FIM изображений и FIMtrack: Два новых инструментов, позволяющих с высокой пропускной способностью и анализ экономической эффективности опорно-двигательного

Общая цель данной методологии заключается в визуализации и количественной оценке локомоции личинок Drosophila Melan Gaster, что позволяет проводить высокопроизводительный скрининг в условиях свободного перемещения. Это достигается за счет создания поверхности слежения на установке FIM и использования фрустрированного полного внутреннего отражения для непрямого освещения. Затем личинки различных генотипов помещаются на поверхность и регистрируется поведение ползания в ответ на градиент тепла.

Затем видео анализируются с помощью FIM Track. Программное обеспечение и полученные данные используются для построения графиков, описывающих различия в личинках, паттернах передвижения. Результаты показывают, что точное, высокопроизводительное, гибкое и простое в использовании количественное определение личинок.

Локомоция может быть выполнена на основе метода визуализации FIM и связанной с ним программы трека FIM. Основное преимущество этой техники визуализации по сравнению с существующими методами, такими как использование падающего или проходящего света, заключается в том, что видны только животные, соприкасающиеся с поверхностью, что приводит к превосходному контрасту фона переднего плана без мешающих артефактов, хотя этот метод может дать представление о биологии лавы. Он также может быть применен для изучения поведения ходячих мух и передвижения других моноорганизмов, таких как морская элегантность, поломки или даже рост корней растений.

Визуальная демонстрация этого метода имеет решающее значение для того, чтобы убедить других в том, что сложная технология проста в использовании. Первым шагом является создание влажной поверхности для ползания по методу визуализации на основе FITR или FIM. Для этого отварите 0,8%-ный пищевой шнек в деионизированной сверхчистой воде.

Налейте горячий шнек на пластину из акрилового стекла. Не взбалтывайте шнек после закипания и полейте постоянно. Чтобы избежать образования пузырей при такой температуре, следует создать плиту толщиной два миллиметра.

С помощью оставшегося шнекового раствора заполните стандартные шестисантиметровые чашки Петри. Они будут использоваться для сортировки чистых и привыкания личинок до начала эксперимента. Далее обрежьте примерно два сантиметра от периметра шнековой плиты, чтобы получить ровную квадратную поверхность для записи.

Перенесите шнековую плиту в установку FIM сразу после охлаждения. Осторожно надавливая шнек на край пластины из акрилового стекла, шнек должен скользить на месте. Теперь вы готовы к подготовке к визуализации, чтобы установить барьер с аверсивным шнеком в поверхность для ползания.

Отварить 2,5%-ный пищевой шнек с тремя молярами NACL в деионизированной сверхчистой воде. Далее вырежьте в предварительно залитую поверхность для ползания выемку шириной два сантиметра, окружающую поле зрения. Когда все будет готово, заполните выемку соляным шнеком на 0,1 – 0,3 сантиметра выше поверхности слежения.

Далее подготавливаем устройство для градиента тепла. Устройство представляет собой алюминиевую пластину, покрытую изолирующей поверхностью и перфузированную водой из насосов с обоих концов. Чтобы обеспечить контроль температуры, включите устройство градиента нагрева за час до использования и поместите его над установкой, чтобы оно достигло желаемой температуры.

Это время можно использовать для дальнейшей подготовки. Когда все будет готово, перенесите шнек с поверхностью ползания с соляным барьером в установку. Поместите пластину радиатора над шнеком и отрегулируйте расстояние между пластиной и поверхностью для ползания с точностью до двух миллиметров.

Установите линейный градиент от 34 градусов по Цельсию до 18 градусов по Цельсию, регулируя температуру водных контуров с точностью до одного градуса Цельсия и 45 градусов Цельсия, что подходит для данного оборудования. Дайте поверхности для ползания уравновеситься в градиенте в течение 20 минут. Прежде чем продолжить, проверьте градиент температуры с помощью TER для подготовки мух, извлеките их из инкубатора с температурой 25 градусов Цельсия и капните немного воды в пробирки для культур, чтобы занять третье место в движении личинок звезд

Далее соберите самых крупных личинок со стенок флакона с помощью небольшой кисти, за две-пять минут до записи перенесите в приготовленную ранее чашку Петри достаточное количество личинок для одного видео. После того как градиент температуры будет установлен, настройте программное обеспечение для записи. Укажите количество кадров для каждого видео.

Определите путь сохранения и настройте мгновенную запись в течение 20 секунд. После размещения личинок на поверхности для ползания следует начать съемку одной из личинок и отрегулировать интенсивность освещения для получения хорошего контраста. Когда все будет готово, слегка приподнимите пластину радиатора и поместите личинки при температуре 34 градуса Цельсия, в двух сантиметрах от солевого барьера.

Снова опустите пластину радиатора и начните запись в темноте, чтобы не беспокоить животных. После записи удалите личинки начисто и увлажните поверхность. Чтобы избежать растекания NACL, не прикасайтесь к соляному шнеку во время работы, при этом поверхность должна постоянно оставаться влажной, избегайте чрезмерной влажности, которая может быть видна в виде ореолов или капель вокруг личинок.

При записи и нарушении слежения дайте поверхности шнека уравновеситься в течение одной-двух минут, прежде чем продолжить. За это время сохраните собранные изображения и соберите новых животных. Чтобы подготовиться к следующему видео, контролируйте градиент температуры с помощью TER каждые пять видеороликов и при необходимости отрегулируйте температурное устройство.

Чтобы начать отслеживание передвижения, настройте параметры отслеживания с помощью опции предварительного просмотра. Отрегулируйте миллиметр на пиксель в соответствии с камерой и полем зрения. Далее отрегулируйте количество кадров в секунду в зависимости от настроек камеры, используйте обратную связь, полученную в окне предварительного просмотра, чтобы настроить пороги яркости так, чтобы все животные были обнаружены правильно.

Далее отрегулируйте пороговые значения размера области личинок, желтыми кружками выделяются одиночные животные, красным цветом выделяются сталкивающиеся личинки, а синим цветом дается площадь каждого животного. Начните отслеживание с помощью кнопки внизу справа после сеанса отслеживания, изображение со следами личинок и CSV-файл, содержащий рассчитанные особенности передвижения и осанки, сохраняется в каталоге изображений. Наконец, используйте модуль просмотра результатов FIM для просмотра и ручной корректировки результатов отслеживания.

Определите ориентацию ползания по отношению к градиенту тепла, чтобы оценить данные на основе этого стимула. На изображении личинки, показанном здесь, между этими точками отмечены голова и хвостовая точка. Произвольное нечетное количество точек позвоночника может быть задано с радиусом.

Кроме того, рассчитывается центр масс и угол изгиба основного корпуса. Здесь показаны результаты визуализации FI и слежения с разных камер. На снимках слева запечатлены три личинки, ползающие по ступень слежения размером 10 на 10 сантиметров.

Траектория массы и площадь одной личинки показаны справа. Красная стрелка указывает на временную точку обрезанного изображения, полученного в результате применения. Тепловой стимул показан здесь в виде разноцветных траекторий, рассчитанных по траектории F.

Эти прикладные изображения с высоким разрешением третьей, второй и первой личинок звезд были получены с помощью макрообъектива. Другие организмы, такие как море, также можно легко визуализировать. После освоения можно анализировать около ста лабораторий в час на каждую настройку отслеживания.

Пытаясь выполнить эту процедуру, важно помнить о том, что после этой процедуры всегда нужно записывать в одних и тех же условиях. Другие методы, такие как оптогенетическая стимуляция или обнаружение нейронной активности in vivo, могут быть включены в установку. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее понимание того, насколько легко можно эффективно анализировать улярную локомоцию.