تقنية تسلل الطرد المركزي لاستخراج Apoplastic السوائل من أوراق النبات عن طريق فاصيلوس الشائع كمثال

الهدف من هذا الإجراء هو إثبات استخراج السائل اللابلاستيكي من أوراق النبات باستخدام تقنية الطرد المركزي للتسلل. يتم تحقيق ذلك عن طريق غمر ورقة أولا في سائل التسلل ، واستخدام الاختلافات في الضغط الناتج باستخدام حقنة أو مضخة تفريغ للتسلل إليها بالكامل. الخطوة الثانية هي تحضير الورقة ليتم طردها بالطرد المركزي باستخدام جهاز داعم.

بعد ذلك ، يتم طرد الورقة برفق للحصول على سائل غسيل APO plast. الخطوة الأخيرة هي تحديد عامل تخفيف البلاست APO وفحص جودة سائل الغسيل الألاست. في النهاية ، يتم استخدام مقايسة الطرد المركزي للتسلل للحصول على عينات APO plast التمثيلية التي يمكن استخدامها لمجموعة متنوعة من التحليل النهائي.

الميزة الرئيسية لهذه التقنية للطرق الأخرى الموجودة هي أنه من السهل تحسينها لمجموعة متنوعة من أنواع الأوراق من أجل الحصول على عينات علوية بالإضافة إلى الحد الأدنى من التلوث بالمركبات السيتوبلازمية. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجالات مثل فسيولوجيا النبات وتفاعلات ميكروبات النبات ، حيث من المهم فهم كيفية اختلاف تكوين APLs بين النباتات والتغيرات في ظل الظروف الفسيولوجية أو الضغوط المختلفة. كخطوة أولى ، اتخذ احتياطات السلامة من خلال ارتداء معطف المختبر والقفازات والنظارات الواقية.

بعد ذلك ، قم بإعداد كمية من الماء المقطر لغمر عينة الورقة. جهز شفرة حلاقة لجمع عينة في هذه الحالة ، ورقة من صنف الفاصوليا خضراء طرية. ضع شفرة الحلاقة على أليف من ورقة وقم بتوصيل الورقة من النبات.

بمجرد جمعها ، اغمر الورقة المستقطعة حديثا في الماء المقطر لإزالة ملوثات سطح الأوراق. ثم استخدم مناديل أو ورقا ماصة لمنع جفاف الورقة برفق. قم بقياس وزن الورقة قبل الشروع في التسلل.

سيساعد هذا لاحقا في تقريب حجم التسلل. ابدأ عملية التسلل بحقنة 60 ملليلتر. مع إزالة المكبس ، قم بلف الورقة بعناية أو قم بطيها في المحقنة.

بعد ذلك ، املأ المحقنة بسائل التسلل. هنا ، يتم استخدام الماء المقطر. أدخل المكبس واقلب المحقنة لإخراج أي هواء بداخلها.

لاحظ لون الورقة للمقارنة لاحقا. حرك المكبس إلى علامة 40 مليلتر باستخدام قطعة صغيرة من para param. قم بتغطية طرف المحقنة.

ثم اسحب المكبس إلى علامة 60 مليلتر لخلق ضغط سلبي. اقلب المحقنة لتحرير فقاعات الهواء من سطح الورقة. أعد المكبس ببطء إلى وضع البداية خلال ثانيتين تقريبا.

اكشف الغطاء عن طرف المحقنة وأخرج أي هواء. ثم قم بتغطية الطرف مرة أخرى واضغط على المكبس لخلق قدر متواضع من الضغط الإيجابي. استمر في الضغط السلبي لإخراج الهواء والضغط الإيجابي حتى يتم اختراق الورقة بالكامل.

الدليل على التسلل الكامل هو اللون الداكن للمناطق المتسللة. بمجرد رؤية ذلك ، قم بإزالة الورقة من المحقنة. قم بسد الورقة برفق بورق ماص لإزالة السائل السطحي.

ثم قم بقياس وزن الورقة المخللة ، وتستخدم طريقة التسلل البديلة قارورة مفرغة. مرة أخرى ، اجمع ورقة واشطفها بالماء المقطر. بعد تفجيرها حتى تجف ، قم بقياس وزن الورقة.

احصل على قارورة السلاح الجانبي بسعة لا تقل عن 250 مل. ضع الورقة في القارورة وقم بتغطيتها بالماء المقطر. بعد ذلك ، ضع سدادة في القارورة وقم بتوصيل مضخة تفريغ بالسلاح الجانبي.

ضع فراغا على القارورة لفترة كافية لتحقيق الضغط. حوالي 650 ملم من الزئبق. حرك القارورة برفق لتحرير فقاعات الهواء من الورقة تحت ضغط منخفض.

ثم حرر المكنسة الكهربائية بعناية وببطء على مدار حوالي 10 ثوان. كرر عملية وضع الفراغ ، وتحريك القارورة ، وتحرير الفراغ حتى يتم تسلل الورقة بالكامل. الدليل على التسلل الكامل هو اللون الداكن للمناطق المتسللة.

قم بإزالة الورقة المخللة بالكامل من القارورة وامسح الورقة برفق بورق ماص. لإزالة السائل السطحي ، قم بقياس وزن الورقة المخللة للسماح بتحديد حجم التسلل التقريبي. بعد تسلل الورقة بالكامل ، قم بإعدادها للطرد المركزي.

ضع قطعة من فيلم بارا بعرض أربع بوصات. ضع الورقة على الفيلم الصغير. ثم باستخدام طرف ماصة سعة خمسة ملليلتر ، قم بلف الورقة في الفيلم الصغير.

خذ جسم حقنة سعة 20 مليلتر مع إزالة المكبس وأدخل الورقة الملفوفة بطرف الماصة. ضع أي حواف أوراق مقطوعة وتواجه نهاية المكبس. احصل على أنبوب بولي إيثيلين أو بولي كربونات سعة 50 مليلتر وأدخل المحقنة فيه.

استخدم جهاز طرد مركزي مع دوار دلو متأرجح. قم بتحميل الأنبوب الذي يحتوي على الورقة المخللة وأجهزة الطرد المركزي بأربع درجات مئوية و 1000 جم لمدة 10 دقائق. بعد الطرد المركزي ، افحص الورقة لتحديد ما إذا كان قد تم طرد غالبية سائل التسلل.

أنبوب الطرد المركزي الآن على سائل غسيل APO المستعاد ، ويستمر عن طريق سحب سائل الغسيل المجدد في أنابيب جديدة سعة 1.5 مل. ضع عينات سائل غسيل APO plast في جهاز الطرد المركزي وقم بالدوران عند 15،000 جم لمدة خمس دقائق لإزالة أي خلايا أو جسيمات. بعد الطرد المركزي ، قم بوضع الماصة في أنابيب جديدة.

احتفظ بالعينات على الجليد حتى يمكن تخزينها عند 80 درجة مئوية تحت الصفر. تتمثل إحدى طرق تقييم جودة سائل الغسيل APO plat في حساب عامل تخفيف لوحة APO. للقيام بذلك ، قم بإعداد مجلدين من الماء المقطر لسائل التسلل في هذه الحالة يكفي لعدة عمليات تسلل إلى حجم واحد.

أضف مسحوق النيلي القرمزي إلى التركيز النهائي البالغ 50 ميكرومولار. لا تضيف شيئا إلى الآخر. احصل على صفيحة دقيقة 96 جيدا تملأ ثلاثة آبار ب 200 ميكرولتر من محلول التسلل.

باستخدام القرمزي النيلي ، املأ ثلاثة أخرى ب 200 ميكرولتر من محلول التسلل النقي ، قم بقاعدة الصفيحة الدقيقة في القارئ لقياس امتصاص كل سائل. عند 610 نانومتر ، فإن متوسط امتصاص السائل مع القرمزي النيلي مطروحا منه متوسط المادة الماصة للسوائل دون إعطاء الامتصاص المصحح للتسلل. بعد ذلك ، قم بتكرار بروتوكول تسلل الأوراق ثلاث مرات لكل من حلول التسلل.

اغمر عينة من الأوراق في الماء. قم بالضغط السلبي والإيجابي عند استخدام محلول التسلل النيلي Carmine ، واشطف الأوراق بالماء المقطر بعد التسلل لإزالة أي قرمزي نيلي متبقي من سطح الورقة. استعادة سائل الغسيل باستخدام الطرد المركزي.

بعد استعادة سائل الغسيل الأخير ، ارجع إلى قارئ الألواح في آبار الصفيحة الدقيقة. وضعت 200 ميكرولتر من كل من المستخلصات الخالية من القرمزي النيلي ، وكذلك 200 ميكرولتر من كل استخراج سائل غسيل نيلي قرمزي. قياس امتصاص العينات عند 610 نانومتر للحصول على الامتصاص المصحح.

متوسط كل مجموعة من الأرقام وخذ الفرق. استخدم الامتصاص المصحح للتسلل والامتصاص المصحح لسائل الغسيل اللاتنسائي لتحديد عامل تخفيف APL للحصول على تقديرات للتركيزات أو الأنشطة في السائل اللابلاستيكي. يقوم الزرع بضرب التركيز أو قيم النشاط من سائل الغسيل في عامل التخفيف المستخرج من سائل الغسيل المستخرج من صنف فاسي الشائع.

تم استخدام العطاء الأخضر لإنتاج هذه الأحماض العضوية ذات الطيف الكتلي الكروماتوغرافيا الغازية. تمثل السكريات والأحماض الأمينية البسيطة الجزء الأكبر من المستقلبات التي يمكن التعرف عليها. فيما يلي مقارنة بين صفحة SDS ، جل صبغة Kumasi من مستخلصات أوراق سائل الغسيل fasi vulgarus alast.

تختلف عمليات الاستخراج في كمية التلوث السيتوبلازمي. لوحظ هذا على أنه كميات مختلفة من إنزيم الجص روبيس. عند إجراء هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر أن تكون لطيفا قدر الإمكان على الأقل لتجنب التسبب في أي تلف في الأنسجة أو تلوث سيتوبلازمي بعد هذا الإجراء.

يمكن إجراء طرق أخرى مثل قياس الطيف الكتلي للبروتين أو المستقلب من أجل الإجابة على أسئلة إضافية تتعلق بتكوين السائل اللابلاستيكي. يمكن أيضا استخدام سائل الغسيل اللابلاستيكي كوسيط إجمالي لدراسة تأثير المواد الكيميائية اللاتنسائية على الكائنات الحية الدقيقة التي تستعمر الأنسجة النباتية.