Name: A Novel In vitro Modelo para estudar as interações entre a Whole Humano Sangue e endotélio (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-11-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 27 s
Description: Aprenda a estudar interações entre sangue humano e células endoteliais usando um modelo in vitro inovador. Esta técnica permite avaliar coagulação e recrutamento de leucócitos em sistema humano.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Este estudo foi financiado por doações do Conselho Sueco de Pesquisa (90293501, A0290401, A0290402), Sétimo Programa-Quadro da Comunidade Europeia ao abrigo do contrato de concessão n ° 602699 (DIREKT), a Fundação NovoNordisk, a Fundação Gurli e Edward Brunnberg, Caule Therapy, Vleugel Fundação e Åke Fundação Wiberg.

NOTA: O sangue foi coletado de indivíduos saudáveis ​​por punção venosa sistema aberto em aprovação junto do Conselho de Revisão de Ética em Uppsala (Alvará nº 2008/264). 1. Semeadura Células <ol><li> Culturas primárias de células endoteliais da veia umbilical humana (HUVEC) a 37 ° C em 5% de CO 2 em frascos T75 revestidos com gelatina a 1% em PBS pH 7,4. </li><li> Remover o meio de cultura a partir de um frasco T75 contendo HUVEC (ou outro tipo de células endoteliais humanas primárias) e lavar as células com EDTA 2,1 mM em PBS, pH 7,4. Separar as células por adição de 1 ml de 0,25% de tripsina-EDTA e incubando durante 2-3 min em 37 ° C. </li><li> Recolher as células por lavagem do frasco com 9 ml de 10% de FBS em PBS pH 7,4 e transferir a suspensão de células para um tubo de 15 ml. Girar as células a 735 xg durante 5 min. </li><li> Remover o sobrenadante e ressuspender cuidadosamente o sedimento de células em meio de crescimento celular endotelial microvascular (CE GMMV) e contar as células numa câmara de Burker. Semente 21.000 cells / cm 2 em 1 poços lâminas de cultura de células e incubar a 37 ° C. As HUVEC confluentes depois vai ser 1-2 dias de cultura. Monitorar a morfologia celular e confluência diariamente sob um microscópio de luz. </li></ol> 2. Preparação de Sangue Total <ol><li> Preparar todas as superfícies artificiais que estarão em contacto com o sangue com uma dupla camada de heparina imobilizada (CHS) de acordo com as instruções do fabricante. CHS materiais revestidos protegidos do pó pode ser armazenado a temperatura ambiente até 6 meses, sem perda de função. </li><li> Use punção venosa sistema aberto para extrair o sangue de um dador saudável pouco (&lt;30 min) antes de iniciar o experimento câmara endotelial arterial. Pares de uma agulha hipodérmica (18 G x 50 mm) com a HSC tubo flexível de silicone revestido (diâmetro interno: 2 mm), antes de recolher o sangue cuidadosamente num tubo de 50 ml revestido a CHS. Suplemento de sangue com heparina não fraccionada para alcançar uma concentração final de 0,75 UI / ml. Misture delicadamente o sangue por inverting o tubo 2-3 vezes. </li></ol> 3. Sangue endotelial Câmara Modelo <ol><li> Fabricar câmaras de sangue (Figura 1A; vista superior) em polimetilmetacrilato acrílico (PMMA), que consiste de dois cilindros (oito milímetros de altura e raio 9 mm) que são coladas a uma lâmina de PMMA (25 x 75 mm). Montar as bordas dos cilindros virados para cima com borracha O-rings para vedar a câmara sanguínea contra as lâminas de vidro com as células endoteliais em cultura (Figura 1B). Rodar as câmaras sanguíneas ligados ao slide de cultura com células endoteliais em seguida numa posição vertical (Figura 1C). </li><li> Use uma ponteira CHS revestido de transferir 1,5 ml de sangue para cada CHS revestidos câmara com cuidado para não ativar o sangue. </li><li> Transferir 1 ml de sangue em tubos de microcentrífuga contendo 30 ul de EDTA 0,34 MK 3 para atingir uma concentração final de 10 mM de K 3 EDTA para determinação das concentrações plasmáticas de proteína inicial usandoum ensaio imunoenzimático (ELISA). Misturar cuidadosamente o sangue e manter os tubos em gelo. </li><li> Retirar as paredes de plástico das lâminas de vidro de cultura de células de acordo com as instruções do fabricante e lava-se cuidadosamente as células em PBS pH 7,4. Certifique-se de remover posteriormente o máximo de líquido possível dos slides. Não deixe que as células secar. </li><li> Colocar a lâmina no topo das câmaras sanguíneas, com células de frente para o sangue. Prenda o slide, colocando uma braçadeira ao redor da câmara de células endoteliais do sangue. Use uma lâmina de plástico para suporte adicional para evitar a ruptura da cultura de células de vidro deslizante ao colocar a braçadeira. </li><li> Fixar a câmara de células endoteliais do sangue em uma roda giratória (40 cm de diâmetro) coloque em um banho de água a 37 ° C. Rodar cada câmara na roda a 0,5 xg durante 30 min. </li><li> Após a incubação, desmontar a câmara da célula endotelial arterial. Lavar as lâminas de cultura de células em PBS pH 7,4 e consertar as células em gelo frio 1% de paraformaldeído (PFA) fou 10 min. Transferir 1 ml de sangue de cada câmara para tubos de microcentrífuga contendo 30 ul de EDTA 0,34 MK 3 para atingir uma concentração final de 10 mM de K 3 EDTA e misturar os tubos suavemente. Manter os tubos em gelo. </li><li> Centrifugar os tubos a 4560 xg durante 10 min em 4 ° C. Transfira o plasma sanguíneo para novos tubos de microcentrifuga e armazenamento em -70 ° C até análise posterior. </li></ol> 4. Análise de Sangue endotelial Interações <ol><li> Realize coloração de imunofluorescência com o mouse anti-CD16 humano seguido de cabra secundário anti-rato Alexa 488 e phalloidin-TexasRed. Executar cada etapa de coloração durante 1 hora à temperatura ambiente e lava-se as lâminas em PBS pH 7,4 entre cada passo. Contracoloração os núcleos com DAPI durante 10 min a temperatura ambiente. Analise componentes sanguíneos ligados às células endoteliais por microscopia de fluorescência, em combinação com análise de imagem utilizando software de análise de imagem adequado, tal como CellProfiler. </li><li> Quantify as reacções no compartimento de sangue com trombina-antitrombina (TAT) como ELISA acordo com as instruções do fabricante das amostras de plasma. </li><li> Use ferramentas estatísticas adequadas, por exemplo., Um teste t não pareado, para analisar os dados. </li></ol>

<ol><li>Mestas, J., Hughes, C. C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Of+Mice+and+Not+Men%3A+Differences+between+Mouse+and+Human+Immunology%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Of Mice and Not Men: Differences between Mouse and Human Immunology.</a> J Immunol. 172 (2), 2731-2738 (2004).</li>
<li>Seok, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+responses+in+mouse+models+poorly+mimic+human+inflammatory+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Genomic responses in mouse models poorly mimic human inflammatory diseases.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (9), 3507-3512 (2013).</li>
<li>Hong, J., Ekdahl, K. N., Reynolds, H., Larsson, R., Nilsson, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+in+vitro+model+to+study+interaction+between+whole+blood+and+biomaterials.+Studies+of+platelet+and+coagulation+activation+acid+the+effect+of+aspirin%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">A new in vitro model to study interaction between whole blood and biomaterials. Studies of platelet and coagulation activation acid the effect of aspirin.</a> Biomaterials. 20 (7), 603-611 (1999).</li>
<li>Doctor, A., Spinella, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+Processing+and+Storage+on+Red+Blood+Cell+Function+In%5BTitle%5D)+AND+%22Vivo.+Semin+Perinatol%22%5BJournal%5D)">Effect of Processing and Storage on Red Blood Cell Function In.</a> Vivo. Semin Perinatol. 36 (4), 248-259 (2012).</li>
<li>Andersson, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimal+heparin+surface+concentration+and+antithrombin+binding+capacity+as+evaluated+with+human+non-anticoagulated+blood+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomed+Mater+Res+A%22%5BJournal%5D)">Optimal heparin surface concentration and antithrombin binding capacity as evaluated with human non-anticoagulated blood in vitro.</a> J Biomed Mater Res A. 67 (2), 458-466 (2003).</li>
<li>Ekdahl, K. N., Hong, J., Hamad, O. A., Larsson, R., Nilsson, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+the+blood+compatibility+of+materials%2C+cells%2C+and+tissues%3A+basic+concepts%2C+test+models%2C+and+practical+guidelines%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Exp+Med+Biol%22%5BJournal%5D)">Evaluation of the blood compatibility of materials, cells, and tissues: basic concepts, test models, and practical guidelines.</a> Adv Exp Med Biol. 735, 257-270 (2013).</li>
<li>Aird, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+and+temporal+dynamics+of+the+endothelium%5BTitle%5D)+AND+%22J+Thromb+Haemost%22%5BJournal%5D)">Spatial and temporal dynamics of the endothelium.</a> J Thromb Haemost. 3 (7), 1392-1406 (2005).</li>
<li>Cines, D. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+cells+in+physiology+and+in+the+pathophysiology+of+vascular+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Endothelial cells in physiology and in the pathophysiology of vascular disorders.</a> Blood. 91 (10), 3527-3561 (1998).</li>
<li>Kirchhofer, D., Tschopp, T. B., Hadvary, P., Baumgartner, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+cells+stimulated+with+tumor+necrosis+factor-alpha+express+varying+amounts+of+tissue+factor+resulting+in+inhomogenous+fibrin+deposition+in+a+native+blood+flow+system.+Effects+of+thrombin+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Endothelial cells stimulated with tumor necrosis factor-alpha express varying amounts of tissue factor resulting in inhomogenous fibrin deposition in a native blood flow system. Effects of thrombin inhibitors.</a> J Clin Invest. (5), 2073-2083 (1994).</li>
<li>Esmon, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+circuits+in+thrombosis+and+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Thromb+Haemost%22%5BJournal%5D)">Molecular circuits in thrombosis and inflammation.</a> Thromb Haemost. 109 (3), 416-420 (2013).</li>
<li>Rosenberg, R. D., Aird, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascular-Bed%E2%80%93Specific+Hemostasis+and+Hypercoagulable+States%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Vascular-Bed–Specific Hemostasis and Hypercoagulable States.</a> N Engl J Med. 340 (20), 1555-1564 (1999).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

<html> Várias interacções entre a parede do vaso sanguíneo e são normalmente mantidos num estado de repouso, devido à natureza não-adesiva e anti-trombótica do endotélio. 7 Durante condições patológicas que envolvem inflamação, o endotélio é activado com um consequente aumento na expressão de receptor de adesão e 8 uma capacidade reduzida de inibir a hemostasia. 9 A activação dos sistemas de cascata no sangue por sua vez, amplia a trombogenicidade do endotélio causando ainda mais recrutamento de leucócitos e trombose. 10 Para obter uma melhor compreensão das interacções entre esta delicadas células endoteliais e sangue total, temos desenvolveram um novo método in vitro onde as células endoteliais em cultura são colocadas em contacto com o sangue total. Para o nosso conhecimento, a nossa configuração é o primeiro a mostrar as células endoteliais incubadas com sangue humano inteiro com nenhum ou muito pouco anticoagulante por períodos de tempo mais longos. nt &quot;&gt; A sensibilidade deste sistema é activado por punção venosa sistema aberto em combinação com uma camada protectora de heparina imobilizada em todas as superfícies colocadas em contacto com o sangue. A utilização de um sistema aberto durante a recolha de sangue reduz a activação dos sistemas de cascata durante a punção venosa embora permita o uso de uma quantidade de auto-determinada de anticoagulante. tubos de sangue evacuados comercialmente disponíveis podem, no entanto, ser utilizadas, dependendo dos pontos finais pretendidos do estudo. A concentração final de anticoagulante adicionados a tubos de sistema fechado mais disponíveis comercialmente podem inibir sensível e, caso contrário difícil de estudar, interacções na configuração. 6 Uma superfície protectora heparina elimina adicionalmente a activação de sangue através de contacto de superfície por quaisquer outras do que as células endoteliais superfícies. 5 De fato, a incubação de sangue completo suplementado com uma pequena quantidade de heparina não fraccionada em câmara, sem a protecção de CHS resultou na formação do coágulo. <pclasse = &quot;jove_content&quot;&gt; A bolha de ar no interior da câmara permite que a mistura do sangue durante a incubação com as células endoteliais. A fim de avaliar o efeito do tamanho da bolha de ar, foram usados ​​dois volumes de sangue diferentes. Neste modelo, medimos os níveis de TAT semelhantes independentemente do tamanho da bolha de ar nas câmaras de incubação com HUVEC. TAT foi, no entanto, aumentada com um tamanho de bolha de ar menor nos totalmente CHS tratada câmaras. Isto, em conformidade com o descrito anteriormente as propriedades das células endoteliais 11, indica um efeito regulador sobre o aumento da activação da coagulação fornecida pelas células endoteliais que estão ausentes na câmara de CHS inerte. A bolha de ar no sistema cria um fluxo mediante a rotação da câmara. O tamanho da bolha irá afectar as forças dentro deste sistema rotativo. Isto é mostrado pelos nossos resultados na Figura 2D eram uma bolha menor cria TAT valores mais elevados representam uma diminuição da força sobre o sangue ou seja, o movimento de sangueno interior da câmara é menor e, assim, a activação do sistema de cascata ocorre a uma maior extensão. Deve mencionar-se que neste sistema que estão a criar um fluxo rotativo que irá ser diferente da velocidade através da câmara, com a maior velocidade ao longo das paredes e com o menor no centro. Isso obviamente não é um ambiente ideal no que diz respeito ao fluxo e tensão de cisalhamento para as células endoteliais, mas ainda temos um sistema de produção de resultados estáveis ​​e repetíveis. Mais condições óptimas incluiria fluxo laminar que circula na ausência de turbulência. Esta é, no entanto, não é possível no modelo representado aqui e para o nosso conhecimento de um tal sistema não está disponível até à data. Embora, existem vários sistemas de microfluido comercialmente disponíveis, que não são possíveis de se combinar com o sangue total sem ou com baixos níveis de anticoagulante adicionado ao sistema, assim, deixar de permitir a avaliação sensível adequada das interacções entre todos os componentes presentes no sangue e células endoteliais. Além disso, houve um aumento de 2 vezes no recrutamento de células sanguíneas para TNFa HUVEC activadas em combinação com a formação de TAT duplicou independentemente do volume de sangue. Isto verifica a estabilidade do sistema de modelo e mostra também a possibilidade de usar um endotélio activado em combinação com sangue total. Futuro em diante, a câmara da célula endotelial sangue pode ser usado para investigar o recrutamento de células do sangue para as células endoteliais activadas por uma variedade de marcadores expressos em células em várias condições e fases de activação. Além disso, o modelo pode ser usado em combinação com agentes farmacológicos, a fim de avaliar os efeitos sobre as condições inflamatórias. Em resumo, mostramos o grande benefício da combinação de um modelo de câmara com as células do sangue e vasculares humanos para criar um ser humano completo em sistema in vitro para realizar investigações relevantes da doença vascular.

Métodos de análise de interações vascular de sangue na doença cardiovascular geralmente envolvem experimentos de pesquisa animal. Resultados criados em modelos animais experimentais de pesquisa pode, no entanto, têm pouca ou nenhuma incidência da doença humana 1,2 Como tal., Existe uma necessidade de uma boa e fiável em modelos in vitro para investigar interacções celulares entre o compartimento do sangue e as células endoteliais vasculares em um sistema semelhante à humana. Temos, portanto, estabeleceu um modelo de câmara de células endoteliais do sangue. Este baseia-se num modelo descrito anteriormente utilizados para investigar interacções entre os biomateriais e sangue humano inteiro. 3 Contrariamente a outras configurações onde in vitro geralmente limitado número de componentes purificados, isto é, trombócitos, leucócitos ou células endoteliais estão disponíveis, o presente modelo incorpora todos os componentes presentes em um vaso sanguíneo. A configuração do endotelial sangue cmodelo de câmara ell é projetado para permitir o uso de sangue humano recém-colhida com pouco ou nenhum anticoagulante adicionada. Sangue armazenado durante períodos de tempo mais longos adquirir chamada lesões de armazenamento, onde quebra de eritrócitos podem interferir com delicadas interacções entre o sangue e as células endoteliais 4. Para evitar a formação de coágulos durante o manuseio de sangue total ex vivo requer ou altas doses de anticoagulante ou que todo o material em contato com o sangue tem que ser não-activação. Como superfícies não-activação são raros no ambiente de laboratório, os materiais podem, alternativamente, ser equipado com uma camada protectora de heparina imobilizada. Uma camada protectora de heparina imobilizada (daqui em diante referida como superfície Corline heparina (CHS)) que pode ser aplicado à maioria dos materiais que criam uma superfície de contacto com o sangue, onde pode ocorrer sem causar uma activação da cascata de coagulação. 5 Assim, por fornecer as câmaras com CHS, a ce endotelial sanguell modelo de câmara permite a utilização de concentrações muito baixas de anticoagulante no sangue. Evitando a adição de elevadas concentrações de anticoagulante no modelo de câmara endotelial sangue faz com que seja possível estudar interacções sensíveis no interior de um vaso sanguíneo que de outro modo poderiam ser mascarados 6. O modelo de câmara da célula endotelial arterial consiste de duas câmaras formadas anexando cilindros de plástico (altura: 8 mm; Radio: 9 mm) para uma lâmina de microscópio de plástico. Os bordos virados para cima sobre os cilindros estão equipados com ranhuras que são equipados com anéis de vedação de borracha usados ​​para vedar as câmaras de encontro à corrediça de cultura de células. As câmaras são só parcialmente cheios com o sangue como o ar deixado na câmara mantém o sangue em circulação, quando as câmaras são posteriormente rodado na posição vertical (Figura 1). A fim de avaliar a funcionalidade do modelo, foi realizada experimentos com qualquer uma CHS completamente revestidocâmara ou Umbilical Humano Veia células endoteliais (HUVEC). Dois volumes separados de sangue foram ensaiadas e a formação de trombina antitrombina (TAT), complexos de (um marcador indirecto de coagulação) foi medida com o ensaio de imunoabsorção enzimática (ELISA). Em seguida, avaliaram o efeito de volumes de sangue e fator de necrose tumoral (TNF) estimulou as células endoteliais sobre o recrutamento de leucócitos por análise de imagem. <img alt="A Figura 1" src="/files/ftp_upload/52112/52112fig1highres.jpg"> Figura 1. Configuração do modelo de câmara de células endoteliais do sangue. (A) Vista superior de desenho esquemático da câmara de sangue feitos em PMMA. (B), as células endoteliais humanas primárias são cultivadas em lâminas de câmaras 1 poços. De sangue total humano fresco é adicionado para duas câmaras numa lâmina de microscópio. As câmaras e todos os materiais utilizados para o manuseamento de sangue são tratadas com um revestimento protector HS. Depois de retirar as paredes do cell corrediça cultura, as células são colocadas de frente para o sangue e o sistema é fechado com grampos. câmaras de célula (C) O endotelial sangue são então incubadas em condições de rotação em 37 ° C. Posteriormente, as reacções no compartimento do sangue pode ser analisada por ELISA e as células endoteliais podem ser analisadas por microscopia.

<table><tbody><tr><td>Células endoteliais da veia umbilicana humana (HUVEC)</td><td>PromoCell</td><td>C-12200</td><td>Qualquer outro tipo de célula endotelial humana primária pode ser usado.</td></tr><tr><td>Meio de Crescimento de Células Endoteliais MV (ECGM MV)PromoCell</td><td></td> <td>C-22120</td><td></td></tr><tr><td>Gelatina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G-2500</td><td>Prepare a gelatina a 1% em PBS, incube 5 ml em um T75 por 15 min e remova antes de cultivar as células.</td></tr><tr><td>Laboratório de Pesquisa de Enzimas</td> <td>TAT ELISA</td>.<td>TAT-EIA-C</td><td></td></tr><tr><td>Camundongo anti-humano CD16</td><td>DAKO</td><td>F7011</td><td>Diluição 1:100</td></tr><tr><td>Cabra anti-camundongo Alexa 488</td><td>Sondas Moleculares</td><td>A11001</td><td>Diluição 1:500</td></tr><tr><td>Phalloidin-Texas Red</td><td>Molecular Probes</td><td>A22287</td><td>Diluição 1:200</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sondas Moleculares</td><td>D1306</td><td>Diluição 10 &mu; g/ml</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>E-6758</td><td></td></tr><tr><td>0.25% Tripsina-EDTA</td><td>Gibco Life Tecnologies</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td><td>Gibco Life Technologies</td><td>10437</td><td></td></tr><tr><td>1 poço de lâminas de cultura de células</td><td>BD Falcon</td><td>354101</td><td></td></tr><tr><td>Blood Chambers</td><td>NA</td><td>NA</td><td>Blood Chamber pode ser fabricado em PMMA ou qualquer outro plástico capaz de bind CHS</td></tr><tr><td>Clamps</td><td>Office Depot</td><td>2052204</td><td></td></tr><tr><td>Corline Heparin Surface (CHS)</td><td>Corline Systems AB</td><td>945-00</td><td></td></tr><tr><td>Agulha hipodérmica</td><td>Terumo</td><td>NN-1850R</td><td>Tamanho: 18 G x 5 mm</td></tr><tr><td>Heparina não fracionada (UFH)</td><td>Leo Pharma</td><td>585679</td><td></td></tr><tr><td>K3EDTA</td><td>Alfa Aesar</td><td>1709958</td><td>Prepare uma solução de estoque 0,34 M em milliQ H2O</td></tr><tr><td>PFA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-6148</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio de fluorescência</td><td>Nikon</td><td>80i</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio óptico</td><td>Nikon</td><td>TS100</td><td></td></tr><tr><td>Software de análise de imagem</td><td>Broad Institute</td><td>CellProfiler</td><td>Disponível gratuitamente em www.cellprofiler.org</td></tr></tbody></table>

a novel in vitro modelo para estudar as interações entre a whole humano sangue e endotélio

A Novel In vitro Model for Studying the Interactions Between Human Whole Blood and Endothelium

A maioria de todas as doenças conhecidas são acompanhadas por perturbações do sistema cardiovascular. Os estudos sobre a complexidade das vias que interagem activados durante a patologias cardiovasculares são, no entanto, limitada pela falta de métodos robustos e fisiologicamente relevantes. De forma a modelar eventos patológicos vasculares temos desenvolvido um ensaio in vitro para estudar a interacção entre o endotélio e sangue total. O ensaio consiste em células endoteliais humanas primárias, que são colocados em contacto com o sangue total humano. O método utiliza sangue nativo com muito pouco ou nenhum anticoagulante, permitindo estudo das interacções entre os componentes delicados moleculares e celulares presentes em um vaso sanguíneo. Foi investigada a funcionalidade do ensaio, comparando a activação da coagulação por diferentes volumes de sangue incubadas com ou sem células endoteliais da veia umbilical humana (HUVEC). Considerando um volume de sangue maior contribuído paraum aumento na formação de trombina antitrombina (TAT) complexos, presença de HUVEC resultou na activação da coagulação reduzida. Além disso, foi aplicada a análise de imagens de fixação de leucócitos para HUVEC estimulado com fator de necrose tumoral (TNF) e encontrou a presença de células CD16 + para ser significativamente maior em TNFa estimulou as células, em comparação com células não estimuladas após o contato do sangue. Em conclusão, o ensaio pode ser aplicado para estudar as patologias vasculares, em que as interacções entre o endotélio e o compartimento do sangue são perturbados.

A necessidade do CHS Coating A fim de medir as reacções específicas em sangue total para aqueles induzido pelas células endoteliais, todos os materiais utilizados para a câmara da célula endotelial arterial deve ser fornecida com um revestimento CHS antes da utilização. A Figura 2A (à esquerda) mostra uma câmara não revestidos após 30 min de contato do sangue com um presente coágulo claramente visível. Tratar com a câmara de CHS (Figura 2A, à direita), por outro lado protege o sangue a partir da activação descontrolada, assegurando que os resultados são devido às interacções de células endoteliais-sangue. O efeito do volume de sangue na Câmara Ativação da coagulação é mais provável em sangue estagnado como a probabilidade de interação entre os fatores de coagulação ativados é aumentada. No modelo de câmara da célula endotelial de sangue, o sangue é mantido em movimento, devido à circulação de uma bolha de ar no interior da câmara. Em order para determinar o efeito das variações no volume de sangue, e portanto, também o tamanho da bolha de ar, uma câmara de CHS revestido foi ligado a uma lâmina de vidro revestida CHS que foi testada com 1,5 ml ou 1,75 ml de sangue total para 30 minutos. O volume de sangue sem qualquer movimento pela bolha de ar é 2,5 vezes maior quando 1,75 ml de sangue é adicionado à câmara quando comparado com 1,5 ml de sangue é usado (Figura 2B). Os valores medidos TAT sugeriu aumento TAT-formação com o aumento do volume de sangue (Figura 2D). Quando HUVEC (Figura 2C) foram incubadas ou com 1,5 ou 1,75 ml de sangue completo, nenhuma diferença foi observada entre os dois grupos, sugerindo que as células endoteliais podem modular a activação da coagulação (Figura 2D). O efeito do TNF no recrutamento de células do sangue e ativação da coagulação A fim de estudar o efeito do TNFa sobre o recrutamento de leucócitos, as HUVEC foram mimoed com 20 ng / ml TNF 4 horas antes do contato do sangue. O contato do sangue - quer com 1,5 ml ou 1,75 ml de sangue - foi continuada durante 30 min, após o que as lâminas de cultura foram coradas para CD16 (Figura 2F), representada por imagem e o número de células CD16 + foi quantificado. O recrutamento de células CD16 + aumentou significativamente com o tratamento com TNFa (Figura 2E) 100-256 células CD16 + / mm 2 (p &lt;0,0001), com 1,5 ml de sangue e 172-378 (P &lt;0,0001) com 1,75 ml de sangue. A formação de complexos de TAT foram medidos nas amostras de plasma correspondentes do sangue incubadas com células ou TNFa tratados ou não tratados (Figura 2G). Células de TNFa estimulada induzida uma duplicação aproximada dos complexos de TAT em comparação com células não tratadas. <img alt="A Figura 2" src="/files/ftp_upload/52112/52112fig2.jpg" width="600"> Figoure 2: Funcionalidades do modelo de câmara de células endoteliais do sangue. (A), com ou sem câmaras CHS foram incubadas com sangue inteiro. Sem CHS, um coágulo foi formado após 30 min. Medição da trombina-antitrombina (TAT) complexos, um marcador indireto de coagulação, no sangue incubadas sem CHS foi&gt; 6000 mg / ml. (B) O volume de sangue não continuou se movendo pela bolha de ar em rotação varia de acordo com diferentes volumes de sangue. Com a adição de 1,5 ml de sangue, este volume será de 0,3 ml, ao passo que irá aumentar para 0,74 ml com a adição de 1,75 ml. (C) HUVEC com imagens de microscopia de contraste de fase típica mostram a morfologia das células endoteliais de uma monocamada confluente antes de contato do sangue. (D) os valores TAT para câmaras completamente CHS revestidos mostram uma ligeira diferença quando diferentes volumes de sangue são adicionados. A adição de 1,5 ml de sangue resultou em 35 ± 11 ug / ml (n = 7) em comparação com 1,75 ml, o que resultou em 8577; 70 ug / ml de TAT (n = 8). Esta diferença já não está presente quando as HUVEC foram incubadas com os mesmos volumes do sangue; 66 ± 55 ug / ml para 1,5 ml (n = 5) e 66 ± 29 ug / ml para 1,75 ml (n = 7). (E) Quantificação do número de células CD16 + presentes em ambos não estimuladas ou estimuladas TNFa HUVEC depois contato do sangue. O número de células CD16 + é significativamente aumentada com TNFa estimulado células incubadas quer com 1,5 ml (basais: 100 ± 40 células / mm; TNFa: 256 ± 121 células / mm) ou 1,75 ml (basais: 172 ± 67 células / mm; TNF: 378 ± 185 células / mm) de sangue total (F) Imagens representativas de não estimulada e TNF estimulada HUVEC coradas para phalloidin (vermelho), CD16 (verde) e DAPI (azul).. Barra de escala = 250 um (L) A formação de complexos TAT é aproximadamente o dobro TNFa estimulada por células, em comparação com células não tratadas foram incubadas com sangue (1,5 ml:. 2.1 ± 0,1 vezes mais TAT, n = 3; 1,75 ml: 1,7 ± 1,0 vezes mais TAT, n = 4). Todos os valores são apresentados como média ± desvio padrão; os valores de p foram calculados por meio de testes t não pareado. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52112/52112fig2highres.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

Falta acessibilidade de modelos confiáveis para investigar interações sanguíneas vasculares em humanos. Apresentamos um modelo in vitro de células endoteliais humanas primárias cultivadas combinadas com sangue total humano para investigar as interações celulares tanto no sangue (ELISA) quanto no compartimento vascular (microscopia).

A Novel In vitro Modelo para estudar as interações entre a Whole Humano Sangue e endotélio

The majority of all known diseases are accompanied by disorders of the cardiovascular system. Studies into the complexity of the interacting pathways ...

O objetivo geral deste procedimento é estudar as interações entre o sangue e as células endoteliais usando um novo ensaio de câmara endotelial sanguínea. Isso é feito primeiro coletando sangue de um voluntário saudável por punção venosa em sistema aberto. Na segunda etapa, o sangue é cuidadosamente colocado em camadas em câmaras de sangue revestidas com superfície de heparina acopladas a lâminas de cultura de células endoteliais.Em seguida, essas câmaras de células endoteliais do sangue são giradas suavemente para facilitar a interação entre o sangue e as células endoteliais. Em última análise, as interações célula a célula entre as células sanguíneas e endoteliais e a produção resultante do complexo trombina antitrombina podem ser avaliadas por microscopia de imunofluorescência e Eliza, respectivamente. A principal vantagem dessa técnica sobre os métodos existentes, como aqueles que usam modelos animais, é que aqui um sistema de modelo humano pode ser usado para investigar doenças vasculares antes de iniciar o experimento.Acople uma agulha hipodérmica de calibre 18 a um pedaço de tubo de silicone revestido com superfície de heparina de dois milímetros de diâmetro. As superfícies plásticas são revestidas com heparina para evitar a ativação inespecífica da coagulação. Por exemplo, nesta imagem, um coágulo é claramente visível nesta câmara não revestida.Após 30 minutos de contato com o sangue, o tratamento da câmara com a superfície da heparina protege o sangue da ativação descontrolada, garantindo que os resultados sejam devidos às interações sanguíneas das células endoteliais. Somente depois de conectar o tubo, colete cuidadosamente uma amostra de sangue de um doador saudável por punção venosa de sistema aberto em um tubo revestido de superfície de heparina de 50 mililitros. Suplementar o sangue coletado com heparina não fracionada até atingir uma concentração final de 0,75 UIs por mililitro e inverter o tubo duas a três vezes para uma mistura suave.Para análise da concentração inicial de proteína no sangue, misture cuidadosamente um mililitro de sangue por tubo em tubos de microcentrífuga contendo 30 microlitros de K 10 milimolares três EDTA e coloque os tubos no gelo. Em seguida, use uma ponta de pipeta revestida com superfície de heparina para transferir 1,5 mililitros de sangue para cada câmara de células endoteliais de sangue revestida com superfície de heparina, tomando cuidado para deixar o sangue fluir lentamente e sem criar bolhas para evitar a ativação. Em seguida, remova as paredes plásticas das lâminas de cultura de células endoteliais de acordo com as instruções do fabricante e lave suavemente as células endoteliais.Com o PBS, movemos o máximo possível da lavagem das células sem deixar as culturas secarem e colocamos as lâminas em cima das câmaras de sangue com as células voltadas para o sangue. Em seguida, usando lâminas de plástico para suporte adicional. Para evitar a quebra das lâminas de cultura de células, coloque uma pinça ao redor de cada câmara de células endoteliais de sangue para prender as lâminas.Agora, gire as câmaras em uma roda giratória em um banho-maria de 37 graus Celsius a 0,5 Gs por 30 minutos. Após a rotação, desmonte as câmaras celulares endoteliais do sangue, lave as lâminas de cultura de células em PBS e fixe as células em 1% de paraldeído gelado por 10 minutos. Finalmente, para avaliação da concentração de proteína no sangue ativado, misture um mililitro de sangue de cada câmara em tubos de microcentrífuga contendo 30 microlitros de 0,34 molar K três EDTA e coloque os tubos no gelo por no máximo uma hora.Então, depois de girar as células, armazene o plasma em novos tubos de microcentrífuga a menos 70 graus Celsius até uma análise mais aprofundada. A ativação dos fatores de coagulação é mais provável de ocorrer no sangue estagnado à medida que a probabilidade de uma interação entre os fatores ativados aumenta. De fato, o volume de sangue sem qualquer movimento por bolhas de ar é duas vezes e meia maior.Quando 1,75 mililitros de sangue são adicionados à câmara em comparação com quando 1,5 mililitros de sangue são usados, os valores medidos de trombina antitrombina sugerem um aumento da formação de trombina antitrombina com um aumento do volume sanguíneo também. Curiosamente, quando cinco são incubados com qualquer volume de sangue total, não são observadas diferenças entre os dois grupos, sugerindo que as células endoteliais podem modular a ativação da coagulação para estudar o efeito do TNF alfa no recrutamento de leucócitos. Neste experimento, qve foram tratados com 20 nanogramas por mililitro de TT NF alfa quatro horas antes do contato com o sangue, após o qual o número de células CD 16 positivas foi quantificado.O recrutamento das células positivas para CD 16 aumentou significativamente com o tratamento com TNF alfa de 100 para 256 células positivas para CD 16 por milímetro quadrado e 1,5 litros de sangue, e de 172 para 378 e 1,75 mililitros de sangue. A formação dos complexos trombina antitrombina foi então medida nas amostras de plasma correspondentes do sangue incubado com células tratadas ou não tratadas com TNF alfa. Como esperado, as células estimuladas por TNF alfa induziram uma duplicação aproximada dos complexos trombina antitrombina em comparação com os controles não tratados após seu desenvolvimento.Essa técnica abrirá caminho para pesquisadores no campo da imunologia explorarem, complementarem e coagularem em um modelo in vitro usando células primárias humanas e sangue total humano.

a-novel-vitro-model-for-studying-interactions-between-human-whole

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Um método para a cultura de uma monocamada de células endoteliais em toda a superfície interior 3D inteiro de um dispositivo micro com microvascular de tamanho canais (= 30 mm) é descrito.

A microfluídica Endothelialized para estudo das interacções microvasculares em Doenças Hematológicas

Para estudar a interação das bactérias com os vasos sanguíneos sob tensão de cisalhamento, são descritas uma câmara de fluxo e um modelo de microscopia intravital mesentérica in vivo que permite dissecar os fatores bacterianos e hospedeiros que contribuem para a adesão vascular.

In Vitro e In Vivo modelo para estudar a adesão bacteriana para o Vaso de parede em condições de escoamento

Este protocolo replica o fluxo sanguíneo fisiológico ou patológico in vitro para auxiliar na determinação da resposta celular em patologias de doenças. Com a introdução de uma pressão da câmara a jusante de uma bomba de sangue de amortecimento, o fluxo de sangue em toda a vasculatura pode ser recapitulada e que incide sobre uma monocamada de endotélio vascular ou de uma co-cultura mimética.

In Vitro Modelo de fisiológicos e patológicos fluxo de sangue com aplicativos para Investigações de Reformas celular Vascular

As células endoteliais primárias da veia umbilical humana (HUVECs) foram cultivadas até a confluência dentro de um dispositivo de rede microfluídica. A junção celular endotelial e as distribuições de F-actina foram ilustradas e as mudanças na concentração de cálcio intracelular e na produção de óxido nítrico em resposta ao trifosfato de adenosina (ATP) foram quantificadas em tempo real em níveis celulares individuais.

Desenvolvimento e Caracterização de<em&gt; In Vitro</em&gt; Rede de microvasos e medições quantitativas de endotelial [ca<sup&gt; 2+</sup&gt;]<sub&gt; i</sub&gt; E óxido nítrico Produção

Nós apresentamos um protocolo para estudar as interações endotelial-pericyte humanos no rato usando uma variação do ensaio plugue angiogênese gel matriz.

No estudo in vivo da Human Interaction Endotelial-pericyte usando o plug Ensaio Matrix Gel no mouse

Apresentamos um modelo in vitro que permite o estudo e a análise de coagulação em inteiro, sangue não anticoagulado. Anticoagulação no sistema depende do efeito anticoagulante natural das células endoteliais saudáveis e ativação de células endoteliais resultará na coagulação.

Avaliação das propriedades das células endoteliais utilizando cultura de células 3D e sangue não anticoagulado anticoagulantes e anti-inflamatório

Este protocolo descreve uma avaliação abrangente da hemocompatibilidade de dispositivos de contato com o sangue usando implantes neurovasculares cortados a laser. Um modelo de loop de fluxo com sangue humano fresco e heparinizado é aplicado para imitar o fluxo sanguíneo. Após a perfusão, vários marcadores hematológicos são analisados e comparados aos valores obtidos diretamente após a coleta de sangue para avaliação da hemocompatibilidade dos dispositivos testados.

Teste de hemocompatibilidade de implantes de contato com o sangue em um modelo de loop de fluxo imitando o fluxo sanguíneo humano

Apresentamos um modelo de doença vascular in vitro para investigar interações sanguíneas inteiras com o endotélio derivado do paciente. Este sistema permite o estudo de propriedades trombogênicas das células endoteliais primárias em várias circunstâncias. O método é especialmente adequado para avaliar em trombogenicidade situ e terapia anticoagulação durante diferentes fases de coagulação.

Modelo de doença microfluida in vitro para estudar interações endoteliais de sangue inteiro e dinâmica do coágulo sanguíneo em tempo real

Apresentado aqui é um protocolo para um modelo de loop hemodinâmico in vitro padronizado. Este modelo permite testar a hemocompatibilidade de tubos de perfusão ou stents vasculares de acordo com a norma ISO (Organização Internacional para Padronização) 10993-4.

Um modelo de loop hemodinâmico in vitro para investigar a hemocitocompatibilidade e ativação celular hospedeira de dispositivos médicos vasculares

Descreve-se aqui um fluxo de trabalho simples para diferenciar células endoteliais de células-tronco pluripotentes humanas, seguido de um protocolo detalhado para sua estimulação mecânica. Isso permite o estudo da mecanobiologia do desenvolvimento das células endoteliais. Esta abordagem é compatível com ensaios a jusante de células vivas coletadas do chip de cultura após estimulação mecânica.

In vitro Modelo de Embarcação Humana Fetal On-chip para Estudo da Mecanobiologia do Desenvolvimento

Aprenda a estudar interações entre sangue humano e células endoteliais usando um modelo in vitro inovador. Esta técnica permite avaliar coagulação e recrutamento de leucócitos em sistema humano.

A Novel In vitro Modelo para estudar as interações entre a Whole Humano Sangue e endotélio

Explorar mais vídeos