比色検出の紙ベースエシェリヒア·コリサルモネラ属、およびリステリア菌農業大量の水から

この手順の全体的な目標は、大量の農業用水から食品媒介病原体を検出することです。これを行うために、以下MMSと呼ぶ修正されたモアスワブは、折りたたまれたガーゼまたはチーズクロスをMMSカセット内に置くことによって組み立てられます。次に、サンプリング会場では、蠕動ポンプを用いて大量の水をMMSに通すことで、目的の細菌を濃縮します。

その後、MMSの端はしっかりとキャップされ、ラボに戻されます。選択的または非選択的濃縮ブロスをMMSに添加し、MMSを18〜24時間インキュベートします。次に、濃縮された培養物を回収し、大腸菌検出のためにライセートを調製します。

これらは、比色酵素検出用の基質を含浸させたマイクロパッドマイクロスポットに添加され、最大3時間インキュベートされます。その後、マイクロパッドを検査し、スキャンします。最終的に、マイクロスポットの視覚的および定量的分析により、大腸菌、サルモネラ菌種、およびLモノサイトゲンがミリリットルあたり0.1CFUという低いレベルで存在することが明らかになりました。

この技術がメンブレンろ過や固体培地での培養に比べて優れている主な利点は、水サンプルの量が多いことです。これにより、アッセイの感度が向上し、濃縮時間も短縮されます。検出までの時間も、メンブレンろ過法の24〜48時間と比較して、24時間以内に短縮されます。

さらに、マイクロパッドは、従来の固形細菌培地では不可能な3つの異なる食品媒介病原体を同時に検出するために使用できます。この手法の意味するところは、農業用水の分析だけでなく、山火事や極端な降雨イベントなどの極端な事象の後にも広がり、どちらも作物の灌漑に使用される地表水の微生物汚染の増加につながる可能性があります。この手法のアイデアを最初に思いついたのは、2012年と2013年の夏にコロラド州で発生した山火事の後、大量の水に病原体が存在するかどうかを迅速にスクリーニングする必要があったときで、サンプリングエリアが遠隔地にあるため、分析のために大量の水を集めて研究室に戻すことが困難だったため、現場での使用に適応できる必要がありました。

このプロトコルは、40 x 12センチメートルの4層チーズクロスの長方形のセクションを、修正されたより多くの綿棒またはMMSカットを準備することから始めます。チーズクロスを両方のAEに沿って折り、20 x 6センチメートルの長方形にします。次に、チーズクロスをその長い軸に沿ってしっかりと転がして、高さ約6センチメートル、直径3センチメートルの円筒形の綿棒を形成します。

綿棒をアルミホイルのパケットに挿入し、15分間オートクレーブします。オートクレーブ後のドライサイクルを使用して15 PSIで、デバイスをフィールドに持ち込む準備が整います。所定の位置に着いたら、ビニールチューブをMMSの両側のスピゴットに取り付けて、チューブがスピゴットに完全に接着するようにします。

次に、チューブを蠕動ポンプに固定します。チューブ上流のチューブが、バクテリアを濃縮するためのサンプリングに十分な長さであることを確認してください。蠕動ポンプの入口を、サンプリングする農業用水に配置します。

毎分300ミリリットルの流量で蠕動ポンプを運転し、サンプリングが完了した後、少なくとも10リットルをサンプリングします。水サンプルから蠕動ポンプ入口を引き出し、排水が観察されなくなるまでポンプを運転し続けます。集中が完了したらMMSを終了します。

すべての変更されたより多くの綿棒について、慎重にMMSスピゴットからビニールチューブを取り外し、MMSの両側のスピゴットをキャップし、しっかりとキャップされたMMSを冷蔵温度で最大12時間保存してから、濃縮を追加します。ここでは、大腸菌、サルモネラ菌種、およびlモノサイトゲネスの濃縮が実証されます。各選択的濃縮に1つのMMSが使用されます。

MMSの蓋を緩め、大腸菌を濃縮します。20ミリリットルの滅菌緩衝ペプチド水または塩酸バンコマイシン1リットルあたり8ミリグラムを補充したBPWを追加します。.MMSの蓋をしっかりとねじ込みます。

サルモネラ菌種を濃縮するために、1リットルあたり4ミリリットルを補充した20ミリリットルの滅菌BPWを追加します。Lモノサイトゲネスの濃縮のためのサルモネラ菌サプリメントは、無菌のアップリストエリアブロスを20ミリリットル追加します。インキュベーションが完了したら、MMSを150 RPMの振とうインキュベーターで18〜24時間インキュベー

インキュベーターからMMSを取り外します。蓋を緩めます。メディアをファルコンチューブに静かに注ぎ、ピペットを使用して0.5ミリリットルを1.5ミリリットルのマイクロ遠心チューブに静かに移します。

大腸菌の選択的濃縮の比色分析、または非選択的濃縮の分析のために、0.5ミリリットルの濃縮を5ワット22キロヘルツで20秒間超音波処理します。プローブレーターを使用して、基材C-P-R-G-X接着剤、マゼンタキャップリレート、およびXINPのストック溶液をpH調整ヒービーズバッファーに調製します。光5プロモ6からストックソリューションを保護します。

対立遺伝子、キャピテ、またはマゼンタキャピテのクロロ3は光感受性があり、自動分解によって偽陽性の結果をもたらす可能性があります。テストするサンプルとターゲットごとに、滅菌シャーレ内に1つのマイクロパッドを置きます。大腸菌の検出には、CPRGおよびxglマイクロパッドを準備します。

サルモネラ菌種の検出にはマゼンタのキャピテマイクロパッドを、モノサイトゲネスの検出にはXINPマイクロパッドを調製します。ピペッターを使用して、各基質ストック溶液の24マイクロリットルをマイクロパッドマイクロスポットに埋め込みます。検出の準備として、濃縮されたサンプルを6マイクロリットルを適切な各マイクロパッドに加えます。

カバーをペトリ皿に戻し、パラフィルムで密封します。マイクロパッドで37°Cのマイクロパッドで最大3時間インキュベートし、マイクロスポットの発色と乾燥を可能にします。インキュベーション後、マイクロパッドの色の変化を簡易目視で確認して検出を行います。

決定的な色の変化をもたらす強い反応は、通常、濃縮の18〜24時間後に予想されることに注意してください。これらは肯定的であると考えられており、これ以上の説明は必要ありません。大腸菌が存在する場合、CPRGが埋め込まれたマイクロスポットは黄色から赤色に変わります。

バイオレットとマイクロスポット。xlu で埋め込むと、ここに示すように無色から青緑色に変わります。l monocytogenesが存在する場合、XINPに埋め込まれた微小な斑点は無色から藍色に変化します。

サルモネラ菌種が存在する場合、マゼンタのキャピテに埋め込まれたマイクロスポットは無色から紫に変化します M.In、反応が毎週陽性の場合は、ソフトウェアの結果を半定量的に分析することを容易にします。これを行うには、マイクロパッドを完全に乾かします。フラットベッドスキャナーを使用してマイクロパッドをスキャンします。

image Jソフトウェアを使用して画像を処理します。次に、画像Jで、スキャンした画像を開いて解析します。次に、画像を反転するには、メインメニューの編集タブをクリックして、[反転]を選択します。

メインメニューの「分析」タブを使用し、「測定の設定」を選択して、分析するレポートされた測定値を選択します。[平均グレー強度制限のしきい値]ボックスと[表示ラベル]ボックスがオンになっていることを確認し、[OK]を押します。これにより、ソフトウェアが選択した各領域をどのように分析し、どのように報告するかが設定されます。

次に、楕円形ツールを使用して、分析タブで分析する領域の輪郭を描き、測定を選択します。ソフトウェアは、定義された領域内の平均グレー強度を測定し、それをポップアップ画面に報告し、コピーしてExcelに貼り付けてさらに分析することができます。マイクロパッドアッセイは、コレメトリック基質と反応する細菌指標酵素の検出に基づいています。

大腸菌を検出するアッセイは、青緑色の製品と赤色の紫色の製品を生成します。サルモネラ菌種とLモノサイトゲネスを検出するアッセイは、それぞれ紫色のmovとインディゴ色を生成します。また、デジタル化された画像をImage Jソフトウェアを使用して操作することで、より客観的で標準化されたデータ解釈が可能になります。

ここでは、陰性検査と陽性検査の両方を含む各アッセイのデジタル化されたカラー画像とメトリック画像が示されています。陰性試験は、標的酵素をコードしない細菌種を用いて行い、陰性試験は標的細菌を用いて行いました。最初の行は、2行目に変更されていないスキャン画像を示しています。

スキャンした画像は、Image Jソフトウェアを使用してグレースケールに変換されています。そして3行目では、色が反転しています。その後の灰色の強度の解釈用。

4行目は、マイクロパッドの各マイクロスポット内の画像Jを使用して測定された平均グレー強度を示しています。マイクロスポットの例は、黄色の矢印と円で示されています。このグラフは、画像J.Eachの色について、Iメトリックマイクロパッドの陽性と陰性のテストによって決定された4つの反復からの平均灰色強度を示しています。

これらのデータは、この手順により、大量の農業用水から濃縮された3つの標的微生物の曖昧な検出が可能であることを示しています。このビデオを見た後、改造されたムーアスワブを組み立てる方法をよく理解しているはずです。大量の農業用水から目的の微生物を濃縮し、紙ベースの分析装置でカラーメトリック酵素検出と分析を行います。

この手順を試行している間、大腸菌の検出のための超音波処理ステップを含めることを覚えておくことが重要です。また、マゼンタのキャピト基質をできるだけ光から保護することを忘れないことも重要です。インキュベーション前のMMSの適切な天井と組み立ては、追加の開発で手順を完了するために重要です。

この技術は、食品安全アプリケーションを超えて、微生物病原体および指標微生物のポイントオブニーズ診断へのシンプルで安価かつ迅速なアプローチとして非常に役立つことが約束されています。この技術は、環境および臨床微生物学における潜在的な使用を見つける可能性を見つけることができます。病原性微生物を扱うことは非常に危険である可能性があるため、細菌の濃縮物をこぼしたり、バイオエアロゾルの形成を避けたりすることが重要であることを忘れないでください。

この手順を実行するときは、病原性微生物の取り扱いに関する標準的な予防措置を常に遵守する必要があります。