Name: Snelle Fractionering en isolatie van volbloed componenten in monsters verkregen van een communautair gevestigde instelling (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-11-30T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 31 s
Description: Leer een gestroomlijnde methode voor snelle fractieëring van volbloedcomponenten zoals DNA, RNA, plasma en PBMC's. Dit protocol verbetert de efficiëntie van hoogwaardige celisolatie in niet-klinische settings.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We willen Henriette Mair-Meijers bedanken voor haar onschatbare aandacht voor detail en de uren die zij besteedde aan het verwerken van de bloedcollecties. We zijn dankbaar voor de expertise in grafisch ontwerp van Natalie Jameson Kiesling. We waarderen ook de goedkeuring van de fabrikanten (Qiagen (Valencia, CA), BD Biosciences (San Jose, CA), Life Technologies (Grand Island, NY)) die hierin worden genoemd, om het gebruik van hun producten te publiceren zoals beschreven. De financiering voor dit werk werd genereus verstrekt door de National Institutes of Health met de toekenningsnummers DA022720, RC1MH088283 en DA022720-05-S1.

<ol><li>Hernandez, M. E., Martinez-Fong, D., Perez-Tapia, M., Estrada-Garcia, I., Estrada-Parra, S., Pavon, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+the+effect+of+selective+serotonin-reuptake+inhibitors+on+lymphocyte+subsets+in+patients+with+a+major+depressive+disorder%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+Neuropsychopharmacol%22%5BJournal%5D)">Evaluation of the effect of selective serotonin-reuptake inhibitors on lymphocyte subsets in patients with a major depressive disorder.</a> Eur Neuropsychopharmacol. 20, 88-95 (2010).</li>
<li>Weigelt, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TREM-1+and+DAP12+expression+in+monocytes+of+patients+with+severe+psychiatric+disorders+EGR3%2C+ATF3+and+PU.1+as+important+transcription+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Behav+Immun%22%5BJournal%5D)">TREM-1 and DAP12 expression in monocytes of patients with severe psychiatric disorders EGR3, ATF3 and PU.1 as important transcription factors.</a> Brain Behav Immun. 25, 1162-1169 (2011).</li>
<li>Robertson, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymphocyte+subset+differences+in+patients+with+chronic+fatigue+syndrome%2C+multiple+sclerosis+and+major+depression%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Exp+Immunol%22%5BJournal%5D)">Lymphocyte subset differences in patients with chronic fatigue syndrome, multiple sclerosis and major depression.</a> Clin Exp Immunol. 141, 326-332 (2005).</li>
<li>Rotter, A., Asemann, R., Decker, A., Kornhuber, J., Biermann, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Orexin+expression+and+promoter-methylation+in+peripheral+blood+of+patients+suffering+from+major+depressive+disorder%5BTitle%5D)+AND+%22J+Affect+Disord%22%5BJournal%5D)">Orexin expression and promoter-methylation in peripheral blood of patients suffering from major depressive disorder.</a> J Affect Disord. 131, 186-192 (2011).</li>
<li>Klengel, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Allele-specific+FKBP5+DNA+demethylation+mediates+gene-childhood+trauma+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Allele-specific FKBP5 DNA demethylation mediates gene-childhood trauma interactions.</a> Nat Neurosci. 16, 33-41 (2013).</li>
<li>Segman, R. H., Shefi, N., Goltser-Dubner, T., Friedman, N., Kaminski, N., Shalev, A. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peripheral+blood+mononuclear+cell+gene+expression+profiles+identify+emergent+post-traumatic+stress+disorder+among+trauma+survivors%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Peripheral blood mononuclear cell gene expression profiles identify emergent post-traumatic stress disorder among trauma survivors.</a> Mol Psychiatry. 10, 500-513 (2005).</li>
<li>Smith, B. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cohort+Profile%3A+Generation+Scotland%3A+Scottish+Family+Health+Study+%28GS%3ASFHS%29.+The+study%2C+its+participants+and+their+potential+for+genetic+research+on+health+and+illness%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Epidemiol%22%5BJournal%5D)">Cohort Profile: Generation Scotland: Scottish Family Health Study (GS:SFHS). The study, its participants and their potential for genetic research on health and illness.</a> Int J Epidemiol. 42, 689-700 (2013).</li>
<li>Mallone, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+preservation+of+peripheral+blood+mononuclear+cells+for+analysis+of+islet+antigen-reactive+T+cell+responses%3A+position+statement+of+the+T-Cell+Workshop+Committee+of+the+Immunology+of+Diabetes+Society%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Exp+Immunol%22%5BJournal%5D)">Isolation and preservation of peripheral blood mononuclear cells for analysis of islet antigen-reactive T cell responses: position statement of the T-Cell Workshop Committee of the Immunology of Diabetes Society.</a> Clin Exp Immunol. 163, 33-49 (2011).</li>
<li>Duvigneau, J. C., Hartl, R. T., Teinfalt, M., Gemeiner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delay+in+processing+porcine+whole+blood+affects+cytokine+expression%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Delay in processing porcine whole blood affects cytokine expression.</a> J Immunol Methods. 272, 11-21 (2003).</li>
<li>Debey, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+different+isolation+techniques+prior+gene+expression+profiling+of+blood+derived+cells%3A+impact+on+physiological+responses%2C+on+overall+expression+and+the+role+of+different+cell+types%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacogenomics+J%22%5BJournal%5D)">Comparison of different isolation techniques prior gene expression profiling of blood derived cells: impact on physiological responses, on overall expression and the role of different cell types.</a> Pharmacogenomics J. 4, 193-207 (2004).</li>
<li>Uddin, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+and+immune+function+profiles+associated+with+posttraumatic+stress+disorder%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Epigenetic and immune function profiles associated with posttraumatic stress disorder.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 9470-9475 (2010).</li>
<li>Kessler, R. C., Wang, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+descriptive+epidemiology+of+commonly+occurring+mental+disorders+in+the+United+States%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Public+Health%22%5BJournal%5D)">The descriptive epidemiology of commonly occurring mental disorders in the United States.</a> Annu Rev Public Health. 29, 115-129 (2008).</li>
<li>Qiagen. QIAamp® DNA Mini and Blood Mini Handbook. , Valencia, California, USA. Available from:
 <a target="_blank" href="https://www.qiagen.com/us/resources/resourcedetail?id=67893a91-946f-49b5-8033-394fa5d752ea">https://www.qiagen.com/us/resources/resourcedetail?id=67893a91-946f-49b5-8033-394fa5d752ea</a> (2010).</li>
<li>Thermo Scientific. NanoDrop 1000 Spectrophotometer. , Waltham, Massachusetts, USA. Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.nanodrop.com/Library/nd-1000-v3.8-users-manual-8">http://www.nanodrop.com/Library/nd-1000-v3.8-users-manual-8</a> (2010).</li>
<li>Life Technologies. LeukoLOCK™ Total RNA Isolation System. , Grand Island, New York, USA. Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.ambion.com/techlib/misc/leuko_iso.pdf">http://www.ambion.com/techlib/misc/leuko_iso.pdf</a> (2011).</li>
<li>Life Technologies. Countess™ Automated Cell Counter. , Grand Island, New York, USA. Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.lifetechnologies.com/content/dam/LifeTech/migration/files/cell-analysis/pdfs.par.5257.file.dat/mp10227-countess">http://www.lifetechnologies.com/content/dam/LifeTech/migration/files/cell-analysis/pdfs.par.5257.file.dat/mp10227-countess</a> (2009).</li>
<li>Life Technologies. Alternative Protocol for Extraction of RNA from Cells Captured on LeukoLOCK™ Filters Using TRI Reagent®. , Grand Island, New York, USA. Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.lifetechnologies.com/us/en/home/references/protocols/nucleic-acid-purification-and-analysis/rna-protocol/alternative-protocol-extraction-of-rna-from-cells-captured-on-leukolock-filters-using-tri-reagent.html">http://www.lifetechnologies.com/us/en/home/references/protocols/nucleic-acid-purification-and-analysis/rna-protocol/alternative-protocol-extraction-of-rna-from-cells-captured-on-leukolock-filters-using-tri-reagent.html</a> (2011).</li>
<li>Life Technologies. DNA-free™ Kit. , Grand Island, New York, USA. Available from:
 <a target="_blank" href="http://tools.lifetechnologies.com/content/sfs/manuals/cms_055739.pdf">http://tools.lifetechnologies.com/content/sfs/manuals/cms_055739.pdf</a> (2012).</li>
<li>Agilent Technologies. Agilent RNA 6000 Nano Kit Guide. , Santa Clara, California, USA. Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.genomics.agilent.com/files/Manual/G2938-90034_KitRNA6000Nano_ebook.pdf">http://www.genomics.agilent.com/files/Manual/G2938-90034_KitRNA6000Nano_ebook.pdf</a> (2006).</li>
<li>Koenen, K. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SLC6A4+methylation+modifies+the+effect+of+the+number+of+traumatic+events+on+risk+for+posttraumatic+stress+disorder%5BTitle%5D)+AND+%22Depress+Anxiety%22%5BJournal%5D)">SLC6A4 methylation modifies the effect of the number of traumatic events on risk for posttraumatic stress disorder.</a> Depress Anxiety. 28, 639-647 (2011).</li>
<li>Walsh, K., Uddin, M., Soliven, R., Wildman, D. E., Bradley, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Associations+between+the+SS+variant+of+5-HTTLPR+and+PTSD+among+adults+with+histories+of+childhood+emotional+abuse%3A+Results+from+two+African+American+independent+samples%5BTitle%5D)+AND+%22J+Affect+Disord%22%5BJournal%5D)">Associations between the SS variant of 5-HTTLPR and PTSD among adults with histories of childhood emotional abuse: Results from two African American independent samples.</a> J Affect Disord. 161, 91-96 (2014).</li>
<li>Bustamante, A. C., et al. Childhood maltreatment is associated with epigenetic differences in hypothalamic-pituitary-adrenal (HPA) axis genes in the Detroit Neighborhood Health Study. American Association of Physical Anthropologists 82nd Annual Meeting, Knoxville, TN, , Comprehensive Psychiatry. (2013).</li>
<li>Sipahi, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Longitudinal+epigenetic+variation+of+DNA+methyltransferase+genes+is+associated+with+vulnerability+to+post-traumatic+stress+disorder%5BTitle%5D)+AND+%22Psychol+Med%22%5BJournal%5D)">Longitudinal epigenetic variation of DNA methyltransferase genes is associated with vulnerability to post-traumatic stress disorder.</a> Psychol Med. 44, 3165-3179 (2014).</li>
<li>Uddin, M., Koenen, K. C., Aiello, A. E., Wildman, D., de los Santos, R., Galea, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+and+inflammatory+marker+profiles+associated+with+depression+in+a+community-based+epidemiologic+sample%5BTitle%5D)+AND+%22Psychol+Med%22%5BJournal%5D)">Epigenetic and inflammatory marker profiles associated with depression in a community-based epidemiologic sample.</a> Psychol Med. 41, 997-1007 (2011).</li>
<li>Uddin, M., et al. Post-traumatic stress disorder is associated with immunosenescent T cell phenotypes in the Detroit Neighborhood Health Study. 3rd North American Congress of Epidemiology, Montreal, QC, , (2011).</li>
<li>Uddin, M., et al. Post-traumatic stress disorder is associated with immunosenescent T cell phenotypes in the Detroit Neighborhood Health Study. 101st Annual Conference of the American Psychopathological Association, New York, NY, , (2011).</li>
<li>Uddin, M. Biological signatures of post-traumatic stress disorder in the Detroit Neighborhood Health Study. 9th International Conference on Urban Health, New York Academy of Medicine, , (2010).</li>
<li>Aiello, A. E. Cytomegalovirus antibodies as a marker of immunosenescence in the Detroit Neighborhood Health Study. 9th International Conference on Urban Health, New York Academy of Medicine, , (2010).</li>
<li>Bustamante, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBustamante%2C+AC+%22Distinct+gene+expression+profiles+characterize+lifetime+PTSD+and+childhood+maltreatment+in+the+Detroit+Neighborhood+Health+Study%22">Distinct gene expression profiles characterize lifetime PTSD and childhood maltreatment in the Detroit Neighborhood Health Study</a>. , International Society for Traumatic Stress Studies. Philadelphia, PA. (2013).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende belangen.

We hebben een gestroomlijnde protocol die met succes toegepast voor meer dan 1600 volbloedmonsters verwerken Detroit Wijk Health Study beschreven. Hoewel veel van deze technieken zijn in de literatuur, onze stap voor stap compilatie, waaronder juist getimede wijzigingen tussen elke stap, weerspiegelt een geoptimaliseerd, efficiënt protocol dat succes produceert diverse biologische monsters met uiteenlopende downstreamtoepassingen, waaronder DNA methylatie, mRNA expressie en immunologische analyse. Deze exemplaren zijn a...

Meerdere studies hebben gekenmerkt verschillen in genexpressie, DNA methylatie en cel subsets in het bloed bij mensen met en zonder mentale (of andere) ziekten 1-4. Deze studies zijn echter verkregen uit klinische omstandigheden waarin ziektegeassocieerde verschillen kunnen worden vergroot als gevolg van het algemeen ernstiger aard van de aandoeningen waarvoor patiënten om behandeling. Als gevolg van de vooruitgang in de &#39;omics &quot;aanpak, is de afgelopen tien jaar een explosie van belang bij het ​​verkrijgen van biologische monsters van de gemeenschap en / of epidemiologische instellingen 5-7, met het oog op basis van de bevolking schattingen van de prevalentie van de ziekte te bieden en een breder beeld van de waargenomen omgevingsdeterminanten van deze mentale en / of lichamelijke ziekten. Een belangrijke uitdaging in dit verband is het vereiste van een snelle verwerking van de verzamelde monsters. Degradatie van mononucleaire cellen, belangrijke immuunsysteem componenten die frequentl zijny gebruikte de gezondheid van een individu begint direct na bloedafname met een significante afname van herstel na 2 uur verzameld 8-10 te beoordelen. Om deze uitdaging aan te pakken, presenteren we een geoptimaliseerd protocol waarin meerdere onderdelen van het menselijk bloed gelijktijdig worden geïsoleerd uit monsters verkregen in huizen van de proefpersonen die in een groot stedelijk gebied. Het protocol is gebaseerd op onze samenstelling en modificatie van de huidige technieken, met inbegrip van opslag van &quot;extra&quot; fracties bij toekomstige technieken een verdere isolatie / analyse. Hoewel alternatieve werkwijzen of kits kunnen worden gebruikt in plaats van de afzonderlijke methoden beschreven, die beschreven zijn bewezen als een betrouwbare en efficiënte middelen voor het verwerken van monsters in een high-throughput manier. Hoogwaardige fracties (PBMC&#39;s, DNA, serum en RNA) vers bloed kan worden geproduceerd binnen 2 uur verzameld en alle assay ready monsters beschikbaar zijn binnen 2 dagen (figuur 1 kan worden). Dit protocol werd ontwikkeld om de efficiënte verwerking van monsters van de gemeenschap-woning, volwassen inwoners van de stad Detroit voor het testen in de Detroit Buurt Health Study staat (DNHS; DA022720, RC1MH088283, DA022720-05-S1), een populatie-gebaseerde studie van de sociale en biologische determinanten van post-traumatische stress-stoornis (PTSS) en andere psychische aandoeningen. De prevalentie van PTSS in Detroit is meer dan twee keer het nationale gemiddelde 11,12. Het identificeren van de biologische determinanten van PTSS bij deze populatie kan helpen om passende farmacologische en / of cognitieve gedragstherapie interventies om mensen die lijden aan de aandoening te helpen ontwikkelen, zowel in de stedelijke bevolking, en in de andere een hoog risico populaties (bv terugkerende militaire veteranen). Ons laboratorium, voorheen gevestigd aan de Wayne State University in Detroit, Michigan, werd geselecteerd voor de verwerking op basis van onze expertise in het omgaan met verse weefselmonsters afkomstig van een verscheidenheidvan bronnen, de noodzaak om te beginnen met de verwerking van de monsters binnen 2 uur van de collectie, en onze nabijheid van de collectie sites. Met deze unieke gelegenheid voorhanden, ons doel was om de verwerking grootste opbrengst van DNA, RNA, serum en perifere bloed mononucleaire cellen (PBMC) van elk monster (totaal N = 1639 monsters na 5 golven specimeninzameling) te optimaliseren. De hier geschetste procedures kunnen gelijktijdig worden uitgevoerd in een niet-klinische omgeving, waarbij verkregen uitgangsmateriaal (zie tabel 1 voor de gemiddelde opbrengst) voor een veelvoud van stroomafwaartse toepassingen zoals microarray, epigenetische, real-time RT-PCR, en flowcytometrie analyse. <img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/52227/52227fig1highres.jpg" width="700" /> Figuur 1. Algemene workflow. Het totale proces hier afgebeelde omvat de logistiek van het verkrijgen van de bloedmonsters van de identificatie toestemming particmers om het bloed te trekken zelf. Hoge kwaliteit, fracties (perifere mononucleaire bloedcellen, PBMCs, DNA, serum en RNA) van vers volbloed kan worden geproduceerd binnen 2 uur van de collectie en alle test-klaar exemplaren kunnen beschikbaar zijn binnen 2 dagen. Bovendien is het door middel van deze werkwijze bereide fracties geschikt voor langdurige opslag als monsters niet direct worden getest. De gehele tijdslijn hier beschreven kan in één dag (~ 5 uur totaal) worden ingevuld. Toch zou zo&#39;n dag zeer arbeidsintensief vooral voor een enkele technicus een aanzienlijke ervaring met de techniek. Dus, adviseren wij het ​​verdelen van de procedures op dag 1 tussen ten minste twee technici en het invullen van het RNA processing op dag 2. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52227/52227fig1highres.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>

<table><tbody><tr><td>QIAamp DNA Blood Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>51104</td><td>Dag 1: DNA isolatie</td></tr><tr><td>Phosphate-buffered saline (PBS)</td><td>Sigma</td><td>P5493-1L</td><td>Dag 1: PBMC isolatie</td></tr><tr><td>5 &frac34;&rdquo; Pasteur pipetten</td><td>Fisher</td><td>13-678-6A</td><td>Dag 1: PBMC isolatie</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS), heat inactivated</td><td>Life Technologies</td><td>10082147</td><td>Dag 1: PBMC isolatie</td></tr><tr><td>Dimethyl Sulfoxide (DMSO)</td><td>Sigma</td><td>D8418-500ml</td><td>Dag 1: PBMC isolatie</td></tr><tr><td>RPMI Medium 1640, liquid</td><td>Invitrogen</td><td>11875119</td><td>Dag 1: PBMC isolatie</td></tr><tr><td>0.4% trypan blue stain&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>T10282</td><td>Dag 1: PBMC isolatie</td></tr><tr><td>Countess Cell Counting Chamber</td><td>Invitrogen</td><td>C10283</td><td>Dag 1: PBMC isolatie</td></tr><tr><td>Countess Automated Cell Counter or cell counting device such as a microscope and hemocytometer</td><td>Invitrogen</td><td>C10281</td><td>Dag 1: PBMC isolatie</td></tr><tr><td>LeukoLOCK Fractionation &amp; Stabilization Kit&nbsp;</td><td>Ambion</td><td>1933</td><td>Dag 1: Leukocyte RNA isolatie</td></tr><tr><td>25&nbsp;G x 5/8 in. naalden</td><td>Becton Dickinson</td><td>305122</td><td>Dag 1: Leukocyte RNA isolatie</td></tr><tr><td>Spuiten (5&nbsp;ml)</td><td>Becton Dickinson</td><td>309646</td><td>Dag 1 en 2: Leukocyte RNA isolatie</td></tr><tr><td>Denaturing Lysis Solution&nbsp;</td><td>Ambion</td><td>8540G</td><td>Dag 2: Leukocyte RNA isolatie</td></tr><tr><td>5&nbsp;M NaCl</td><td>Life Technologies</td><td>24740011</td><td>Dag 2: Leukocyte RNA isolatie</td></tr><tr><td>TRI Reagent</td><td>Ambion</td><td>9738</td><td>Dag 2: Leukocyte RNA isolatie</td></tr><tr><td>Bromo-3-chloro-propaan (BCP)</td><td>Sigma</td><td>B-9673</td><td>Dag 2: Leukocyte RNA isolatie</td></tr><tr><td>spin cartridges&nbsp;</td><td>Ambion</td><td>10051G</td><td>Dag 2: Leukocyte RNA isolatie</td></tr><tr><td>0.1&nbsp;mM EDTA</td><td>Ambion</td><td>9912</td><td>Dag 2: Leukocyte RNA isolatie</td></tr><tr><td>DNA-free Kit</td><td>Ambion</td><td>AM1960</td><td>Dag 2: DNase behandeling</td></tr><tr><td>RNA 6000 Ladder&nbsp;</td><td>Agilent</td><td>5067-1529</td><td>Dag 2: Bioanalyzer analyse</td></tr><tr><td>RNA 6000 Nano Series II Kit&nbsp;</td><td>Agilent</td><td>5067-1511</td><td>Dag 2: Bioanalyzer analyse</td></tr><tr><td>RNaseZAP</td><td>Ambion</td><td>AM8782</td><td>Dag 2: Bioanalyzer analyse</td></tr><tr><td>Ethanol >99%</td><td>Sigma</td><td>E7023-500ml</td><td></td></tr><tr><td>Isopropanol >99%&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>I9516-500ml</td><td></td></tr><tr><td>Nuclease-free ultra pure water&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>9938</td><td></td></tr><tr><td>Pipet tips (nuclease-free)</td><td>Eppendorf</td><td>22491253</td><td></td></tr><tr><td>Pipetter (serological)</td><td>Eppendorf</td><td>2223020-4</td><td></td></tr><tr><td>Pipetters (for volumes under 1&nbsp;ml)</td><td>Eppendorf</td><td>3120000-054</td><td></td></tr><tr><td>Pipettes (serological)</td><td>Fisher</td><td>13-678-27E</td><td></td></tr><tr><td>Controlled rate freezing containers</td><td>Nalgene</td><td>5100-0001</td><td></td></tr><tr><td>Cryoboxes (to hold 2&nbsp;ml and 5&nbsp;ml cryovials and 1.5&nbsp;ml microcentrifuge tubes)</td><td>Fisher</td><td>03-395-464</td><td></td></tr><tr><td>Test tube rack</td><td>Thermo Scientific</td><td>14-804-134</td><td></td></tr><tr><td>15&nbsp;ml polypropyleenbuizen</td><td>Fisher</td><td>14-959-49D</td><td></td></tr><tr><td>1.5&nbsp;ml en 0.65 microcentrifuge tubes</td><td>Fisher</td><td>07-200-534 en 07-200-185</td><td></td></tr><tr><td>2&nbsp;ml en 5&nbsp;ml cryovials</td><td>Fisher</td><td>10-500-26 en 10-269-88F&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>8&nbsp;ml CPT vacutainer</td><td>BD Biosciences</td><td>362761</td><td>2 buizen</td></tr><tr><td>6&nbsp;ml K2 EDTA vacutainer</td><td>BD Biosciences</td><td>367863</td><td>2 buizen</td></tr><tr><td>8.5&nbsp;ml SST vacutainer</td><td>BD Biosciences</td><td>367988</td><td>1 buis</td></tr><tr><td>Vortexer</td><td>Fisher</td><td>2215365</td><td></td></tr><tr><td>Dry bath incubator with heating block voor microcentrifuge buizen</td><td>Fisher</td><td>11-715-1250</td><td></td></tr><tr><td>Filtratievacuümsysteem voor gebruik binnen de celcultuur kap</td><td>Fisher</td><td>01-257-87</td><td></td></tr><tr><td>Fixed-angle rotor voor microcentrifuge buizen met aerosol-tight deksel</td><td>Eppendorf</td><td>22637002</td><td></td></tr><tr><td>Gekoelde centrifuge met een swing-bucket rotor en aerosol-tight caps voor 16 x 125&nbsp;mm vacutainers en 15&nbsp;ml polypropyleen buizen</td><td>Eppendorf</td><td>22628157</td><td>2, één hoeft niet gekoeld te worden</td></tr><tr><td>Nanodrop 2000 (aanbevolen voor nauwkeurigheid van kleine volumes) of ander spectrofotometrisch apparaat</td><td>Fisher</td><td>13-400-411</td><td></td></tr><tr><td>Agilent Bioanalyzer</td><td>Agilent Technologies</td><td>G2940CA</td><td></td></tr><tr><td>Vloeibare stikstoftank</td><td>Thermo Scientific</td><td>11-676-56</td><td></td></tr><tr><td>Sharps container</td><td>Fisher</td><td>22-037-970</td><td></td></tr><tr><td>Biologische afval container</td><td>Thermo Scientific</td><td>1223P52</td><td></td></tr><tr><td>Biosafety Level 2&nbsp; gecertificeerde celcultuur kap</td><td>Thermo Scientific</td><td>13-261-315</td><td></td></tr></tbody></table>

snelle fractionering en isolatie van volbloed componenten in monsters verkregen van een communautair gevestigde instelling

Rapid Fractionation and Isolation of Whole Blood Components in Samples Obtained from a Community-based Setting

Verzameling en verwerking van hele bloedmonsters in een niet-klinische omgeving biedt een unieke kans om te evalueren thuiswonende mensen met en zonder reeds bestaande voorwaarden. Snelle verwerking van deze monsters is essentieel voor de afbraak van belangrijke cellulaire componenten voorkomen. Hier opgenomen zijn methoden voor het gelijktijdig perifere bloed mononucleaire cellen (PBMC), DNA, RNA en serum isolatie van een enkel bloed trekken uitgevoerd in de huizen van toestemming deelnemers over een grootstedelijk gebied, met verwerking begonnen binnen 2 uur van de collectie. We hebben deze technieken gebruikt worden om meer dan 1.600 bloedmonsters waardoor consistente, hoogwaardige materialen, die vervolgens werd gebruikt in succesvolle DNA-methylatie, genotypering, genexpressie en flowcytometrie analyseert verwerken. Enkele methoden zijn standaard; echter, in combinatie op de beschreven wijze, zij stellen efficiënte verwerking van monsters van deelnemers populatie- en / of community-op basis van studies die normaal niet in een klinische setting worden geëvalueerd. Daarom heeft dit protocol heeft het potentieel om monsters (en vervolgens data) die meer representatief zijn voor de algemene bevolking te verkrijgen.

Het is essentieel dat de totale procedure van hoge kwaliteit materiaal voor analyse in een veelvoud van stroomafwaartse toepassingen, waaronder genexpressie via microarray en RT-PCR-analyse, detectie van epigenetische veranderingen en cel subreeks varianten. Tabel 1 geeft de gemiddelde opbrengst en kwaliteit van materialen van elk van de processen. Figuur 3 geeft een voorbeeld van de uitvoer kwaliteit van de leukocyten RNA isolatie en filter verwerkingsmethoden. Het beeld in de linkerbo...

We schetsen een methodologie voor de verwerking van volbloed om een verscheidenheid aan componenten te verkrijgen voor verdere analyse. We hebben een gestroomlijnd protocol geoptimaliseerd dat snelle, hoogwaardige, gelijktijdige verwerking van volbloedmonsters in een niet-klinische omgeving mogelijk maakt.

Snelle Fractionering en isolatie van volbloed componenten in monsters verkregen van een communautair gevestigde instelling

Collection and processing of whole blood samples in a non-clinical setting offers a unique opportunity to evaluate community-dwelling individuals both ...

Het algemene doel van deze procedure is om een gestroomlijnd protocol te bieden dat snel oogdoorvoer mogelijk maakt, gelijktijdige verwerking van volbloedmonsters. In een niet-klinische omgeving wordt de verwerking van vacutainers op een overlappende manier uitgevoerd om efficiënte isolatie van hoge kwaliteit fracties van D-N-A-R-N-A perifere bloed mononucleaire cellen of PBMC serum en restfracties van plasma en rode bloedcellen mogelijk te maken. De verwerking begint met centrifugatie van de serum vacutainer, verwijdering van een aliquot uit één fial bevattende vacutainer voor DNA-isolatie, centrifugatie van de fialbuisjes.Vervolgens kan na voltooiing van de DNA-isolatie, na DNA-isolatie leukocytenafgeleide RNA-isolatie uit de K twee EDTA vacutainer plaatsvinden. Het bloed uit elke vacutainer wordt door een respectieve filter gevoerd en gewassen met PBS, vervolgens behandeld met een RNA-stabilisatiemiddel en teruggevoerd naar de fial bevattende vacutainer. Het resterende plasma wordt afgezogen en de mononucleaire laag wordt gewassen met PBS.Terwijl de buisjes draaien, worden de resterende rode bloedcellen verzameld en wordt het gescheiden serum gealiquoteerd. Ten slotte worden PBMC bewaard in celbevriezingsmedium. Uiteindelijk kunnen hoge kwaliteit fracties van vers bloed binnen twee uur na verzameling worden geproduceerd en kunnen alle voor bemonstering klaar zijnde specimens binnen twee dagen beschikbaar zijn.Het belangrijkste voordeel van deze techniek boven bestaande methoden is dat de procedures gelijktijdig in een niet-klinische omgeving kunnen worden uitgevoerd, waardoor uitgangsmateriaal binnen twee dagen wordt geproduceerd voor een veelvoud aan downstream toepassingen, inclusief microarray epigenetische real-time R-T-P-C-R en flowcytometrie analyses. De procedure zal worden gedemonstreerd door Amy Weckl, mijn laboratoriummanager. Om te beginnen met de verwerking van volbloedmonsters. Zorg ervoor dat de buffers, centrifuge en hitteblok allemaal zijn voorbereid.Documenteer de tijd van de vacutainerlevering op de monstertraceringssheet. Na ontvangst van de monsters, documenteer de serumisolatie. Starttijd op het monsterlogboek en begin onmiddellijk met verwerken door de zeven milliliter serumvacutainer te centrifugeren met de rem en versnelling uit.Gebruik een zwenkrotor met aërosolcaps gedurende 20 minuten bij 1300 GS vier graden Celsius terwijl de serumvacutainer wordt gecentrifugeerd. Documenteer de starttijd van de DNA-isolatie in een BSL twee cellencultuur kap. Draai de vacucontainers met het fialgel vijf keer om en voeg 200 microliters volbloed toe vanaf de bovenkant van een van de vacutainers in elk van de twee 20 microliter aliquots van protease.Laat de protease en bloed microcentrifugebuisjes in de kap en ga verder met de centrifugatie van de call bevattende vacucontainers. Documenteer de PBMC-isolatiestarttijd, die binnen twee uur na het afnemen van het bloed moet zijn.Draai de FI call bevattende vacucontainers die al in de aërosoldichte containers zijn acht tot tien keer om. Centrifugeer vervolgens de vacutainer met de rem en versnelling uit gedurende 30 minuten bij 1600 GS 22 graden Celsius. Keer terug naar de DNA-isolatie monsters in de kap en voeg 200 microliters buffer al toe aan elk van de protease en bloed microcentrifugebuisjes.Deksel de buisjes af en verwijder ze uit de kap. Vortex ze vervolgens gedurende 15 seconden. Na het vortexen, draai de monsters onmiddellijk snel rond.Ga door met DNA-isolatie zoals beschreven in het bijbehorende tekstprotocol totdat de DNA uit de kolom wordt geëlueerd bij Ellucian. Pool de DNA van de twee kolommen per deelnemer voor een totale opbrengst van 800 microliters per deelnemer. Documenteer de starttijd van leukocyte RNA-isolatie.Doorboor het rubberen septum van de K twee EDTA vacutainer met een overdrachtsspits. Bewaar de mantel en schroefdop voor later gebruik na montage van het K twee EDTA buisjessysteem. Gebruik het uiteinde van een metalen spatel om de naald veilig los te maken en steek de naald in een lege 10 milliliter geëvacueerde bloedopnamebuis.Draai de K twee EDTA vacutainer filterontvangersbuisassemblage om de installatie te voltooien Na filtratie en een PBS-was, trek drie milliliter van het RNA-stabilisatiemiddel aan met een nieuwe 10 milliliter spuit. Spoel de filter en zorg ervoor dat het RNA-stabilisatiemiddel is bevestigd. Trek vervolgens de spuit van de filter af zonder de plunjer terug te trekken.Versluit de filterinlaat en -uitlaat met de mantel en schroefdop die van de overdrachtsspits zijn behouden en laat de filter verzadigd met het RNA-stabilisatiemiddel. Bewaar de filter op min 80 graden Celsius gedurende ten minste twee uur totdat de tijd het toelaat om de RA-isolatie te voltooien. Zodra de vacutainer is teruggekeerd naar de BSL twee kap, verwijder de stopper en gebruik een serologische pijp om 1,5 milliliter van de bovenste plasmalaag te trekken zonder dicht bij de mononucleaire laag te komen.Breng het plasma van de twee vacutainer over naar een vijf milliliter cryo vial. Log vervolgens het verzamelde volume. Breng het resterende plasma en de mononucleaire laag over naar een 15 milliliter conische buis met behulp van een serologische pijp.Voeg vervolgens genoeg eerder bereid een XPBS toe om het totale volume in de conische buis op te brengen tot 15 milliliter. Deksel de buis af en draai hem vijf keer om. Centrifugeer vervolgens de buis met de rem en versnelling uit gedurende 15 minuten bij 300 GS 22 graden Celsius.Keer terug naar de fial bevattende vacucontainers in de kap en verzamel de rode bloedcellen of RBC's. Gebruik een vijf en drie kwart inch pastierpijp om rond te draaien en de buitenkant van de fialgellaag los te maken en verwijder hem. Gebruik een serologische pijp om de RBC's te verzamelen en over te brengen naar een vijf milliliter cryo vial.Log vervolgens het volume. Breng vervolgens de plasma- en RBC-cryo vijlen over naar een container voor bevriezing met gecontroleerde snelheid en bewaar ze op min 80 graden Celsius gedurende ten minste 24 uur. Na 24 uur, breng de monsters over naar een cryo box en plaats ze terug op min 80 graden Celsius voor langdurige opslag.

rapid-fractionation-isolation-whole-blood-components-samples-obtained

Research

JoVE Journal

Medicine

Geneeskunde

Source:Sathish Muthu1,2,31Orthopaedic Research Group, Coimbatore.2Department of Biotechnology, Faculty of Engineering, Karpagam Academy of Higher Education.3Department of Orthopaedics, Government Medical College.This video demonstrates the preparation of high-quality Platelet-Rich Plasma (PRP) by screening for platelet count, collecting and centrifuging blood, and isolating platelets. This PRP is used in therapeutic applications for tissue regeneration and healing.

Preparation of Platelet-Rich Plasma from Human Peripheral Blood

Bloed leukocyten en bloedplaatjes kunnen worden gebruikt als een marker van algemene bio-energetische gezondheid van een individu en dus de potentie om pathologische processen en het effect van behandeling te controleren. Hier beschrijven we een werkwijze voor het isoleren en meten mitochondriale functie en de oxidatieve uitbarsting in deze cellen.

Bio-energetica en de oxidatieve Burst: Protocollen voor de Isolatie en evaluatie van menselijke leukocyten en bloedplaatjes

Leucocyt-Plaatjerijk Fibrine (L-PRF) vertegenwoordigt een door de FDA goedgekeurde bereiding van autologe bloedplaatjesconcentraten die een unieke fibrine-architectuur, verrijkte bloedplaatjes en overvloedige groeifactoren bezit. Hier presenteren we een protocol voor de generatie van L-PRF aan de patiëntkant, evenals evalueren we zijn mechanische eigenschappen, inclusief uniaxiale testen en hechtingssterktetesten.

Karakterisering van Leukocyte bloedplaatjes Rich fibrine, A Novel Biomateriaal

Endotheliale voorlopercellen (EPC's) zijn cruciaal betrokken zijn bij de vorming van nieuwe bloedvaten van ischemische weefsels. Deze werkwijze beschrijft de isolatie van humane EPC uit perifeer bloed, maar ook de identificatie van het trekkende bieden tegen sera van patiënten die hartchirurgie ondergaan.

Isolatie van endotheliale cellen van gezonde vrijwilligers en hun trekkende Potential Beïnvloed door Serum monsters na Hartchirurgie

Hier presenteren we een protocol om te isoleren van het plasmamembraan, cytoplasma en mitochondria van U937 cellen zonder het gebruik van high-speed centrifugeren. Deze techniek kan worden gebruikt voor het zuiveren van subcellular breuken voor latere onderzoek van eiwit lokalisatie via immunoblotting.

Cel fractionering van U937 cellen in het ontbreken van snelle centrifugeren

Dit protocol beschrijft klinisch implementeerbare bereiding van hoogwaardige PBMC- en plasmabioamples op de klinische proeflocatie die kunnen worden gebruikt voor translationele biomarkeranalyse.

Voorbereiding van perifere bloedmononucleaire celkorrels en plasma uit een enkele bloedafname op klinische proeflocaties voor biomarkeranalyse

We presenteren een eenvoudig protocol voor de isolatie van perifere mononucleaire bloedcellen uit volbloed verkregen van patiënten met de diagnose Sézary-syndroom, gevolgd door selectie van CD4 + T-cellen, hun stimulatie met phorbol12-myristate13-acetaat en A23187 ionofoor, en voorbereiding van RNA voor transcriptomische profilering.

Isoleren van menselijke perifere bloedmonucleaire cellen en CD4 + T-cellen van patiënten met het Sézary-syndroom voor transcriptomische profilering

Dit protocol beschrijft een methode voor de isolatie van neutrofielen uit volbloed, buffy coats of leukaferesemembranen, het bereiken van een goede opbrengst, hoge zuiverheid en minimale celactivering. We maken gebruik van gradiëntzuivering, rode bloedcel (RBC) sedimentatie en RBC-lysis om een hoogwaardig / zuiver neutrofielenpreparaat te verkrijgen.

Isolatie van menselijke neutrofielen van volbloed en buffy jassen

De vloeibare biopsie heeft een revolutie teweeggebracht in onze benadering van oncologische translationele studies, waarbij monsterverzameling, kwaliteit en opslag cruciale stappen zijn voor de succesvolle klinische toepassing ervan. Hier beschrijven we een gestandaardiseerd en gevalideerd protocol voor downstream circulerende DNA-toepassingen die in de meeste translationele onderzoekslaboratoria kunnen worden toegepast.

Een gestandaardiseerd preanalytisch protocol voor vloeibare biopsie voor downstream circulerende DNA-toepassingen

Dit protocol beschrijft een high-throughput automatisering-compatibele methode om menselijke perifere bloed mononucleaire cellen te isoleren voor biobanking en andere doeleinden.

Het isoleren van Menselijke Perifere Bloed Mononucleaire Cellen van Buffy Coats via de Scheiding van de Hoge Doorvoer Immunomagnetische Parel

Leer een gestroomlijnde methode voor snelle fractieëring van volbloedcomponenten zoals DNA, RNA, plasma en PBMC's. Dit protocol verbetert de efficiëntie van hoogwaardige celisolatie in niet-klinische settings.

Snelle Fractionering en isolatie van volbloed componenten in monsters verkregen van een communautair gevestigde instelling

Meer video's verkennen