogste luciferase activiteit. Als de luciferase activiteit niet hoger is dan 0,1 Relatieve Luciferase Units (RLE) over het concentratiegebied, dit geeft meestal aan dat de verbinding doodde de cellen. Als de luciferase gegevens groter dan of gelijk aan 2,0 RLE&#39;s in alle seriële verdunningen, vervolgens de verbindingen waren niet in staat HIV-1 infecties bij de geteste concentraties remmen. Uitzetten van de concentratie van de verbindingen tegen het percentage remming van luciferaseactiviteit in Kaleidagraph (tabel 3, deel A), na het uitvoeren van lineaire regressieanalyse zullen resultaten zoals t produceren<html> slang in tabel 3, deel B. <img alt="Figuur 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51400/51400fig1highres.jpg" width="500" /> Figuur 1. Bereiding van HIV-1 virale voorraden en het instellen van cellulaire cytotoxiciteit en Single-round infectiviteitsassays. In stap 1, 293T cellen worden getransfecteerd met pNL4.3ΔEnv.LUC en VSV-G en gedurende 48 uur tot 34 virus te produceren . Het virus wordt geoogst en bewaard (bij -80 ° C in aliquots ingevroren) totdat het wordt gebruikt in de infectiviteitsassays. In stap 2 worden HOS-cellen uitgezaaid in een 96-wells plaat en geïncubeerd gedurende 24 uur. De cellen worden vervolgens geïncubeerd met seriële verdunningen van de te onderzoeken verbindingen 3 uur en vervolgens geïnfecteerd met virus (zowel WT en resistente). Na 48 uur incubatie wordt luciferaseactiviteit gemeten. le1.jpg &quot;width =&quot; 300 &quot;/&gt; Tabel 1. Drug Screening seriële verdunning Prototype. Een strengere screening omvat 11 seriële verdunningen die meestal beginnen bij 10 uM en eindigen op 0,0005 uM. De seriële verdunningen worden bereid 10x; er 100 ul cellen en 100 ul virus per putje). Op dit volume en na deze berekeningen de seriële verdunningen genoeg voor 3 rijen een volledige 96-putjesplaat zijn. De cytotoxiciteit assays zijn op overeenkomstige wijze bereid; maar de 11 seriële verdunningen beginnen bij 250 uM en eindigt bij 0,05 uM. Slechts 11 ul van de verdunningen worden toegevoegd aan de putjes in de plaat die 100 ul van cellen bevatten. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51400/51400table1.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.</a> <img alt="Tabel 2" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51400/51400table2.jpg" width="600" /><br/&gt; Tabel 2. Luciferaseactiviteit Signaal data uitlezing en bepaling van het percentage remming van luciferase-activiteit. De gegevens tabel toont een typische set van luciferase gegevens voor een succesvolle verbinding. De tabel toont ook de extra berekeningen die nodig zijn om het percentage remming van de luciferase activiteit en de CC-50 en IC 50-waarden te bepalen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51400/51400table2.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.</a> <img alt="Tabel 3" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51400/51400table3.jpg" width="600" /> Tabel 3. Lineaire regressie-analyse Data Table. Deel A. Grafieken van het gebruikte concentratiebereik versus het percentage remming van de luciferase activiteit in Kaleidagraph zal de nodige remmingskrommen produceren. Deel B, worden de remmingscurven gedefinieerd door de 3 parametrischesigmoïdale functie en fit aan de data door middel van lineaire regressie-analyse 18. Deze data tabel wordt vervolgens gebruikt in combinatie met Microsoft Excel om de drug concentraties die nodig zijn om het virus integratie en cellulaire cytotoxiciteit remmen met 50%, bijvoorbeeld IC 50 en CC 50 berekenen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51400/51400table3.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.</a>

Hier beschrijven we cellulaire cytotoxiciteit en ronde infectiviteitsassays die zorgen voor een snelle en nauwkeurige screening van verbindingen om hun cellulaire cytotoxiciteit (CC50) bepalen en IC 50-waarden tegen WT en resistente HIV-1.

Snelle screening van HIV reverse transcriptase en integrase-remmers

Although a number of anti HIV drugs have been approved, there are still problems with toxicity and drug resistance. This demonstrates a need to identify ...

Het algemene doel van het volgende experiment is om interessante verbindingen te screenen om hun cellulaire cytotoxiciteit en het vermogen om wild-type of drug-resistente HIV-1 te remmen vast te stellen in een single-round infectiviteitsassay. Dit wordt bereikt door de cellen eerst bloot te stellen aan de verbindingen voor opname en de behandelde cellen vervolgens te incuberen met luciferase-expresserend wild-type of drug-resistente HIV-1. De luciferase-activiteit van het virus kan vervolgens worden gemeten.Uiteindelijk kan het luciferase-uitleessignaal worden gebruikt om de remming van de replicatie van de HIV V1-virale vector door de verbindingen te kwantificeren. Deze techniek heeft therapeutische implicaties, aangezien deze kan worden gebruikt om nieuwe verbindingen te screenen die een betere werkzaamheid vertonen tegen drugresistent HIV. Dergelijke verbindingen zouden potentieel kunnen worden ingezet in antiretrovirale therapieën bij HIV-1-patiënten. Plate de dag vóór transfectie 293-cellen op 100 millimeter schalen met een dichtheid van 1.500.000 cellen.Transfect de cellen de volgende dag met 16 microgram wildtype of mutant HIV en vier microgram VSV met behulp van de calciumfosfaatmethode. Spoel de 293-cellen ongeveer zes uur later twee keer met PBS en incubeer ze vervolgens gedurende 48 uur in vers medium. Oogst twee dagen later de virusbevattende supernatanten uit de schalen met een diameter van 100 millimeter en clarificeer de supernatanten door middel van laagtoerige centrifugatie gedurende 10 minuten bij 1.620 Gs bij kamertemperatuur.Filter vervolgens de supernatanten door een spuitfilter met een poriegrootte van 45 µm en behandel de virale suspensies met turbo DNase. Verdun na 30 minuten bij kamertemperatuur het virus met vers medium en bewaar dit bij -80 °C. Om de screening van de verbindingen in een infectie-assay uit te voeren, zaai dan de dag vóór het experiment 4.000 van de betreffende cellen uit in elke put van een 96-well plaat.Vul de wellplaat met 100 µL medium en incubeer deze op 37 °C in 5% CO2. Na 24 uur wordt de verbinding uit de stockoplossing in vers medium serieel verdund. De gekozen uiteindelijke concentraties zijn afhankelijk van een empirisch bepaald concentratiebereik, zoals beschreven in de tabel.Voeg vervolgens de seriële verdunningen van de verbindingen in triplikaat toe aan de wells. Incubeer bij een volume van een tiende van de uiteindelijke concentratie de juiste verdunning van de verbindingen gedurende minimaal drie uur met de cellen. Gebruik na de incubatie een multichannelpipet om 100 µL verdund virus aan elke well toe te voegen.Accepteer de wells van de negatieve controle. Incubeer de platen vervolgens nogmaals 48 uur. Gebruik na de incubatie een glazen pipet uitgerust met een 200 µL pipetpunt om het medium uit de wells te aspireren, beginnend aan de bovenzijde van het medium en langzaam naar de onderste hoek van de well werkend.Voeg onmiddellijk 100 µL PBS aangevuld met 0,5 mM magnesiumchloride toe aan elke well. Voeg vervolgens, om de luciferase-activiteit te meten, 10 µL van de substraatbuffer van de luminescentie-reportergenassay toe aan elk vial van het meegeleverde gelyofiliseerde reagens. Voeg daarna 100 µL van het gereconstitueerde reagens toe aan elke well en incubeer de plaat gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur zodat het signaal zich kan ontwikkelen. Lees tot slot de 96-wells plaat uit met een microplate-luminometer.De luciferase-waarden uit een succesvolle compound-screeningprocedure worden in de tabel gepresenteerd. Let op dat potentieel krachtige verbindingen een toenemende luciferase-activiteit vertonen, waarbij de controle het hoogste signaal geeft in dit representatieve Kaleido-transplantaat. De concentratie van de verbinding tegenover het inhibitiepercentage van de luciferase-activiteit is uitgezet om te bepalen of de verbinding effectief is in het remmen van de replicatie van het wild-type of drug-resistente HIV.Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om een uniforme hoeveelheid cellen en virus nauwkeurig over alle wells van de platen te verdelen, en om ervoor te zorgen dat de juiste concentratie verbindingen in elke well wordt aangebracht.

rapid-screening-of-hiv-reverse-transcriptase-and-integrase-inhibitors

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Source: Scarborough, R. J., et al. Evaluation of the Efficacy And Toxicity of RNAs Targeting HIV-1 Production for Use in Gene or Drug Therapy. J. Vis. Exp. (2016).This video demonstrates a reverse transcriptase (RT) assay to assess the effect of a test RNA on virus-like particle (VLP) production. Cells are co-transfected with plasmids, and RT activity is measured as a quantitative indicator of VLP output. A decrease in RT activity reflects suppression of viral gene expression by the test RNA.

Reverse Transcriptase Activity as a Marker for Virus-Like Particle Production

In vitro assays om virusreplicatie te meten zijn sterk verbeterd door de ontwikkeling van recombinante RNA-virussen tot expressie luciferase of andere enzymen die in staat bioluminescentie. Hier hebben we detail een high-throughput screening pijplijn dat dergelijke recombinante stammen van mazelen en chikungunya virussen breed-spectrum antivirale middelen te isoleren van chemische bibliotheken combineert.

High-throughput screening voor Breed-spectrum Chemische Remmers van RNA-virussen

Drug resistentie testen voor HIV-1 geïnfecteerde individuen falende antiretrovirale therapie (ART) kan toekomstige therapieën begeleiden en verbeteren behandelingsresultaten. Het optimaliseren van de individuele en de bevolking gezondheidsresultaten in hoge HIV-prevalentie, maar met beperkte middelen zal uiteindelijk vereisen betaalbaar en toegankelijk resistentie genotypering en interpretatie methoden.

Een betaalbare HIV-1 drug-resistentie Monitoring Methode voor het met beperkte middelen

Dit rapport beschrijft een in vitro test voor het meten van de human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) preintegratiecomplex (PIC)-geassocieerde integratie-activiteit in de cytoplasmatische extracten van acuut geïnfecteerde cellen. De integratie van PIC-geassocieerd HIV-1 DNA in heteroloog doel-DNA wordt gekwantificeerd door middel van een geneste real-time polymerasekettingreactiestrategie.

Meting van<em&gt; In Vitro</em&gt; Integratie activiteit van HIV-1 Preintegration Complexen

Dit manuscript beschrijft de experimentele procedure en software analyse voor een bidirectionele integratie site analyse die tegelijkertijd upstream en downstream vector-host junction DNA kan analyseren. Bidirectionele PCR producten kunnen worden gebruikt voor elk downstream sequencing platform. De resulterende gegevens zijn bruikbaar voor een high-throughput, kwantitatieve vergelijking van geïntegreerde DNA-doelen.

Tweerichtings retrovirale integratie site PCR methodologie en kwantitatieve data analyse werkstroom

We beschrijven een cel-gebaseerde test om te melden aan de HIV-1 fusion via de uitdrukking van groen fluorescent proteïne aantoonbaar door stroom cytometry of fluorescentie microscopie. Het kan worden gebruikt voor het testen van remmers van virale toegang (specifiek aan de fusie stap) in cel-vrij en cel-naar-cel infectie systemen.

Een High-throughput Cre-Lox geactiveerd virale membraan Fusion Assay ter identificatie van de Inhibitors van HIV-1 virale membraan Fusion

Hier presenteren we een diepe rangschikken benadering waarmee een onbevooroordeelde bepaling van ontluikende 3'-termini en vogelgriepvirus profielen van single-stranded DNA moleculen. De belangrijkste toepassing is de karakterisatie van ontluikende retrovirale complementaire Ani (cDNAs), de tussenproducten die tijdens het proces van retrovirale omgekeerde transcriptie gegenereerd.

Bepalende 3'-Termini en sequenties van ontluikende Single-Stranded virale DNA moleculen tijdens HIV-1 Reverse transcriptie in geïnfecteerde cellen

Een hoge doorvoersnelheid protocol voor functionele beoordeling van efficiënte reactivering van HIV en de ontmijning van latente proviruses is beschreven en toegepast door het testen van het effect van interventies op HIV transcriptie, egaliseren en lamineren. Representatieve resultaten van het effect van latentie omkering van agenten op LTR-gedreven transcriptie, egaliseren en lamineren zijn verstrekt.

High Throughput In Vitro beoordeling van latentie omkering van agenten op HIV transcriptie, egaliseren en lamineren

In dit werk beschrijven we de protocollen die worden gebruikt in op replicon gebaseerde en virale enzymgebaseerde testen om te screenen op remmers van Zika-virusreplicatie in een screeningsformaat met hoge doorvoer.

Antivirale testen met hoge doorvoer om te screenen op remmers van Zika-virusreplicatie

Deze studie gebruikte in-silico-strategieën om Enumerated Etravirine te identificeren als een veelbelovend therapeutisch middel voor HIV. Onze bevindingen over moleculaire interacties en dynamiek ondersteunen het rationele ontwerp van nieuwe NNRTI's als mogelijke alternatieven voor de behandeling van hiv.

Kwantitatieve structuur-activiteitsrelatie, activiteitsvoorspelling en moleculaire dynamiek van niet-nucleotide reverse transcriptaseremmers

Leer een snelle screeningsmethode voor HIV-1-remmers met luciferase-assays. Deze techniek evalueert celcytotoxiciteit en antivirale werking tegen resistente stammen voor nieuwe antiretrovirale therapieën.

Snelle screening van HIV reverse transcriptase en integrase-remmers

Meer video's verkennen