鶏卵卵におけるインフルエンザウイルスの伝播

この手順の全体的な目的は、費用対効果の高いシステムを用いて、高タイターのインフルエンザウイルスを大量に調製することです。まず、血清病原体のない新鮮な受精鶏卵を用意します。次に、アラン頭頂路（Alan Toic root）を介して、卵にインフルエンザウイルスを接種します。

その後48時間後、ウイルスを含むAlan Toic液を回収し、ウイルスを液体窒素で急冷凍結させます。最終的に、プラークアッセイおよびヘマグルトニーションアッセイを行い、回収したAlan Toic液のウイルス力価の影響を判定することができます。回収工程は非常に繊細であり、卵の慎重な取り扱いと解剖学的構造に関する深い知識が求められるため、本手法の視覚的な実演が不可欠です。

手順を開始する前に、適切な販売業者から病原体フリーの新鮮な受精鶏卵を入手します。卵が届いたらすぐに、自動転卵機能付きの加湿卵孵化器に入れ、37 °C、湿度55〜60%の条件下で10〜11日間、定期的に転卵させながら保持します。孵化から7〜8日後、70%エタノールで消毒した手袋を着用し、

エッグキャンドラーをエタノールで拭き、卵をインキュベーターから空のエッグカートンに移します。次に、照明を消し、卵の太い方を一つずつキャンドラーに当てます。有精卵であれば、豆のような形の胚に向かう細い血管がはっきりと確認できるはずです。

卵が未受精の場合、卵黄と共に小さな血斑が観察されます。未受精卵は廃棄し、生存している卵をインキュベーターに戻します。卵の状態が確認できない場合は、受精後10日目または11日目の後日観察用に印を付けておきます。使用直前に、インフルエンザAウイルスストックを、HIPPSを添加した滅菌PBSを用いて1×10³〜10⁴ PFU/mLに希釈し、氷上に置きます。

その後、再度卵の検卵を行い、死んでいる不動の胚を除去します。次に、インキュベーターから3個の卵を取り出し、別のホルダーに配置します。気室を上に向けた状態で、油性マジックを用いて卵の気室部分に印を付けます。

次に、気室（エアスペース）より上の領域を70% ethanolで洗浄し、BSL 2のバイオセーフティキャビネット内で卵を気室が上になるようにエッグカートンに移します。次に、滅菌した18ゲージの針を使用して、各卵の気室上の殻に小さな穴を開けます。この際、胚や卵黄を突き刺さないよう、針を深く挿入しすぎないように注意してください。

次に、希釈したインフルエンザウイルスを滅菌済みの1 mLシリンジで吸い取ります。22ゲージの針を取り付け、1個目の卵の尿膜腔に45度の角度で慎重に針を刺します。希釈したウイルス0.2 mLを卵内に注入し、残り2個の卵にも同様に注入した後、シリンジと針を廃棄し、グルーガンを用いて各注入穴を接着剤の一滴で封止します。

接着剤が卵の内部に漏れないように注意し、卵をインキュベーターに戻します。すべての卵に接種し終えた後、感染させた卵を37°C、湿度60%で、転卵せずに最適な期間インキュベートします。インキュベーション期間は、インフルエンザウイルスの型によって異なります。

インキュベーション期間の終了後、胚を死滅させ、血管を収縮させるため、卵を4 °Cで最低4時間冷却します。卵が十分に冷却されたら、バイオセーフティフード内の固定ホルダーに移し、卵の表面を70% ethanolで洗浄します。

次に、滅菌したハサミを使用して、1つ目の卵の気室上の卵殻を開きます。気室周囲の殻を取り除きます。この際、絨毛膜を傷つけないように注意してください。

次に、滅菌した鈍端鉗子を用いて絨毛膜を開き、小さなスパチュラまたはスプーンで胚と卵黄嚢を慎重に脇に寄せます。この際、卵黄を破裂させないように注意してください。次に、1 mLのピペットを使用して、必要に応じて卵を横に傾けながら、可能な限り多くの羊水を注意深く回収します。各卵の採取により、5〜10 mLのわずかに黄色味を帯びた液体が得られるはずです。

アランチック液を氷上の50 milliliterプラスチック製コニカルチューブに回収します。すべての液を回収後、遠心分離してウイルスを沈殿させ、上清を氷上の新しい50 milliliterチューブに移します。最後に、卵をBSL 2廃棄物容器に廃棄し、速やかに精製アランチック液を分注します。

その後、液体窒素でウイルスを急速凍結し、凍結したストックを-80°Cのフリーザーに保管します。長期保存についてですが、インフルエンザウイルスの感染は細胞変性効果を引き起こし、細胞単層上に網目状の細胞領域またはプラークと呼ばれる円形の領域を形成します。本実験では、細胞をクリスタルバイオレットで染色することでプラークを可視化しました。500 µLの希釈ウイルスストックを細胞に接種したため、10⁻¹²倍希釈のウェルにおいて65個のプラークがカウントされました。

本実験における最終タイターは 1.3 × 10¹⁴ PFU/mL でした。ヘマグルチニン分析（赤血球凝集試験）は、インフルエンザウイルスが赤血球の表面に付着する能力に基づいたウイルスタイター測定法です。観察されたように、ウイルス懸濁液が赤血球を凝集させるため、赤血球が懸濁液から沈降するのを防ぎます。

ウイルスを2⁻¹⁰に希釈した50 µLにおいて、明らかに陰性の結果が観察されました。したがって、最終力価は2.1 × 10⁴ HAU/mLとなります。このビデオを視聴することで、鶏卵への接種によるインフルエンザウイルスの増殖方法と、ウイルスを含むアランティック液の回収方法について十分に理解できるはずです。