Isolation und Kultur der Dissoziierte sensorischen Neuronen aus Hühnerembryonen

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, eine angereicherte Population dissoziierter primärer sensorischer Neuronen aus Hühnerembryonen zu kultivieren. Dies wird erreicht, indem intakte dorsale Wurzelganglien vom embryonalen Tag an, sieben bis 10 Hühnerembryonen in eine konische Röhre gesammelt und anschließend in ihre dissoziierte Zellsuspension zerlegt werden. In einem zweiten Schritt werden dissoziierte DRG-Zellen zur Inkubation auf einer Kulturschale plattiert.

Danach wird die Kulturschale sanft gespült, um die Neuronen bevorzugt zu entfernen. Der letzte Schritt umfasst das Plattieren der dissoziierten sensorischen Neuronen auf den gut definierten Substraten, wie z. B. säuregewaschene und gebackene Deckgläser, die mit hohen oder niedrigen Lamininkonzentrationen vorcodiert sind. Eine Immun-Zytochemie wird verwendet, um das Vorhandensein von NCA und aktivierten Beta-One-Integrinen in den Zellkörpern, Neuriten und Wachstumskegeln der dissoziierten kultivierten embryonalen sensorischen Hühnerneuronen nachzuweisen.

Diese Methode ist ein leistungsfähiges Werkzeug, um zahlreiche Aspekte der Neurobiologie aufzuklären, einschließlich der Mechanismen der Axonführung, der Wachstumskegel, der Dynamik des Zytoskeletts sowie der Zusammensetzung und Regulation der Zelloberfläche. Diese Technik ermöglicht es den Forschern, schnell die Kulturen zu erhalten, die stark mit dissoziierten sensorischen Neuronen angereichert sind, die nur sehr wenige Gliazellen enthalten. Dies unterscheidet sich von den intakten dorsalen Gangling-Kulturen, die sowohl Neuronen als auch nicht-neuronale Zellen enthalten.

Darüber hinaus sollten geringfügige Variationen dieses Protokolls eine hohe Ausbeute an neuronalen Kulturen aus anderen Quellen als den Spinalganglien, einschließlich des embryonalen Vorderhirns, ermöglichen. In einer Laminar-Flow-Haube knacken Sie ein inszeniertes fruchtbares weißes Leghorn-Küken-Ei und geben Sie seinen Inhalt in eine 100-Millimeter-Petrischale. Übertragen Sie den Embryo anschließend in eine weitere 100-Millimeter-Petrischale.

Geben Sie erwärmtes XPBS in die Petrischale, um das Gewebe feucht zu halten. Der Embryo wird geköpft und der Körper in eine andere saubere Petrischale gebracht. Erwärmtes F 12 HS 10 wird dem Gewebe zugegeben.

Platzieren Sie die Petrischale mit embryonalem Gewebe unter dem Präpariermikroskop in einer Laminar-Flow-Haube. Machen Sie danach einen vertikalen Mittellinienschnitt vom Schwanz bis zum Hals, indem Sie die sich entwickelnde Dermis einklemmen, um Herz, Lunge und andere Organe freizulegen. Fassen Sie mit der feinen Pinzette sanft den Hals und die Aorta oder ein anderes Gewebe unmittelbar oberhalb des Herzens und ziehen Sie es in Richtung Schwanz, um das Tier auszuweiden.

Tragen Sie anschließend warmes F 12 HS 10 auf das Tuch auf, um das Präparat weiter zu reinigen und das Tuch feucht zu halten, und wiederholen Sie die Anwendungen von F 12 HS 10 während der gesamten Dissektion nach Bedarf. Entfernen Sie dann alle verbleibenden Herz-Kreislauf-, Atemwegs- oder Verdauungsorgane, um die sich entwickelnden Rippenwirbelsäule freizulegen, und DRGs, um die DRGs entlang beider Seiten der Lendenwirbelsäule zu sammeln, unterhalb der Rippen, und ziehen Sie die DRGs aus dem Embryo. Dies geschieht durch Einklemmen und Durchtrennen der Wurzeln, die vom Dr.G in Richtung Rückenmark reichen, und durch Greifen des sich entwickelnden Nervs vom DRG zur Peripherie oder umgekehrt.

Anschließend legen Sie die intakten DRGs in eine 35 Millimeter große Kulturschale, die mit warmem F 12 HS 10 gefüllt ist. Entfernen Sie überschüssiges Gewebe wie die dorsalen oder ventralen Wurzeln, das an DRGs haften könnte. Um DRGs oberhalb der Lendenwirbelsäule zu erhalten, entfernen Sie die ventrale Hälfte der Brust- und Halswirbelsäule

Dies geschieht durch einen Schnitt in der sich entwickelnden Wirbelsäule senkrecht zur Rückenmarksachse im oberen Lendenwirbelbereich und einen weiteren Schnitt im oberen Halsbereich. Machen Sie dann Schnitte entlang der rechten und linken Seite der Wirbelsäule. Zusammen lösen diese Schnitte die ventrale Hälfte der Wirbelsäule vom Embryo ab, und die Säule wird dann aus dem Embryo entfernt, um einen einfachen Zugang zu den DRGs zu ermöglichen.

Entfernen Sie das thorakale und zervikale Rückenmark, indem Sie das Rückenmark mit einer feinen Zange greifen. Entnehmen Sie anschließend die intakten Thorax- und Gebärmutterhals-DRGs wie zuvor und legen Sie sie mit anderen DRGs in das warme F 12 HS 10. Entfernen Sie überschüssiges Gewebe, das an den DRGs haften könnte.

Spülen Sie dann das Innere einer neuen Glaspasterpipette mit F 12 HS 10 aus, um zu verhindern, dass DRGs an der Wand der Pipette haften bleiben. Mit der gespülten Pipette werden alle DRGs und F 12 HS 10 aus der kleinen Petrischale in ein steriles konisches 15-Milliliter-Röhrchen übertragen, es können weitere Embryonen präpariert werden, um die Anzahl der DRGs bei diesem Verfahren zu erhöhen. Legen Sie das konische Röhrchen mit intakten DRGs in die Zentrifuge und drehen Sie es zwei bis drei Minuten lang vorsichtig mit dem 200-fachen G.

Vergewissern Sie sich, dass die DRGs auf den Boden des Rohrs gesunken sind. Anschließend F 12 HS 10 vorsichtig entfernen, dabei das DRG-Granulat ungestört lassen. Als nächstes fügst du zwei Milliliter eines X-C-M-F-P-B-S hinzu, um das Pellet der DRGs zu entfernen.

Schleudern Sie erneut und entfernen Sie das C-M-F-P-B-S, während Sie die DRGs beibehalten. Wiederholen Sie diesen Waschschritt für insgesamt drei Wäschen. Nachdem die Waschgänge abgeschlossen sind und C-M-F-P-B-S entfernt wurde, geben Sie zwei Milliliter erwärmtes Trypsin in das 15-Milliliter-Röhrchen und entfernen Sie vorsichtig die DRGs.

Legen Sie das Röhrchen dann für 10 bis 15 Minuten in ein 37 Grad Celsius heißes Wasserbad, um die DRGs in dissoziierte Zellen zu verdauen. Die DRGs vorsichtig in Trypsinlösung einfärben und visuell auf das Fehlen intakter DRGs prüfen. Die Behandlung fortsetzen, bis die intakten DRGs nicht mehr mit dem Auge zu sehen sind, und/oder längere Inkubationszeiten im 37 Grad Celsius warmen Wasserbad einplanen, bis die intakten DRGs dissoziiert sind.

Anschließend zentrifugieren Sie die dissoziierten DRGs und das Trypsin bei 200 mal G für drei bis fünf Minuten, um ein Pellet zu bilden. Bei Bedarf länger schleudern, bis das Pellet gebildet ist. Saugen Sie dann das Trypsin vorsichtig an, ohne das Pellet zu stören.

Geben Sie zwei Milliliter F 12 hs 10 zum Pellet und trichen Sie die DRGs vorsichtig. Übertragen Sie anschließend den gesamten Inhalt aus dem konischen Röhrchen in eine 100-Millimeter-Kulturschale. Spülen Sie das Röhrchen mit acht Millilitern F 12 HS 10 und geben Sie es jeweils zwei Milliliter in die Kulturschale, so dass insgesamt 10 Milliliter

Stellen Sie danach die Kulturschale für drei Stunden in einen befeuchteten 37 Grad Celsius Inkubator. Fügen Sie nun 400 Mikroliter vorbereitetes Laminin hinzu, einen auf jeden säuregewaschenen und gebackenen Glasdeckglas, und verteilen Sie ihn mit einer Pipettenspitze, um eine vollständige Abdeckung zu gewährleisten. Die Oberflächenspannung sorgt dafür, dass Laminin One auf dem Deckglas verbleibt und sich nicht auf dem Boden der Kulturschale ausbreitet.

Einen Deckel über die Schüssel legen und Lamin one zwei bis drei Stunden bei Raumtemperatur inkubieren lassen. Spülen Sie anschließend die lamininbeschichteten Deckgläser dreimal mit sterilem PBS in einer Laminar-Flow-Haube ab. Lassen Sie das PBS nach dem letzten Spülen auf den Deckgläsern.

Verlieren Sie während der Spülschritte nicht an Oberflächenspannung. Spülen Sie nach der Inkubation mit einer sterilen 10-Milliliter-Pipette den Boden der Schale mit dissoziierten DRG-Zellen vorsichtig ab. Halten Sie die Schüssel in einem 45-Grad-Winkel.

Etwa sieben Milliliter F 12 HS 10 entnehmen. Stoße es dann vorsichtig auf ein Drittel der Schale aus, um die Neuronen zu entfernen. Wiederholen Sie dies noch fünfmal.

Drehen Sie dann die Schüssel um ca. 120 Grad und wiederholen Sie den Spülvorgang für weitere sechs Spülgänge. Wiederholen Sie dann den Vorgang für das verbleibende Drittel des Gerichts. Nun mit der gleichen Pipette F 12 HS 10 mit Neuronen aus der Schale in ein konisches Röhrchen übertragen.

Zentrifugieren Sie es fünf bis 10 Minuten lang bei 200 g zum Pelletieren. Anschließend entfernen die Zellen F 12 HS 10, so dass das Pellet ungestört bleibt. Dann resuspendieren Sie das Pellet mit zwei Millilitern erwärmtem F 12 H plus Zusätzen.

Bestimmen Sie anschließend die Zelldichte mit einem Hämozytometer und verdünnen Sie die Zellen nach Bedarf mit F 12 H plus Nahrungsergänzungsmitteln, um die gewünschte Plattierungskonzentration zu erhalten. Entfernen Sie dann sofort PBS von den mit Laminin beschichteten Abdeckungsschlüpfen. Platzieren Sie 400 Mikroliter Zellen darauf.

Schieben Sie die Schale vorsichtig in einen 37 Grad Celsius heißen Zellkultur-Inkubator und lassen Sie sie zwei bis drei Stunden unter sterilen Bedingungen inkubieren. Fluten Sie die 35-Millimeter-Schalen mit Neuronen vorsichtig mit 1,6 Millilitern F 12 H plus Nahrungsergänzungsmitteln. Anschließend stellen Sie die Zellen wieder in den Inkubator und inkubieren sie über Nacht.

Diese Abbildung zeigt kultivierte dissoziierte primäre sensorische Neuronen, die immunmarkiert für NCA und aktivierte Beta-1-Integrine sind. Die embryonalen Hühnerneuronen wachsen robust auf hohen Konzentrationen von Laminin-eins-Neuronenzellkörpern. Neurite und Wachstumskegel sind immunpositiv für NCA und aktiviertes Beta-1-Integrin.

Das zusammengeführte Bild der beiden Färbungen zeigt, dass die meisten Zellen sowohl für N cam als auch für aktiviertes Beta-Eins-Integrin positiv sind. Wie für embryonale sensorische Neuronen von Küken zu erwarten, sind weniger als 5% der Zellen, die mit dieser Technik entnommen werden, nicht-neuronal. In diesem Bild ist eine Zelle mit einer glialartigen Morphologie zu sehen, die NCA M-negativ und Beta-Eins-Integrin-positiv ist.

Konsistent mit einer nicht-neuronalen Zelle. Eine höhere Vergrößerung eines kultivierten sensorischen Neurons zeigt deutlich die Neuriten, die sich vom Zellkörper aus erstrecken, und dieser Einsatz zeigt eine stärkere Vergrößerung des Wachstumskegels an der Spitze eines Neuriten. Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, intakte dorsale Wurzelganglien sorgfältig und vollständig zu dissoziieren und die Neuronen und die entsprechende Dichte auf dem definierten Substrat zu plattieren, wie z. B. säuregewaschene und gebackene bedeckte Träger, die mit bekannten Konzentrationen von Laminat kodiert sind. Nach dem Kulturverfahren.

Live-Bildgebungsverfahren wie Zeitraffermikroskopie können durchgeführt werden, um das Wachstumskoon, den Motilitätsstamm, die POAL-Dynamik und andere Wachstumskegelverhaltensweisen auf definierten Substraten und als Reaktion auf Moleküle, die auf die Kulturmedien aufgebracht werden, zu bewerten. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein solides Verständnis dafür haben, wie man eine robust wachsende Kultur produziert, die für primär dissoziierte Neuronen aus embryonalen Spinalganglien von Küken stark angereichert ist.