إعداد وتوصيف SDF-1α-الشيتوزان-ديكستران سلفات النانوية

الهدف العام من التجربة التالية هو تحضير وتوصيف جسيمات SD F1 Alpha Chias وجسيمات دكستران سلفات النانوية. يتم تحقيق تحضير الجسيمات النانوية أولاً عن طريق خلط عامل توجيه الخلايا الجذعية، وهو العامل المشتق من الخلايا السدوية 1 ألفا أو S df one alpha، مع دكستران سلفات للسماح بالارتباط بالغليكان سالِب الشحنة. وفي الخطوة الثانية، يُضاف أوزان، وهو غليكان موجَب الشحنة، إلى الخليط لتكوين معقد بولي إلكتروليت مع دكستران سلفات.

بعد ذلك، يُضاف كبريتات الزنك من أجل تثبيت المعقدات بواسطة جسور الزنك. وتتميز الجسيمات الناتجة بنواة كثيفة محاطة بغلاف سالب الشحنة. ثم يتم قياس حجم الجسيمات وجهد زيتا، بالإضافة إلى محتوى ونشاط SDF-1α في الجسيمات النانوية. وتكمن الميزة الرئيسية لجسيمات SDF-1α الغليكانية النانوية في أن SDF-1α المدمج يظل نشطًا تمامًا دون أن يتحرر من الجسيمات.

وبناءً على ذلك، يمكن أن تكون هذه الجسيمات مفيدة للعمل كإشارة تتبع ثابتة في علاج الخلايا الجذعية. للبدء، قم بتحضير المحاليل القياسية كما هو موضح في البروتوكول النصي، وعقمها باستخدام أغشية ترشيح بمسامية 0.22 micron. قم بتقييم مستويات الإندوتوكسين في المحلول المحضر باستخدام مقايسة تخثر هلام خلية الأميبا.

تأكد من أن المستويات أقل من 0.06 وحدة إندوتوكسين لكل ملليلتر. بعد ذلك، أضف 0.18 ملليلتر من الماء عالي النقاء إلى قارورة زجاجية سعة 1.5 ملليلتر تحتوي على قضيب تحريك مغناطيسي. اضبط سرعة التحريك عند 800 RPM، ثم أضف 0.1 ملليلتر من دكستران سلفات بتركيز 1% وقم بالتحريك لمدة دقيقتين.

أضف 0.08 milligrams من SD F1 alpha وحرك المزيج لمدة 20 minutes. أضف 0.33 milliliters من 0.1%tizen قطرة تلو الأخرى وحرك المزيج لمدة five minutes. غيّر سرعة التحريك إلى الحد الأقصى وأضف ببطء 0.1 milliliters من كبريتات الزنك باستخدام حقنة محكمة الغلق.

أعد سرعة التقليب إلى 800 RPM واستمر في التقليب لمدة 30 دقيقة. ثم أضف 0.4 milliliters من mannitol بتركيز 15% وقلب لمدة خمس دقائق. انقل خليط التفاعل إلى أنبوب طرد مركزي سعة 1.5 milliliter وقم بإجراء الطرد المركزي عند 16, 000 Gs ودرجة حرارة أربع درجات Celsius لمدة 10 دقائق.

بعد عملية الطرد المركزي، يتم سحب السائل العلوي واستخدام ماصة لإزالة آخر قطرة من السائل. أضف ببطء 0.2 milliliters من mannitol بتركيز 5% وقم بتعليق الراسب باستخدام سرنجة بإبرة قياس 29 gauge وسعة 0.5 milliliter. ثم أضف 1 milliliter إضافي من mannitol بتركيز 5% قبل إجراء عملية الطرد المركزي.

ومرة ثانية عند 16,000 GS لمدة 15 دقيقة. بعد تكرار عملية طرد مركزي معلق Resus، يتم سحب السائل الطافي وإعادة تعليق الراسب في 0.2 milliliters من 5%mannitol. ويتم تحليل حجم الجسيمات وجهد زيتا بواسطة تشتت الضوء الديناميكي وتشتت الضوء الكهربائي على التوالي.

للبدء، اختر إجراء تشغيل من قائمة إجراءات التشغيل القياسية (SOP)، والتي تحتوي على المعلمات الخاصة بقياس حجم الجسيمات عن طريق تشتت الضوء الديناميكي. وكما ورد في البروتوكول المكتوب، قم بتخفيف عينة جسيمات SD F1 alpha بالماء. ثم ضع 100 µL من العينة في خلية UV Q Vet مخصصة للاستخدام مرة واحدة مثل Einor Q Vet.

أدخل عينة Q vet في حامل الخلية وانتظر حتى يصل ضبط الشدة إلى المستوى الأمثل قبل البدء في الحصول على البيانات. وبعد اكتمال القياس، سجل النتائج التراكمية للقطر ومؤشر تعدد التشتت. قم بحساب متوسط النتائج التي تم الحصول عليها من كل قراءة من القراءات الأربع المكررة، واحسب الانحراف المعياري لقياس جهد زيتا من خلال تشتت الضوء الكهربائي.

قم بتحميل 500 µL من عينة الجسيمات المخففة عشر مرات في خلية التدفق. اختر إجراء تشغيل من قائمة إجراءات التشغيل القياسية لجهد زيتا (Zeta potential SOP)، والتي تحتوي على معلمات القياس كما هي واردة في البروتوكول النصي. سجل نتائج جهد زيتا.

بعد ذلك، قم بحساب متوسط النتائج التي تم الحصول عليها من كل قراءة من القراءات الخمس المكررة واحسب الانحراف المعياري. قم بتسخين العينات المخففة من SD F1 alpha الحر والمرتبط بالجسيمات في محلول laly sample buffer عند 100 degrees Celsius لمدة 10 دقائق. قم برج العينات باستخدام جهاز الـ Vortex مرتين خلال فترة التسخين التي تستغرق 10 دقائق لضمان تفكك الجسيمات تماماً، وبعد تبريد العينات في درجة حرارة الغرفة لمدة دقيقتين، قم بإجراء عملية الطرد المركزي عند 10,000 Gs لمدة 0.5 إلى دقيقة واحدة لترسيب تكثيف الماء، ثم استخدم جهاز الـ Vortex مرة أخرى للمزج جيداً.

في هذه المرحلة، يجب أن يكون محلول العينة رائقاً مع عدم وجود أي راسب مرئي. بعد ذلك، يتم تحميل 10 µL من العينة في كل بئر في هلام SDS أو sodium ESAL sulfate بتركيز يتراوح من 4 إلى 20%. يتم إجراء الفصل الكهربائي عند 200 فولت لمدة 20 دقيقة قبل صبغ الهلام بصبغة البروتين kumasi blue.

افحص كثافة نطاق البروتين لـ SDF1 alpha باستخدام جهاز تصوير جزيئي وبرمجيات تحليل قياس الكثافة. احسب كمية SDF1 alpha في الجزيئات مقابل منحنى قياسي تم إنشاؤه باستخدام معايير SDF1 alpha الحرة لإجراء مقايسة التحرر في المختبر؛ اخلط جزيئات SDF1 alpha الغليكانية مع محلول DPBS (محلول ملحي منظم بالفوسفات خالي من الكالسيوم والمغنيسيوم) بنسبة واحد إلى واحد. وزّع معلق الجزيئات في أنابيب سعة 1.5 milliliter على شكل حصص مقدار كل منها 0.05 milliliter.

ضع العينات في قاع الأنابيب. تجنب إدخال فقاعات هواء أو تعكير سطح السائل. أحكم إغلاق الجزء العلوي من الأنابيب باستخدام البارافورم.

بعد ذلك، يتم تدوير الأنابيب عند 37 °C باستخدام خلاط أنابيب دقيقة دوار. تُؤخذ عينات من الأنابيب في الأوقات المحددة، وتُطرد العينات مركزياً على الفور عند 16,000 Gs لمدة 10 دقائق عند 4 °C. ثم يتم فصل السوائل الطافية عن الرواسب.

ثم أعد تشكيل الراسب باستخدام 0.05 milliliters من DPBS. وبعد جمع كافة العينات، افحص السوائل الطافية والترسبات باستخدام هلام SDS. وكما سبق، يقيس هذا المقايسة النشاط الكيميائي لجذب S df.

يؤدي تفاعل أحد جزيئات SD F1 alpha مع مستقبله إلى هجرة الخلية باتجاه تدرج SD F1 alpha. للبدء، قم بتخفيف SD F1 alpha في صورته الحرة أو المرتبطة بجسيمات باستخدام محلول منظم للهجرة (migration buffer) في سلسلة تخفيفات ثلاثية حتى الوصول إلى التركيزات النهائية المدرجة في البروتوكول النصي. أضف 0.6 milliliters من محلول SD F1 alpha المخفف إلى عين في طبق يحتوي على 24 عينًا ليكون بمثابة ضابط سلبي (negative control).

كرر العملية نفسها مع منظم الهجرة (migration buffer) فقط، ثم أضف 0.57 milliliters من منظم الهجرة إلى بئرها المخصص لعينة التحكم من الخلايا المدخلة (input cell control). قم بتحضين الطبق عند درجة حرارة 37 degrees Celsius لمدة 30 دقيقة. بعد ذلك، ضع غشاءً نفاذاً لزراعة الخلايا، مثل transwell، فوق البئر السفلية، ثم حمّل 0.1 milliliters من خلايا jerk hat في غشاء transwell.

بعد ذلك، قم بتحميل 0.03 milliliters من الخلايا مباشرة في بئر التحكم في خلايا الإدخال. قم بتحضين الطبق عند 37 °C لمدة ساعتين في حاضنة تحتوي على 5% carbon dioxide. بعد انتهاء التحضين، قم بإزالة أدراج زراعة الخلايا.

انقل الخلايا التي هاجرت إلى الآبار السفلية إلى أنبوب بوليسترين سعة 4 mL. قم بعد الخلايا المهاجرة باستخدام جهاز قياس التدفق الخلوي (flow cytometer). وأخيراً، احسب نسبة الهجرة كنسبة مئوية من عدد الخلايا المدخلة بعد طرح الأعداد الموجودة في الضوابط السلبية.

يظهر هنا تحليل قياس حجم جسيمات SD F1 alpha dextran sulfate ozan. وتوضح نتيجة CUMUL أن القطر الهيدروديناميكي للجسيم هو 671 nanometers وأن مؤشر التشتت المتعدد هو 0.24. وتظهر لقطة الشاشة هذه واحدة من خمس قياسات مكررة لجهد زيتا لجسيمات SD F1 alpha DExT strand sulfate ozan.

تبلغ قيمة جهد زيتا 24.7- مللي فولت. يتم تقدير كمية S df one alpha في جسيمات S df one alpha dextran sulfate ozan عن طريق الرحلان الكهربائي لهلام SDS. يظهر هنا هلام SDS مصبوغ بصبغة kumasi، مع تحميل معايير SD F1 alpha، وعينة تحكم من جسيمات dextran sulfate kaizan النانوية، وعينات من جسيمات SD F1 alpha dextran sulfate kaizan النانوية.

يتم إنشاء منحنى قياسي من تحليل كثافة نطاقات SDF-1ΰ القياسية، ويشير الحساب المستمد من المنحنى القياسي إلى أن تركيز SDF-1ΰ في عينة جسيمات SDF-1ΰ النانوية هو 0.03 mg/mL. ولتحديد معدل التحرر في المختبر لـ SDF-1ΰ من الجسيمات النانوية، تم تحديد كمية SDF-1ΰ المتحررة في المادة الطافية وكمية SDF-1ΰ المرتبطة بالجسيمات في الرواسب عن طريق صبغ Coomassie لهلام SDS متبوعاً بتحليل قياس الكثافة الضوئية. يتم قياس نشاط SDF-1ΰ المرتبط بالجسيمات بواسطة مقايسة الهجرة ومقارنته بنشاط SDF-1ΰ الحر كما هو موضح هنا.

حفز البروتين SDF one alpha المرتبط بالجسيمات نفس درجة الهجرة التي حفزها البروتين s DF one alpha الحر عند جميع التركيزات التي تم قياسها. وأثناء محاولة تنفيذ هذا الإجراء، من المهم تذكر أن تركيبة جسيمات البروتين الغليكانية يمكن تعديلها؛ فبناءً على التطبيق المحدد، يمكن دمج بروتينات أخرى واستخدام تركيبات مختلفة لتغيير حجم الجسيمات.

نأمل أن يكون هذا الفيديو قد استعرض التقنيات الأساسية في تحضير وجمع الجسيمات النانوية، ومن ثم التحليل الوظيفي لبروتين SDF one alpha المدمج.