3次元細胞培養モデルの質量分析イメージング用試料調製の戦略

この手順の全体的な目標は、3次元細胞培養を調製し、質量分析イメージングによる分析を行うことです。これは、最初に3次元細胞培養を構築し、それらを目的のサイズに成長させることによって達成されます。2番目のステップは、3次元細胞培養物を回収してゼラチンに埋め込むことです。

次に、3次元細胞培養物をクライオスタットを用いてマイナス30°Cでスライスし、導電性スライドにマウントします。最後のステップは、Maldi MSI装置を使用してスライスを分析し、検出された分子の分析を実行することです。最終的に、質量分析イメージングは、3次元細胞培養全体にわたる多くの異なる生体分子クラスの分析物の分布の変化を示すために使用されます。

顕微鏡法やオートX線撮影などの既存の質量と比較した場合のこの手法の主な利点は、質量分析イメージングにより、タンパク質、脂質薬物などの複数の分析の検出と局在化が可能になり、アンチラベリングなしで1回の実験で代謝できることです。この手順を実演するのは、Dorothy Alf Wheat craft、私自身、ポスドク、およびHamman研究室の大学院生Shin Liですこの手順を開始する前に、HCT one 16結腸癌細胞株などの適切な細胞株を2次元単層培養で培養します。これに続いて、0.19ミリリットルのアロスを50ミリリットルのコニカルチューブ内の10ミリリットルの標準メディアに追加します。

穏やかに混合して確実に組み込む後、マルチピペット吸引器を使用して、水浴でアグロスをオートクレーブします。50マイクロリットルのアグロス培地混合物を、平底の96ウェル培養プレートの60の中央ウェルに注入します。プレートの周辺端にあるウェルは、これらのエッジへのアロスの代わりに1 x リン酸緩衝生理食塩水の200マイクロリットルでわずかに高い蒸発速度を示します。

aros混合物をインナーウェルに添加したら、プレートを脇に置いて約37°Cに冷却してから細胞を添加します。この時点で、アロス被覆した96ウェルプレートに適切な細胞溶液の200マイクロリットルでプレートを覆い、細胞増殖のために細胞CSを37°Cで5%二酸化炭素で加湿インキュベーターにセットします。インキュベーション後、アロスの底にある小さな三次元細胞培養の周りから古い培地を慎重に吸引することにより、培地を交換します。

次に、200マイクロリットルの新鮮な培地を3次元細胞培養の上に穏やかに加えます。高純度水にゼラチン1ミリリットルあたり約175ミリグラムの溶液を調製します。溶液が粘性があり、操作が困難になった後、ゼラチンを激しく混合します。

チューブを摂氏約60度の温めた水浴に入れ、溶液が透明で吸引しやすくなるまで温めます。2ミリリットルの血清ピペット堆積物を使用して、0.6ミリリットルの温かいゼラチン溶液を24ウェル平底プレートのウェルに入れます。洗浄した3次元細胞培養物を別の2ミリリットルピペットを使用してゼラチン層のすぐ上に置き、3次元構造の破裂を防ぎます。

細胞培養物をゼラチン層の表面に置いた後、それらの位置に支障をきたさないように、温かいゼラチン混合物をさらに0.6ミリリットル慎重にピペットで移します。このフリーズの後。ゼラチンは、摂氏マイナス80度で3次元細胞培養を埋め込みました。

細胞培養物を含む24ウェルプレートを冷凍庫から取り出したら、ピンセットがウェルの側面にゆっくりと滑り落ちるまで、プレートの底を手で温めます。次にスムーズに。ピンセットをディスクの周りにスライドさせ、中心を解凍せずにゼラチンを解放します。

クライオスタットサポートに水を一滴加え、ゼラチンディスクをサポートに接着します。その後、クライオスタットに入れて凍結します。余分なゼラチンをオフにして3次元細胞培養物を露出させた後、12〜16マイクロメートルの切片で滑らかな動きでゆっくりとスライスします。

スライスが解凍されたら、酸化インジウムチタンコーティングされたスライドガラスに取り付けます。スライドを標識した後、無傷のタンパク質を検出するために乾燥剤で保存します。スライスを冷たいアセトンで洗浄して、シグナルを隠す可能性のある脂質などの小分子を取り除きます。

0.1%トリクロロ酢酸を含む有機溶媒と水の溶液でマトリックスを調製します。先端の細いシリンジを使用して、0.5マイクロリットルのマトリックス溶液を三次元細胞培養スライスに塗布します。マトリックスを結晶化させた後、スライドを乾燥剤で乾燥させてからMaldi MSIに少なくとも30分間乾燥させます。

この解析では、75 mm x 25 mmのスライドをしっかりと保持するように作られたアダプターにスライドをはめ込み、3 次元細胞培養スライスを画像化します。次に、スライドアダプターを機器にロードします。適切なデータ取得方法を開発した後、101, 000 マスター電荷比とタンパク質の質量範囲を 101, 000 マスター電荷比の間で、タンパク質の質量範囲を調整します。

これに続いて、キャリブレーション溶液と近くの犠牲的三次元細胞培養スライスを使用して、レーザー出力周波数のレーザーショット数とスポットサイズを調整します。この方法は、装置メーカーが提供するイメージングソフトウェアで使用するために保存してください。前述のように、選択した質量範囲のタンパク質データ取得法を開発します。

次に、イメージングソフトウェアを使用して特定のMS装置パラメータを設定します。装置のパラメータを選択し、装置制御方法の位置を設定した後、3D細胞培養をどこでスキャンするか。次に、サンプル上の適切なティーチングポイントを3つ選択し、それぞれにレーザーを移動します。

次に、印刷画面を使用して、maldi TOFレーザー制御ソフトウェアから光学写真を取得します。次に、イメージングソフトウェアからイメージングプロセスを開始し、ターゲット分析のために各スライスから質量スペクトルを取得します。スペクトルの手動解析を実行するには、平均スペクトルの質量をクリックします。

最後に、抽出したデータセットを数学ソフトウェアで統計分析します。質量分析イメージングは、三次元細胞培養における多くの異なる分子分布を明らかにする可能性を秘めています。前述の方法を使用して、低分子から大きなタンパク質までの種を培養全体で追跡できます。

このビデオを見れば、質量分析イメージングによる3次元細胞培養の調製、スライス、分析の方法について十分に理解できるはずです。