호중구 윤회에서 생리 흐름 중 내피 세포 - 세포 접합의 실시간 영상

이 절차의 전반적인 목표는 생리학적 흐름 조건에서 백혈구 트랜스 내피 이동 중 내인성 연접, terin 및 pcam one의 분포를 추적하는 것입니다. 이는 먼저 프로코 구배(proco gradient)를 사용하여 건강한 지원자의 전혈에서 다형성 핵 백혈구 또는 PMN을 분리함으로써 달성됩니다. 두 번째 단계는 유동 실험을 시작하기 30분 전에 유동 슬라이드에서 배양된 A TNF 알파 자극 인간 제대 정맥 내피 세포 단층에 형광 표지된 항체를 추가하는 것입니다.

이를 통해 생리학적 흐름 조건에서 호중구 전이(neutrophil transmigration) 동안 내피 세포의 접합 역학(junectal dynamics)을 시각화할 수 있습니다. 다음으로, 형광 표지된 TNF 알파 자극 인간 제대 정맥 내피 세포를 포함하는 플로우 슬라이드를 플로우 시스템에 연결하고 현미경 스테이지에 놓습니다. 펌프는 흐름 챔버를 통해 저장소에서 주사기로 흐름 버퍼를 당깁니다.

마지막 단계는 주입 포트를 통해 PMN을 유량 시스템에 천천히 주입하는 것입니다. 궁극적으로 PMN은 컨포칼 레이저 스캐닝 현미경을 사용하여 시각화됩니다. 몇 분 후 백혈구가 나타나 부착하고 전이합니다.

실험은 원하는 순간에 중단할 수 있습니다. 정적 전이 분석과 같은 다른 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 이 기술을 사용하면 생리학적 흐름 조건에서 실생활에서 접착 및 전이동을 연구할 수 있다는 것입니다. 이것은 백혈구가 다른 뿌리보다 한 뿌리를 선택하는 이유, 즉 PGA 대 세포 간 이동을 이해하는 데 도움이 될 것입니다.

우리는 형광 표지된 항체가 있는 세포 세포 접합을 시각화하여 이를 수행합니다. 이 실험을 위한 인간 제대 정맥 내피 세포 또는 HU X는 내피 성장이 보충된 배지를 사용하여 피브로넥틴 코팅 접시에 대한 제조업체의 지침에 따라 배양됩니다. 보통. 세포 배양은 세포가 80에서 90%에 도달하면 4-8개의 계대 사이에서 사용되며, Confluence는 pH 7.4에서 실온 PBS로 조심스럽게 세척한 다음 트립신과 원심분리 후 세포입니다.

우리는 800, 미디어를 사용하여 밀리리터 당 000 세포를 중단합니다. 이 실험은 전날 플레이트에 피브로넥틴으로 코팅된 플로우 챔버를 사용합니다. 80, fibronectin의 각 수로에 있는 000의 세포는 교류 약실을 암호화하고 37 섭씨 온도 그리고 5%carbon 다음날에 5%carbon에 인큐베이터에서 밤새 배양 왔다갔다 세포 현탁액을 온화하게 피펫으로 삐

슬라이드를 45도 각도로 부드럽게 기울여 플로우 챔버 슬라이드의 미디어를 새로 고칩니다. 채널 자체가 아닌 저장소의 미디어만 제거하는 것이 좋습니다. 채널에서 배지를 제거하면 파이펫팅으로 인한 배지의 드래그 힘으로 인해 내피 세포 손실 및 사멸이 발생할 수 있습니다.

위상차 현미경으로 확인 내피 세포가 단층을 형성했는지 여부. 세포가 100% cofluent가 아닌 경우 100% confluence에 도달할 때까지 하루에 두 번 미디어를 교체합니다. 세포가 100% 유창성에 도달하면 염증 매개체를 포함하는 배지로 세포를 자극합니다.

TNF 알파는 TNF 알파와 함께 하룻밤 사이에 uix를 자극하여 ICAM one 및 VA M1과 같은 세포 접착 분자의 내피 IE 상향 조절의 염증성 표현형을 초래합니다. 다형성핵 백혈구 또는 PMN을 분리하기 전에.분리된 PMN을 세척하고 이전에 준비된 원액 100ml에 대한 유동 분석에 사용하기 위한 유동 완충액을 준비합니다. 100 마이크로 리터의 신선한 1 몰 염화칼슘, 2.5 리터 당 200 그램의 원료 농도에서 인간 알부민 및 0.1 그램의 포도당.

0.45미크론 필터를 사용하여 흐름 버퍼를 필터링합니다. pH 7.4의 PBS에 있는 10%Trisodium citrate 또는 TNC 용액도 PMN을 분리하기 전에 준비됩니다. PMN은 건강한 지원자의 나트륨 헤파린 ette에 수집된 20ml의 전혈에서 분리됩니다.

먼저 15 밀리리터 튜브에 10 % PBST NNC로 전혈을 일대일로 희석합니다. 다음으로, 가장 느린 설정에서 피펫 보이를 사용하여 새로운 50 밀리리터 튜브에서 밀리리터당 1.130 그램의 밀도로 물에 있는 12.5 밀리리터의 콜로이드 용액에 희석된 혈액 20 밀리리터를 조심스럽게 조심스럽게 피펫팅합니다. 콜당 함유 튜브는 혈액을 추가하는 동안 45도 각도로 기울어져야 합니다.

튜브를 원심분리기에 조심스럽게 놓고 실온에서 20분 동안 낮은 가속으로 800Gs로 회전하고 원심분리가 완료되면 브레이크를 비활성화합니다. 모든 액체를 제거하고 각 튜브에 얼음처럼 차가운 적혈구 용해 완충액을 채워 적혈구를 잿물로 만듭니다. 튜브를 얼음 위에 두고, 브레이크를 작동시킨 상태에서 서스펜션이 섭씨 4도에서 5분 동안 500GS에서 짙은 빨간색 원심분리기로 바뀔 때까지 때때로 튜브를 뒤집습니다.

생성된 펠릿 분획에는 적혈구와 함께 PMN이 포함되어 상층액을 제거하고 펠릿을 얼음에서 두 번 세척합니다. 500Gs에서 섭씨 4도에서 5분 동안 저온 용해 완충액. 두 번째 세척에서 상등액을 제거한 후, 실온에서 플로우 버퍼로 펠릿을 다시 현탁시키고 자동화된 셀 카운터를 사용하여 PMN 농도를 측정합니다.

마지막으로, 유량 완충액의 PMN을 10배에서 밀리리터당 6개의 셀로 현탁하고 실온에서 유지하여 내피 접합 VA cadherin 및 pcam 1을 표시합니다. pcam LOR 6 47 항체를 1 대 100 희석하고 칼슘 독립 FE cadherin ZI 항체를 1 대 50 희석으로 VE 배양액에 첨가한 후 유동 챔버에서 37°C에서 30분 동안 배양합니다. 분석을 위해 PMN을 준비하려면 유량 시스템에 주입하기 전에 섭씨 37도에서 15분 동안 수조에 넣습니다.

튜브를 빈 흐름 챔버에 연결하고 따뜻한 흐름 버퍼로 채워 기포 형성을 방지합니다. 흐름 시스템을 설정할 때. 실리콘 튜브를 사용하여 빈 플로우 챔버의 한쪽 면을 20ml 주사기가 들어 있는 시린지 펌프 플로우 시스템에 연결합니다.

플로우 챔버를 현미경 스테이지에 놓습니다. 분석은 63 x 오일 대물렌즈와 섭씨 37도 및 5% 이산화탄소로 설정된 기후 챔버가 장착된 컨포칼 레이저 스캐닝 현미경을 사용하여 수행됩니다. 빈 플로우 챔버의 다른 쪽을 섭씨 37도의 유량 버퍼로 채워진 저장 플라스크에 연결하고 주사기 펌프를 시작하여 모든 튜브에 플로우 버퍼를 흐름 버퍼로 채우면 펌프는 플로우 챔버를 통해 저장소에서 주사기로 흐름 버퍼를 당깁니다.

이 튜브에는 인라인 루어 주입 포트도 포함되어 있어 흐름을 중단하거나 기포를 생성하지 않고 실행 중인 실험에 바늘로 PMN을 주입할 수 있습니다. 다음으로, 빈 플로우 챔버를 TNF 알파 처리된 VE가 포함된 플로우 챔버로 교체하고, 튜브를 분리했다가 다시 연결하기 전에 튜브를 집어 VE.To 시스템의 기포를 방지하려면 튜브를 꼬집고 고정하는 것이 중요합니다. 셀이 포함된 슬라이드를 연결하는 경우.

플로우 챔버를 현미경 스테이지에 놓고 모세관 후 es의 생리적 유속에 따라 유속을 1 센트 제곱으로 조정하며, 이는 센티미터 제곱당 1-5 딘 기록 차동 간섭 대비 또는 DIC fite LOR 6 47입니다. 동시에 1ml 주사기를 사용하여 인라인 루어 주입 포트를 통해 PMN을 흐름 시스템에 천천히 주입합니다. 몇 분 후, 백혈구가 나타나고, 부착하고, 전이되어 원하는 순간에 실험을 중단합니다.

유동 챔버에서 튜브를 분리하고 유동 챔버에 고정제를 피펫팅하여 내피 단층의 저항을 측정하여 항체가 내피의 장벽 기능을 방해하는지 여부를 테스트했습니다. VE가 항체 클론 55 7 H one을 들을 수 있거나 isotype control이 세포에 추가되었을 때 내성의 변화는 관찰되지 않았습니다. 대조적으로, VE 대구는 차단 항체 CL 75를 듣게 되어 내성이 크게 감소했습니다.

RAP 분석에서는 VE CADHERIN 55 7 H 단일 항체의 유무에 따라 형광 회복에 변화가 없음을 확인했으며, 이는 항체가 호중구 트랜스 내피 이동 또는 TEM 동안 VE cadherin, VE cadherin 및 pcam one 분포의 역학을 실시간으로 변경하지 않았음을 나타냅니다. 상단 패널은 흰색으로 윤곽선이 그려진 호중구가 내피에 부착되어 VE coherent 및 pcam one의 분포에 해를 끼치지 않고 세포를 가로질러 세포 접합부로 이동하는 것을 보여줍니다. 투아페데시스(diapedesis) 동안, VE coherent와 P chem one의 국소 분산은 호중구가 세포를 통해 돌출되어 흰색으로 표시된 세포 접합부로 돌출될 때 관찰할 수 있으며, 이는 내피 상부에 있는 호중구입니다.

노란색 윤곽선은 이미 내피 아래에 있는 호중구막을 나타냅니다. 기저귀 치료가 완료된 후, 접합부가 닫히고 일관성이 있으며 pcam one은 기저귀 치료 부위로 재배치됩니다. 트랜스 마이그레이션된 호중구의 경계는 노란색으로 윤곽선이 그려져 있습니다.

이 절차에 따라 백혈구가 bagga 또는 transcellular root를 사용하여 내피를 교차하는지 여부와 같은 추가 질문에 답하기 위해 백혈구 trans endothelial migration을 수행할 수 있습니다.