Candida albicans biofilme Desenvolvimento on Foreign Bodies medicamente relevantes numa subcutânea modelo do rato Seguido por bioluminescência Imagem

O objetivo geral do experimento a seguir é validar o uso de uma cepa que expressa luciferase para o monitoramento não invasivo da formação de biofilme in vivo por células de candida albican. Isso é conseguido implantando fragmentos de cateter colonizados com uma cepa de candida albicans que expressa luciferase nas costas de um camundongo. Durante a segunda etapa, a levedura pode crescer em uma espessa camada de células embutidas em uma matriz extracelular, gerando um biofilme maduro no interior dos cateteres.

Em seguida, é adicionado um substrato que será convertido pela enzima luciferase. Esta reação produz luz mensurável A imagem bioluminescente ou BLI é então usada para registrar e quantificar a formação do biofilme dentro do hospedeiro vivo. A principal vantagem desta técnica sobre outras técnicas existentes, como o sistema central de Venmo, é que podemos testar até seis biofilmes dentro de um animal, reduzindo assim o número de animais que precisamos para análise estatística.

As implicações desta técnica se estendem à terapia da formação de biofilme de candida albicans, pois nosso método permite o teste fácil de componentes antifúngicos existentes e novos. Além disso, este método pode fornecer informações sobre candida albicans, biofilmes fúngicos. Também pode ser aplicado a outros micróbios, como bactérias ou outras espécies divertidas.

Os procedimentos propostos são de fácil implementação em qualquer laboratório que tenha acesso a um biotério 24 horas antes do procedimento cirúrgico abrir a embalagem contendo os cateteres de triplo lúmen dentro de uma cabine de segurança biológica. Use uma pinça estéril para remover todas as partes desnecessárias e um bisturi estéril para cortar a parte presa ao cateter. Em seguida, coloque uma régua sob a embalagem plástica e corte o cateter de poliuretano em pedaços de um centímetro de comprimento.

Em seguida, encha cada cateter com aproximadamente 1,8 mililitros de soro bovino 100% fetal e incube os pedaços a 37 graus Celsius durante a noite. Na manhã seguinte, transfira cada peça de cateter revestida com soro para tubos de microcentrífuga individuais de 1,5 mililitro e raspe os albicans de C albicans da placa A YPD em um mililitro de PBS em um tubo de microcentrífuga separado em uma diluição de um a 100. Após a contagem, diluir a suspensão celular até uma concentração final de cinco vezes 10 elevado ao quarto de células por mililitro.

E adicione um mililitro de células a cada uma das peças do cateter revestido de soro. Deixe as células aderirem aos cateteres por 90 minutos a 37 graus Celsius. Em seguida, segurando os tubos na posição vertical com pinças estéreis.

Lave suavemente cada peça através do lúmen duas vezes com um mililitro de PBS para colocar os cateteres. Comece raspando a parte inferior das costas de uma fêmea de oito semanas de idade Em seguida, desinfete a pele e faça uma pequena incisão de 0,5 a um centímetro em cada lado do animal.

Em seguida, disseque o subcu com uma tesoura para criar dois túneis subcutâneos com cerca de 1,5 centímetros de comprimento e um centímetro de largura. Insira três peças de cateter em cada túnel, certificando-se de que as peças fiquem próximas umas das outras em um arranjo horizontal sem sobreposição. Feche as incisões com suturas e limpe as feridas com muito cuidado com um desinfetante.

Em seguida, aplique um anestésico local diretamente nas incisões e administre um agente reversor de anestesia monitorando os animais até que estejam totalmente recuperados. Para obter imagens da formação de biofilme no momento experimental apropriado, injete 100 microlitros de bobina recém-preparada e terezin por via subcutânea em cada área que contém os cateteres em um animal anestesiado. Em seguida, adquira varreduras consecutivas com tempos de aquisição variando de 20 a 60 segundos até que a intensidade máxima do sinal seja atingida.

Durante a aquisição do próximo quadro, coloque uma região de interesse sobre cada trio de cateteres para medir a imagem bioluminescente ou a intensidade do sinal BLI dos quadros previamente adquiridos. Coloque uma região retangular de interesse de tamanho fixo em uma região de controle também para medir o sinal de fundo no software de imagem viva. Meça o fluxo de fótons através das regiões de interesse para cada trio de cateteres, bem como para o fundo.

Depois de repetir essas medições para cada animal e em diferentes momentos durante a formação do biofilme, a intensidade do sinal BLI de cada trio de cateter como fluxo de fótons por segundo. Os dados podem ser copiados e colados diretamente em um programa de planilha. No final do experimento longitudinal, sacrifique cada animal cortado no tecido subcutâneo e use uma pinça estéril para remover os fragmentos do cateter um por um.

Lave os cateteres duas vezes em um mililitro de PBS, conforme demonstrado. Em seguida, sonicar as peças em um novo tubo de microcentrífuga em um mililitro de PBS fresco a 40.000 hertz em banho-maria. Sonicar após 10 minutos, colocar os tubos contendo os cateteres no gelo e colocar 100 microlitros das amostras originais em diluições de um a 10 e de um a 100 em placas de ágar YPD.

Em duplicado. Finalmente, plote a média e o desvio padrão das unidades formadoras de colônias. E sinal BLI para cada animal em escala logarítmica.

Nesta imagem, um animal representativo exibindo o sinal de bioluminescência junto com uma região de interesse denotada seis dias após o desenvolvimento do biofilme é mostrado. Observe a falta de sinalização na área de fundo de controle, confirmando a limitação do biofilme às áreas imediatamente adjacentes aos cateteres revestidos com cândida. Neste experimento representativo, um sinal claro de BLI produzido pela luciferase expressando biofilmes pode ser observado, enquanto apenas o sinal de fundo parece ser produzido pela cepa do tipo selvagem.

Esse aumento no sinal segue a mesma tendência que o aumento nas unidades formadoras de colônias por biofilme e as medições de fluxo de fótons para cada grupo de animais juntos. Esses dados ilustram que o BLI é uma técnica poderosa para monitorar e quantificar in vivo a formação de biofilme de C albicans maduros em um modelo de camundongo subcutâneo. Uma vez dominado, a infecção de dispositivos com células de candida pode levar duas horas, enquanto o implante do cateter pode ser feito em 10 minutos por camundongo.

A imagem BLI pode ser realizada em cinco minutos por camundongo. A grande vantagem de usar o BLI é que você pode monitorar o desenvolvimento de biomassa e biofilme repetidamente no mesmo animal. Com o tempo Após este procedimento, outros métodos, como ressonância magnética ou tomografia computadorizada, podem fornecer informações sobre a posição exata da catedral.

Essas informações podem ser usadas para quantificação em modelos mais complexos, como o modelo Cathedral de veios profundos. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma compreensão muito boa de como realizar biofilme subcutâneo in vivo, ss em camundongos, e isso pode formar a base para uma análise mais aprofundada das interações do patógeno hospedeiro.