评估不同波长和强度的红光/近红外光疗法对氧化应激影响的方法 体外

以下实验方案的总体目标是评估一系列波长和强度的红光及近红外光疗法对体外氧化应激的影响。为实现这一目标，我们开发了一种新型的光照递送方法，可精确调控所施加光的波长和强度。我们将氙灯或宽带光源安装在金属底座上的外壳中，然后在光源前方依次放置镀膜透镜、水滤光器和入射光阑。

该操作步骤的下一步是将宽带光源产生的光引导通过入口、光阑和液体光导，再通过第二个涂层透镜。然后安装带宽和中性密度滤光片，以获得所需波长和光强的光。需要注意的是，这些滤光片允许通过一个狭窄的波长范围，该范围被称为波段。

与现有的红光近红外光疗技术（如LED或激光）相比，该技术的主要优势在于能够对波长和强度参数进行精确且校准的调控。这使得我们能够优化光的递送方式，以获得最佳的生物学效应，本研究即针对解离的细胞进行类似操作。此外，该技术还可应用于其他系统，例如神经创伤的类器官模型。

使用任何明亮的宽带光源时，切勿直接注视光源，以免造成永久性视觉损伤。准备光传输装置时，将氙灯或钨灯等宽带光源连接至适当的电源。在光源前方放置一个准直透镜，以产生一束准直的光线。

将光线通过液体热滤光器，以去除光束中的大部分热量。在光源前方放置一个准直透镜，以产生一束准直光。再次将光线通过液体热滤光器，以进一步去除光束中的大部分热量。

根据具体应用，将准直光束聚焦至液体光导的入口孔径，以实现更灵活的光传输。在液体光导的另一端，放置第二个聚焦透镜，随后安装干涉滤光片和中性密度滤光片的支架。该配置应产生一个光照均匀、具有目标波段和强度的光斑。

导光管末端与样本平面之间的距离可能需要根据所需照明的区域进行调整。需要注意的是，根据平方反比定律，在本研究中，随着导光管末端距离的增加，光强度将降低。本实验中该距离为14厘米，可产生均匀照亮96孔组织培养板上3×3孔区域的光束横截面。

确保来自光源及相关光学组件的杂散光无法照射到其他样本，例如可使用黑色硬纸板进行遮挡。设备组装完成后，启动液体热滤器的水冷机，并确保滤器夹套中有水流持续交换。打开光源电源，等待至少五分钟，使宽带光源稳定。

为了实现稳定，选择窄带干扰滤光片以产生所需的照明波段。在处理过程中，测量光源在样本放置平面处产生的光照强度。

使用经过校准的辐照度探头连接合适的光谱辐射计来测量光。利用中性密度滤光片调节光强，直至达到所需的输出值。在本研究中，通过中性密度滤光片调节每种干涉滤光片透过的光强，使四个处理波段的光量子输出相等。

所述的红色近红外光疗法递送方法可应用于任何细胞类型或体外模型系统。在此，我们展示了使用嗜铬细胞瘤（pheochromocytoma）或PC 12细胞进行光递送的技术。例如，在生长培养基中培养细胞。

在96孔板中，使用多聚赖氨酸包被，待细胞生长至70%至80%融合。用完全生长培养基配制所需浓度的谷氨酸或其他应激刺激物。本实验中使用10毫摩尔谷氨酸。

移除细胞中的培养基，用磷酸盐缓冲液轻轻洗涤三次。洗涤后，加入含谷氨酸的培养基，每孔总体积为100 µL。在加入谷氨酸或所选应激因子后，立即将培养板置于已准备好的光递送装置下，以所需的波长和强度对细胞进行光照处理。

务必使用已确定的中性密度滤光片组合来调节光束的光量输出，具体组合取决于所使用的波长。完成光照处理后，将细胞置于水平表面上，并在37摄氏度、二氧化碳浓度受控的条件下孵育24小时。

也可以追加红光和近红外光疗法的照射剂量。在进行最后一轮光照处理前，准备好用于检测活性氧（作为氧化应激指标）的试剂。此处我们使用特定的荧光探针，当其与包括超氧阴离子在内的多种活性物质发生反应时会产生荧光，如二氢乙啶（DHE）和荧光素二乙酸酯（FDA）。按照步骤四所述对细胞进行光照处理，确保细胞接受目标光通量和特定波长的光照。

光照处理后立即移除含谷氨酸的培养基，并用PBS洗涤两次。根据制造商说明书，使用与活性物质反应后可产生荧光的指示染料进行后续检测。采用酶标仪在适当的激发和发射波长设置下测定指示染料产生的荧光强度。

根据制造商的说明，使用比色法试剂盒对各孔中的蛋白质浓度进行定量。将每个孔的荧光输出结果相对于其蛋白质浓度进行归一化表达，然后使用统计学软件分析结果。该技术的发展为研究人员探索多种波长和强度的红光及近红外光疗法对氧化应激的影响提供了途径。

该技术可用于多种模型系统，包括离解细胞或器官型培养物。