一种简单快速的非酶法解离新鲜人体组织以分析浸润性淋巴细胞的方案

本实验的总体目标是通过非酶消化方法，快速将人体组织碎片匀浆化为单细胞悬液，用于定性和定量分析以及特定淋巴细胞亚群的分离。该过程首先使用无菌手术刀将组织碎片切割成小块，随后将组织匀浆转移至机械解离管中，在该管中进一步将组织碎片彻底匀浆化为单细胞悬液。

然后通过离心收集细胞，用于后续分析。最终，可利用流式细胞术分析浸润性淋巴细胞及其亚群，包括亚洲人群。我们实验室开发了这一技术，因为我们希望找到一种方法，能够在不显著影响肿瘤浸润淋巴细胞天然状态的情况下对其进行成像。

我们希望有一种方法能够快速分离细胞，并在手术过程中即时分析细胞状态。该技术已在我们实验室用于300多个乳腺肿瘤及正常组织样本，操作简便，可日常使用。该技术可用于检测预后标志物、治疗反应以及长期临床转归。

今天由我实验室的技术员 John Nicola Loic 演示该技术。首先称量组织样本，然后测量组织的长度、宽度和高度。接着将组织碎片转移至含有 1 mL 适当化学成分明确的无血清造血细胞培养基的小培养皿中，使用无菌手术刀将样本切成 1 至 2 平方毫米的小块。

接下来，将培养皿中的内容物转移至机械解离C管中，并用2毫升培养基冲洗培养皿和手术刀。将洗涤液加入C管中，随后连续运行两次0.01机械解离程序，轻柔地将组织碎片均质化为单细胞悬液。第二次循环结束后，将匀浆液通过40 µm细胞滤筛转移至50 mL锥形管中。

然后使用同一支移液枪，从冲洗培养皿后吸取C管中剩余的液体，并将其转移至细胞滤筛中。接着，使用一支1毫升的微量移液器将滤过的液体转移至15毫升锥形管中，并用额外的3毫升培养基冲洗C管。将此冲洗液通过细胞滤筛转移至50毫升管中。

然后用一个洁净的1毫升枪头轻轻搅动滤网上的未均质组织，将残留在组织中的尽可能多的液体挤入50毫升离心管中。接着，将细胞滤网倒置在原始的C管上方，用3毫升培养基冲洗滤网，使未均质的组织重新落入C管中。按照上述方法再进行两次组织再均质化，然后将第二次的均质液通过细胞滤网过滤。

再次用三毫升培养基冲洗C管。然后将上清液通过滤网过滤，并像之前演示的那样将残余液体从组织中挤出。此时，15毫升管中应含有约2.5毫升的单细胞悬液，50毫升管中应观察到约九毫升液体。

为将组织上清液与细胞分离，首先将两管匀浆液在室温下以600 ×g离心15分钟，然后将15毫升管中的上清液倾入1.5毫升管中，并置于4摄氏度保存，弃去50毫升管中的上清液。随后轻轻敲击每管底部于硬质表面，以充分分散细胞沉淀。用500微升培养基重悬50毫升管中的松散细胞沉淀，并将细胞转移至15毫升管中以重悬第二个细胞沉淀。

然后用另外500微升培养基冲洗50毫升离心管，并将洗涤液转移至15毫升离心管中，以最大程度回收细胞。通过台盼蓝排斥法计数活细胞数量后，离心收集细胞悬液。最后，离心保留的组织上清液。

然后小心地将上清液转移至至少一个干净的离心管中，注意不要接触或扰动沉淀，随后将其在负80摄氏度保存，用于后续分析。在这些图中，展示了经解离的肿瘤组织匀浆液在使用针对白细胞和上皮细胞标志物的特异性抗体标记后，具有代表性的流式细胞术散点图。本方案不会显著影响CD45阳性细胞的活力。

然而，EPAM阳性细胞的存活率有明显下降。尽管如此，仍可根据细胞大小和结构特征，将存活的EPAM阳性细胞和CD45阳性细胞亚群区分为大上皮样肿瘤细胞、小上皮样细胞，以及大或小的CD45阳性细胞。此处展示了主要肿瘤浸润细胞亚群的代表性流式细胞术散点图，其中淋巴细胞门控基于CD45阳性细胞的存活率进行设定。

最后，可以将乳腺癌上清液中的细胞因子表达或总免疫球蛋白水平与正常乳腺组织的上清液进行比较，正如本代表性实验所示，肿瘤组织相关的这两类蛋白质均有所增加。尽管该操作流程较为繁琐，但重要的是要牢记操作过程中应迅速、洁净，并在每一步骤中尽可能回收最多量的材料，以获得足够数量的细胞用于最终的分析。