Preparación de células adherentes, por Imágenes de fluorescencia de rayos X por Química Fijación

El objetivo general de este procedimiento es obtener imágenes de la distribución de los metales en una población de células. Esto se logra preparando primero ventanas estériles de nitruro de silicona y luego células en crecimiento en esas ventanas. A continuación, las células se fijan, se enjuagan hasta convertirlas en un tampón compatible y se secan.

El paso final es obtener una imagen de las celdas en la línea del haz. En última instancia, la microscopía de fluorescencia de rayos X se utiliza para mostrar la distribución de los metales en la célula. Por lo general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades ya que las ventanas son muy frágiles.

La demostración visual de este método es fundamental, ya que las células en crecimiento en las ventanas con una agregación celular mínima, así como los pasos de enjuague, son complicados porque las células no se adhieren bien a los sustratos fluorescentes de rayos X. La primera tarea es aislar la ventana. Primero, usando un estereoscopio, asegúrese de que un par de pinzas de punta fina inversa estén alineadas rectas y limpias.

A continuación, abra ligeramente la cápsula que contiene la ventana. Apriete un extremo que contiene la ventana mientras gira el otro extremo. No aprietes la ventana en sí.

A continuación, sujete con cuidado el marco con las pinzas mientras aprieta suavemente la cápsula cerca del extremo abierto. Aplique presión para ensanchar la cápsula donde deben salir los bordes de la ventana y retire la ventana. Ahora prepara un poco de cinta adhesiva.

Coloque un trozo de cinta adhesiva en un portaobjetos limpio y corte una tira de cinta de un cuarto de pulgada del lado largo del portaobjetos. A continuación, coloque una tirita de cinta adhesiva en el lado corto y retire la sección de cinta con las pinzas. Aplique la cinta adhesiva en el borde de la ventana con suficiente fuerza para adherirla y teniendo cuidado de no cubrir la abertura de la ventana con cinta adhesiva.

Con las pinzas, coloque la ventana en el fondo de un plato cultivado y presione la cinta firmemente contra el plato. Luego repita el proceso para pegar el otro lado de la ventana. El plato ahora debe esterilizarse con rayos UV durante una hora.

Este protocolo requiere que las células crezcan hasta un 50 a 70% de confluencia en placas que contengan la ventana adjunta. Cualquier tinción vital aplicada y las células deben ser fotografiadas antes de proceder con la fijación. Retire el medio mediante una aspiración suave, inclinando el plato en un ángulo de 45 grados.

A continuación, enjuague el plato suavemente con DPBS. Reemplace el líquido extraído inmediatamente agregando suavemente 4%P-F-A-P-B-S fresco en un ángulo de 45 grados y hacia el costado del plato. Relaje lentamente el ángulo para permitir que la solución fijadora cubra las ventanas.

Mantenga el fijador en las células durante 20 minutos después de la fijación. Retire el líquido mediante una aspiración suave. Usando la misma técnica suave que antes, reemplace suavemente el líquido con tuberías.

Solución de sacarosa. La técnica para eliminar y reemplazar el líquido es crítica porque las células no se adhieren bien a los sustratos. Aquí es donde muchos principiantes han tenido sus experimentos fallidos.

Luego, reemplace suavemente la solución de sacarosa para tuberías para lavar cualquier fijador residual. Ahora, retira la ventana con pinzas de la cinta. Si las ventanas se desprenden de la cinta, haga flotar la ventana hacia la superficie con la solución añadida y retírela con las pinzas inversas.

Ahora, sin tocar la ventana, rocíe a fondo cualquier solución desde el borde. Además, dobe el área dentada con un pliegue redondeado de tejido. El objetivo es tener la menor cristalización posible de sal o tampón en la ventana.

Por último, coloque con cuidado la ventana sobre la estera de rejilla apoyada en un borde contra la cumbrera de la estera. La ventana debe tocar la menor parte posible de la alfombra. Una vez seca la muestra, se verifica la presencia de células en las ventanas mediante un microscopio óptico.

Después de confirmar que las células están en las ventanas, empaque las ventanas para transportarlas a la línea de haz de sincrotrón. Pega suavemente las ventanas en dos bordes a un portaobjetos de vidrio. A continuación, pegue el portaobjetos de vidrio a una placa de Petri de plástico y cierre la placa de Petri con cinta adhesiva.

Hasta este punto, los pasos se pueden llevar a cabo en cualquier laboratorio típico, los siguientes pasos se harían mejor en una línea de luz de sincrotrón. El desembalaje de la ventana comienza con la retirada de la cinta adhesiva suavemente con unas pinzas. A continuación, la ventana se transfiere a un soporte de aluminio proporcionado por los colaboradores de la línea de luz en el sincrotrón.

Asegura la ventana con una capa delgada y uniforme de esmalte de uñas a lo largo de su borde. Ahora, inserte el soporte de aluminio en un soporte cinemático. Fije la montura a un soporte conectado a la platina motorizada que se encuentra dentro de la cámara de muestras y en la línea de luz del microscopio de rayos X.

Después de salir de la línea principal al área del instrumento del microscopio de rayos X, configure el escaneo utilizando un software específico de la línea de luz. Elija el área apropiada de la muestra para escanear mientras observa la posición del haz de rayos X en la muestra. Usando una cámara equipada con un pelo cruzado de video y prealineada con una cámara centelleadora descendente, se proporcionan detalles adicionales en el protocolo de texto.

Utilizando estas técnicas en las imágenes de rayos X de una muestra, es posible ver que hay variación en los elementos presentes, lo que indica que la fijación preserva estos aspectos de las células, como en el caso de esta célula humana HSY cinco Y. Sin embargo, si el tampón permanece presente durante el secado, la formación extensa de cristales crea daño estructural a las células e interfiere con la recolección de los espectros fluorescentes de rayos X. Esto se puede ver en una celda RET B 1 0 3 mal procesada.

Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo preparar una célula adherente mediante fijación química para imágenes de fluorescencia de rayos X. No olvide que trabajar con formaldehído y materiales biológicos puede ser extremadamente peligroso y siempre se deben tomar precauciones como el EPP adecuado y seguir las pautas institucionales al realizar este procedimiento.