Грипп Вирус Распространение в куриные эмбрионы

Общая цель данной процедуры заключается в получении больших объемов вируса гриппа с высоким титром в экономически эффективной системе. Это достигается путем первоначального использования свежеоплодотворенных куриных яиц, свободных от патогенов сыворотки. На втором этапе в яйца инокулируют вирус гриппа через аллантоическую полость.

Затем в течение 48 часов собирают жидкость из аллантоиса, содержащую вирус, после чего вирус подвергают мгновенной заморозке в жидком азоте. В конечном итоге можно провести анализ по методу бляшек и анализ на гемагглютинин, чтобы определить влияние титра вируса в собранной аллантоической жидкости. Визуальная демонстрация этого метода имеет решающее значение, поскольку этапы сбора очень чувствительны и требуют осторожного обращения с яйцами и глубокого знания их анатомии.

Перед началом процедуры приобретите безпатогенные, свежеоплодотворенные куриные яйца у подходящего поставщика. Сразу после получения поместите яйца в увлажненный инкубатор с автоматическим поворотным устройством для регулярного вращения яиц при 37 °C и влажности от 55 до 60% в течение 10–11 дней. После семи–восьми дней инкубации, надев перчатки, продезинфицированные 70% этанолом.

Протрите яйцесветильник этанолом и перенесите яйца из инкубатора в пустые лотки для яиц. Затем выключите свет и поочередно прикладывайте тупой конец каждого яйца к светильнику. Если яйцо оплодотворено, должны быть четко видны тонкие кровеносные сосуды, ведущие к эмбриону бобовидной формы.

Если яйцо неоплодотворенное, будет наблюдаться небольшое кровянистое пятно с видимым желтком. В таком случае неоплодотворенные яйца следует утилизировать, а жизнеспособные вернуть в инкубатор. Если статус яйца не может быть подтвержден, пометьте его для последующего наблюдения на 10-й или 11-й день после оплодотворения. Непосредственно перед использованием разведите стоковый раствор вируса гриппа А до концентрации 10³–10⁴ PFU/mL в стерильном PBS с добавлением HEPES и поместите его на лед.

Затем снова проведите просвечивание каждого яйца и удалите все погибшие неподвижные эмбрионы. После этого извлеките три яйца из инкубатора и поместите их в отдельный держатель. Расположив яйца воздушной камерой вверх, отметьте границы воздушной камеры перманентным маркером.

Затем промойте область над воздушной камерой 70% ethanol и, находясь в боксе биологической безопасности уровня BSL-2, перенесите яйца воздушной камерой вверх в лоток для яиц. Теперь с помощью стерильной иглы 18 gauge проколите небольшое отверстие в скорлупе над воздушным мешком каждого яйца. Будьте осторожны и не вводите иглу слишком глубоко, чтобы не повредить эмбрион или желток.

Затем наберите разведенный вирус гриппа в стерильный шприц объемом один миллилитр. Установите иглу калибра 22 G и осторожно введите её под углом 45 градусов в аллантоическую полость первого яйца. Введите 0.2 миллилитров разведенного вируса в яйцо, и после инъекции в два других яйца утилизируйте шприц и иглу, а каждое отверстие запечатайте каплей клея из клеевого пистолета.

Убедитесь, что клей не попал внутрь яйца, после чего поместите яйца обратно в инкубатор. Когда все яйца будут инокулированы, инкубируйте инфицированные яйца при 37 °C и 60% влажности без переворота в течение оптимального времени инкубации, которое зависит от типа вируса гриппа.

По окончании периода инкубации охладите яйца в течение минимум четырех часов при температуре 4 °C, чтобы уничтожить эмбрион и вызвать сужение кровеносных сосудов. После достаточного охлаждения яиц перенесите их в бокс биологической безопасности в жесткий держатель и очистите поверхность яиц 70% ethanol.

Затем с помощью стерильных ножниц аккуратно раскройте скорлупу первого яйца над воздушным пузырем. Удалите скорлупу вокруг воздушного пузыря, стараясь не повредить хориоаллантоическую оболочку.

Затем с помощью стерильного тупого пинцета вскройте хориоаллантоическую оболочку и осторожно отодвиньте эмбрион и желточный мешок с помощью небольшого шпателя или ложки, стараясь не повредить желток. Затем, используя одномиллилитровую пипетку, аккуратно соберите аллантоическую жидкость, при необходимости наклоняя яйцо набок, чтобы собрать как можно больше жидкости. При сборе из каждого яйца должно быть получено от 5 до 10 мл слегка желтоватой жидкости.

Соберите жидкость Аллана-Тоика в пластиковые конические пробирки объемом 50 миллилитров на льду. После сбора всей жидкости центрифугируйте пробу для осаждения вируса и перенесите прозрачную надосадочную жидкость в новую пробирку объемом 50 миллилитров на лед. В завершение утилизируйте яйца в контейнер для отходов уровня биобезопасности BSL-2 и немедленно приступите к работе с осветленной жидкостью Аллана-Тоика.

Затем быстро заморозьте вирус в жидком азоте и поместите замороженные пробирки в морозильную камеру при температуре -80 °C. При длительном хранении инфекция вирусом гриппа вызывает цитопатический эффект, который приводит к образованию на монослое клеток круговых зон из поврежденных клеток или бляшек. В данном эксперименте бляшки визуализировали путем окрашивания клеток кристаллическим фиолетовым; в лунке с разведением вируса 1 × 10⁻¹² было подсчитано 65 бляшек, так как на клетки было нанесено 500 µL разведенного вирусного стока.

В данном эксперименте конечный титр составил 1,3 × 10¹⁴ PFU/мл. Тест на гемагглютинацию представляет собой метод определения титра вируса гриппа, основанный на способности вируса прикрепляться к поверхности эритроцитов. Как было замечено, вирусная суспензия вызывает агглютинацию эритроцитов, препятствуя их осаждению из суспензии.

Четко отрицательный результат наблюдался при разведении вируса 2⁻¹⁰ в объеме 50 µL. Таким образом, конечный титр составляет 2,1 × 10⁴ HAU/mL. После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как размножать вирус гриппа путем инокуляции куриных яиц и сбора аллантоисной жидкости, содержащей вирус.